Культура, манипуляция и ортотопическая трансплантация органов опухолевых опухолей мышелового пузыря

Этот протокол предоставляет подробные экспериментальные шаги по созданию трехмерной культуры in vitro опухолевых органоидов мочевого пузыря, полученных от рака, индуцированного мочевого пузыря. Описаны культурные методы, включая пропускную связь, генную инженерию и ортотопическую трансплантацию опухолевых органоидов.

Опухолевые органоиды широко используются в качестве модели рака in vitro для изучения биологии опухолей. Наш протокол обеспечивает подробную процедуру изоляции, культуры и генетически манипулировать органоидами опухоли мочевого пузыря, выступающей в качестве важного инструмента для изучения различных аспектов в биологии рака. Используя наш протокол, мы можем генетически манипулировать органоидами опухоли мочевого пузыря, чтобы выразить или выбить ген нашего интереса.

Кроме того, с помощью нашего метода ортотопической трансплантации, мы можем создать нетронутую опухоль микроокноронии опухолевых органоидов. Демонстрацией процедуры будет юбин Ким, аспирант нашей лаборатории. Начните с установления органоидов опухоли мочевого пузыря из опухоли мочевого пузыря.

Добавьте один миллилитр 10 миллимолярной HEPES в DMEM к фрагментам опухоли и измельчите ткань стерилизованным лезвием бритвы. Чтобы разобщить фрагменты в клеточную суспензию, добавьте девять миллилитров DMEM с HEPES, коллагеназы типа один и два, и термолизин к опухолевым частям, и инкубировать их в течение 1,5 до двух часов при 37 градусах цельсия и 5%углекислого газа на орбитальном шейкере. После инкубации перенесите подвесную клетку в 50-миллилитровую трубку.

Центрифуга трубки в 400 раз г в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию и аспирировать супернатант. Resuspend гранулы в пять миллилитров ACK лизай буфера и инкубировать трубку при комнатной температуре в течение трех-пяти минут, чтобы вынизыть любые красные кровяные тельца. Между тем, пальто хорошо в 24-хорошо пластины с 150 микролитров ледяного фактора роста снижение мембранной матрицы подвала и поместите пластину в инкубатор в течение 30 минут.

Добавьте 20 миллилитров DMEM в трубку с клетками и повторите центрифугу. Аспирировать супернатант и повторно процедить гранулы в один миллилитр 0,25%трипсина ЭДТА и 10 микромолейных Y-27632 дигидрохлорида. Инкубировать трубку в течение пяти минут в 37 градусов по Цельсию водяной бане.

Затем нейтрализуем трипсин, добавив 10 миллилитров DMEM с 10%FBS. Фильтровать подвеску клетки через 100 микрометровый клеточный ситечко на новой 50-миллилитровой трубке для удаления непереваренного мусора. Центрифуга трубки в 400 раз г в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию и аспирировать супернатант.

Затем повторно посчитайте гранулы одним миллилитром DMEM и подсчитайте клетки с гемоцитометром. Перенесите три-четыре раза по 10 четырем опухолевым клеткам на микротрубки 1,5 миллилитров на льду и центрифуга в 400 раз г в течение трех минут при четырех градусах Цельсия. Тщательно удалите супернатант и повторно поместите клетки в 500 микролитров довоенной органоидной среды и 10 микромоляров Y-27632.

Перенесите подвесную оболочку в ранее подготовленную мембранную матрицу, покрытую хорошо, и поместите 24-хорошую пластину обратно в инкубатор. Замените среду каждые два дня 500 микролитров довоенной органоидной среды. Разделите органоиды опухоли за 12 часов до постивирусной опосредованной трансдукции.

На следующий день, быстро оттаивать вирус, содержащий aliquot в 37 градусов по Цельсию водяной бане. Добавьте оттаявный вирус в 250 микролитров органоидной среды с 10 микромоляными Y-27632 и восемью микрограммами на миллилитр бромистого гексадиметрина. Замените органоидную среду в 24-хорошо пластины с 500 микролитров вируса, содержащего средний и инкубировать пластины в течение 12 до 16 часов при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа.

Для подготовки органоидов опухоли мочевого пузыря для ортотопической трансплантации добавьте 500 микролитров коллагеназы в органоидную среду в 24-хорошо пластины. Pipette матрицы мембраны подвала и средних вверх и вниз, то инкубировать пластины в течение 20 минут при 37 градусов по Цельсию. После инкубации, собрать клетки в 15 миллилитров трубки и добавить пять миллилитров предварительной DMEM.

Затем центрифуга трубки в 400 раз g в течение трех минут при четырех градусах Цельсия и аспирировать супернатант. Переусердуйте гранулы с помощью одного миллилитра DMEM и перенесите раствор в 90-миллиметровую чашку Петри. Под микроскопом, забрать от 10 до 100 опухолевых органоидов с P200 пипетки и собирать их в микротрубки на льду.

Центрифугайте микротрубку и аккуратно удалите супернатант. Затем поддерживать гранулы на льду, пока мыши не будут готовы к операции. Перед пересадкой стенки субмукоза мочевого пузыря держите шприцы, наконечники пипеток и мембранную матрицу подвала на льду до готовности к использованию.

После того, как мышь была анестезирована, положите ее в положение на спине и поддерживайте анестезию путем вдыхания маски 2%vaporized isoflurane. Нанесите йод повидоне стерильной марлей и протрите его 70%этанолом. Сделайте небольшой поперечный разрез в коже и мышечной стенке нижней части живота средней линии с помощью стерильных хирургических ножниц.

Выставить мочевой пузырь из брюшной полости и поддержать его солевым пропитанным ватным тампоном. Повторное использование органоидных гранул в 80 микролитров органоидной среды, содержащей 50%-ную концентрацию мембранной матрицы, и впрыскивает суспензию в передний аспект купола мочевого пузыря с помощью инсулинового шприца. Закройте разрез 4-0 нейлоновым швом и дезинфицировать хирургическое отделение йодом повидона и 70%этанолом.

Позвольте мыши восстановиться под инфракрасным облучением в течение 10-15 минут. Затем снова следите за мышью, пока она не приходит в сознание. Опухолевые органоиды мышей были созданы и культуры в течение девяти дней.

Если опухолевые клетки не образуют органоиды опухоли, они потенциально были убиты во время шага диссоциации и время энзиматических пищеварения, возможно, потребуется настроить. Органоиды опухоли мочевого пузыря продемонстрировали сильные сигналы GFP с успешной лентивирусной инфекцией. После концентрации, в общей сложности 250 микролитров вируса, содержащего средства массовой информации было достаточно, чтобы заразить 30000 одиночных опухолевых клеток на мембранной матрице подвала и поддерживать от 90 до 100% эффективности инфекции.

Алографы опухоли мочевого пузыря были собраны через три недели после ортотопической трансплантации, а гистология опухоли была проанализирована с помощью окрашивания H и E. Ортопедические трансплантации опухолевых органоидов могут расти как опухоли мочевого пузыря в течение двух-трех недель. После этой процедуры, исследователи могут выполнять иммуногистохимии в результате опухолевых органоидов или провести количественные RT-PCR для генов, представляющих интерес.

Эти эксперименты могут еще больше охарактеризовать опухолевые органоиды. Наш протокол позволяет нам манипулировать генами в раковых клетках легко по сравнению с моделью мыши, сохраняя при этом виво характеристики опухолей для того, чтобы изучить конкретные функции различных генов, участвующих в tumorigenesis рака мочевого пузыря.