В Vivo Двухцветные 2-фотон-изображения генетически-tagged репортер ателье клетки в коже

Морфологические изменения происходят в иммунных чувствительных фибробластных клетках после активации и способствуют изменениям в клеточной вербовке. Использование 2-фотонной визуализации в сочетании с генетически модифицированным фибробластным белком 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed ^(TB/TB) линия мыши и зеленый флуоресцентно помеченный липополисахарид-FITC, мы можем проиллюстрировать весьма специфическое поглощение липополисахарида в дермальных фибробластах и морфологических изменениях in vivo.

Наш протокол позволяет нам визуализировать, как флуоресцентно помеченные клетки реагируют на воспалительный периферический стимул у живого животного в режиме реального времени. 2-Фотоновая визуализация позволяет визуализировать глубоко в ткани живого образца, сохраняя целостность их клеток и их микроокноронность и обеспечивая точное представление биологической системы. Дыхание перемещает лапу с течением времени, вызывая размытость и потерю фокусного самолета.

Не забудьте прикрепить лапу твердо лентой к стабильной поверхности перед изображением. В этом вы должны быть в состоянии найти соответствующую плоскость интереса, убедитесь, что цель близка к лапе, не касаясь и непосредственно над местом инъекции. Перед началом процедуры включите мульти-фотон систему и выберите 25X субъективный.

Поместите стереотаксисный аппарат на сцену мульти-фотона микроскопа и соедините аппарат с аппаратом доставки анестезии. Поместите кусок матовой черной бумаги на поверхность аппарата в качестве точки соединения для лапы мыши. Установите резонансный сканер с фиксированной областью сканирования 512 на 512 микрометров.

Настройте лазеры возбуждения на 930 и 1100 нанометровых волн возбуждения для зеленых и красных флуоресцентных белковых сигналов соответственно. Используйте дихроическое зеркало от 690 до 1 050 нанометров, чтобы направить световой путь обоих возбудимых лазеров к единственной цели, позволяющей 930 нанометровому настроенного лазера возбуждения быть отраженным к главному сканеру и 1100 нанометров настроенного лазера, чтобы пройти непосредственно в главный сканер. Затем установите лазерную мощность FITC до 5% и зеленый флуоресцентный белок до 20% и выключите накладные огни.

Для визуализации in vivo обезболивать мышь и излагать в текстовом протоколе. Подтвердите отсутствие реакции на щепотку носа в анестезированной мыши и поместите мышь в стереотаксисный аппарат с доступом к носовому конусу. Используйте черную ленту, чтобы прочно прикрепить заднюю лапу к куску черной бумаги на областях, как проксимальных, так и дистальных в области интереса, убедившись, что подошвенной поверхности лапы беспрепятственно и лицом к цели.

Поместите щедрое количество воды на основе смазки на подошве поверхности лапы. Прикоснитесь к цели смазки, чтобы создать столб жидкости между лапой и целью. Используйте FITC возбуждение света, чтобы сосредоточиться на кожный слой лапы, подтверждая, что тандем тусклый томат помечены фибробласты могут быть визуализированы.

Изображение области клеток, расположенных чуть ниже подошвеной поверхности задней лапы с помощью обоих лазеров. Приобрети 15-минутный промежуток времени от 5 до 10 срезов при примерно одном микрометре на срез, чтобы установить базовое представление окружающей среды. Когда базовая визуализация была получена, загрузите 25 микролитровый стеклянный шприц Гамильтона с пятью микрограммами конъюгированных липополисахаридов FITC, или LPS, на 20 микролитров PBS.

Администрирование раствора путем внутриплантационной инъекции в экспериментальную заднюю лапу, не нарушая положение лапы. Затем изображение области клеток, расположенных чуть ниже подошвеной поверхности задней лапы с помощью обоих лазеров. Приобрети промежуток времени от 60 до 120 минут, около 5-10 срезов при примерно одном микрометре на срез, чтобы определить интраплантарный поглощение клетки LPS FITC.

Поскольку нет присущей флуоресценции клеток в дермальный слой, множество клеток в дермальный слой задней лапы можно наблюдать принимая флуоресцентно помечены LPS после внутриплантационной инъекции в дикий тип мыши. После инъекции LPS FITC, только фибробласт конкретных белков один положительный фибробласты, выражают платные, как рецептор четыре связывают и поглощения вводили белок с высоким уровнем совместной локализации с тандемом димер томат теги, выраженные этими клетками. В отличие от этого, мышей, которые имеют потери, как рецептор четыре выбил из всего тела не связывают и поглощения LPS после инъекции.

Действительно, силуэты клеток видны после инъекции LPS FITC, указывающей на то, что препарат дисперсии в интерстициальной жидкости вокруг клеток, но на самом деле не связаны рецептором. Самое главное помнить в этом протоколе, чтобы убедиться, что лапа обездвижена так, что Есть никаких искажений в видео из-за движения или дыхания. Используя эту процедуру, набор флуоресцентно помеченных клеток в область после травмы и морфологические изменения в реакции клетки на стимул с течением времени могут быть отслеированы.

Таким образом, 2-фотонные изображения позволяют исследователям объединить генетических мышей-репортеров и флуоресцентно помеченных соединений, чтобы оценить, что происходит в живом животном после инъекции.