Открытие гематоэнцефалического барьера с помощью фокусированного ультразвука для воздействия на структуры головного мозга и оценки хемогенетической нейромодуляции

Этот протокол определяет шаги, необходимые для доставки гена через фокусированное ультразвуковое открытие гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), оценку результирующей экспрессии генов и измерение нейромодуляционной активности хемогенетических рецепторов с помощью гистологических тестов.

Наш протокол обеспечивает нацеливание сфокусированного ультразвука на мышей с субмиллиметровой точностью. Это позволяет нам нацеливаться на ультразвук с помощью недорогих 3D-печатных деталей без необходимости использования хирургического или МРТ-совместимого ультразвукового оборудования. Сфокусированное ультразвуковое воздействие на гематоэнцефалический барьер поначалу может быть довольно сложным.

Крайне важно, чтобы датчик был правильно соединен с животным с помощью дегазированного геля или воды и чтобы микропузырьки не схлопывались во время инъекции. Демонстрировать процедуру будет Ричард Ли, аспирант Калифорнийского технологического института. После подтверждения отсутствия реакции на педальный рефлекс у мыши, находящейся под наркозом, используйте 10 единиц на миллилитр гепаринизированного физиологического раствора для промывки чистого катетера 25-35 калибра и используйте этаноловую прокладку для дезинфекции хвоста животного.

Вставьте катетер в боковую хвостовую вену и с помощью тканевого клея закрепите катетер на месте. Если игла была установлена правильно, в катетере будет наблюдаться обратный поток крови. Когда клей высохнет, удалите шерсть на голове животного с помощью крема для депиляции и поместите мышь в напечатанную на 3D-принтере каретку для МРТ, установив передние зубы на прикусную планку так, чтобы голова находилась внутри носового конуса.

Прикрепите затупленные прутья к черепу с безопасным давлением и наблюдайте за дыханием в течение 30 секунд, чтобы убедиться, что животное дышит свободно со скоростью один вдох в секунду. Подключите направляющую для прицеливания к ушным планкам и еще раз проверьте дыхание. Поместите каретку МРТ в держатель МРТ и поместите держатель внутрь отверстия магнита.

Затем сделайте последовательность МРТ, чтобы локализовать мышь в сканере, используя быструю 3D-последовательность снимков под низким углом для визуализации всего мозга. Чтобы выполнить наведение под контролем МРТ, поместите каретку внутрь стереотаксического инструмента и с помощью металлического блока с двусторонним скотчем закрепите блок на месте к двум опорным стойкам стереотаксического инструмента. Перенесите изображения МРТ на компьютер с помощью работающей программы для наведения сфокусированного ультразвука и откройте изображения.

Когда все изображения будут загружены, щелкните правой кнопкой мыши и щелкните «Переформатировать», чтобы переформатировать изображение по трем осям. Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы локализовать датчик по круговой направляющей наведения. В сагиттальном виде отрегулируйте вертикальное положение виртуального преобразователя в соответствии с толщиной водяной бани и корпуса датчика.

Укажите в планировщике траектории области, на которые необходимо нацелиться, и запишите координаты в таблицу. Наберите желаемую глубину прицеливания и запишите координаты, как было показано ранее. Затем нажмите «Отправить траекторию» и выполните для наведения на каждую из точек.

Чтобы соотнести координаты МРТ со стереотаксической рамой, поместите специально установленный датчик над направляющей наведения и перемещайте до тех пор, пока каждый из трех болтов наведения не пройдет как через держатель датчика, так и через направляющую наведения. Убедитесь, что болты не находятся под напряжением или наклоном, и переместите датчик на 10,56 миллиметра вперед в передне-заднем направлении, пока датчик не окажется в точке, где на МРТ находится центр направляющей для наведения. Затем определите расстояние от центра виртуального преобразователя до целевой области и с помощью кадра переместите преобразователь в эти координаты.

Для приготовления раствора для инъекций в пробирку объемом 1,5 миллилитра загрузите 800 микролитров физиологического раствора и 100 микролитров контрастного вещества для МРТ. Затем доведите неактивированный раствор микропузырьков до комнатной температуры, прежде чем активировать микропузырьки в течение 45 секунд в устройстве для активации микропузырьков. После активации медленно загрузите 100 микролитров микропузырьков из середины раствора в одномиллилилитровый туберкулиновый шприц, оснащенный иглой 21 калибра, и добавьте 80 микролитров микропузырьков в раствор контрастного вещества.

Перемешайте приготовленный раствор, аккуратно перевернув 1,5-миллилитровую трубку на 15 секунд, чтобы избежать флотации. По окончании смешивания загрузите 200 микролитров раствора микропузырьков в шприц без иглы и переверните шприц. Нажмите и втяните поршень, чтобы перемешать, и прикрепите иглу 30 калибра к шприцу, пока он все еще перевернут.

Затем медленно выталкивать раствор микропузырьков до тех пор, пока на конце иглы не появятся капельки. Как только микропузырьки будут готовы, установите длительность импульса для инсонации на 10 миллисекунд, со 120 повторами каждую секунду, с давлением от 0,3 до 0,45 мегапаскаля на череп. Снимите направляющую для прицеливания и нанесите дегазированный ультразвуковой гель на голову мыши, стараясь не допустить появления пузырей.

Опустите преобразователь так, чтобы он оказался непосредственно на плоской части держателя амбушюра, и введите координаты в стереотаксические инструменты. Разбавьте интересующий интерес аденоассоциированный вирус в соотношении от 0,5 до 2 умножить на 10-10-ю вирусную частицу на грамм массы тела и загрузить вирусные частицы в одномиллилитровый шприц, оснащенный иглой 30 калибра. Введите раствор в катетер хвостовой вены и введите 80 микролитров раствора микропузырьков мыши.

Чтобы оценить открытие гематоэнцефалического барьера с помощью МРТ, запишите быструю последовательность снимков под низким углом, как показано на рисунке. Для стимуляции DREADD растворите N-оксид клозапина в стерильном физиологическом растворе в концентрации один миллиграмм на миллилитр и введите его внутрибрюшинно. Через 15–45 минут после родов начните записывать поведенческую активность животного.

Для анализа активации нейронов используйте ткани мозга. Следуя протоколу, как показано на рисунке, усиление сигнала Т1 может быть достигнуто в области гиппокампа и в других частях мозга. Как было замечено, иммуноокрашивание против mCherry приводит к более надежному обнаружению экспрессии DREADD В этой процедуре не забывайте обращаться с микропузырьками осторожно и следить за тем, чтобы животное оставалось стабильным во время МРТ визуализации и инсонации.