5,346 Views
•
13:25 min
•
May 15, 2021
DOI:
Общая цель этой процедуры, объясняется использование цисплатина в качестве нефротоксического агента у взрослых рыб зебры, анализируя воспаление, и гибель клеток в почечной ткани. Для достижения этой цели и взрослые рыбы зебры анестезируется и взвешивается, чтобы ввести в специфическую дозу цисплатина в брюшной полости. После мониторинга смертности, почки рассекают и клетки изолированы для цитометрии потока или фиксированной и вскрытой для анализа флуоресцентных АНАЛИЗ.
Следующие процедуры могут помочь ответить на ключевые вопросы в области почек с использованием нефротоксических эффектов цисплатина в качестве инструмента для разработки модели острой травмы почек и взрослых рыб-зебр. Эта модель может быть использована для исследования новых терапевтических целей в почечной защите, а также прояснить механизм регенерации в почках рыб зебры. Цисплатин является химиотерапевтическим агентом, используемым для лечения различных видов рака.
Однако, может легко накапливаться в почках, генерации клеточной смерти, воспаления, и уменьшить функцию почек. Эффект цисплатина зависит от дозы, так что вы можете снизить наше увеличение дозирования зависит от ваших целей. Методы, используемые здесь для анализа воспаления и клеточной смерти, не предназначены исключительно для распространения модели болезни.
Цитометрия потока у рыб-зебр может помочь прояснить воспалительные состояния животного в количественном выражении, в то время как в TUNEL мы говорим, может прояснить наличие poptosed клеток в физиологическом и патологическом контексте. Перед началом эксперимента подготовьте рабочий раствор цисплатина, разбавляя раствор бульона до 820 микрограммов на мил в 0,9% хлорида натрия. Затем обезболить другую рыбу зебры и высушить избыток воды на некоторых бумажных полотенец.
Взвешивайте рыбу, помещая их на весы, принимая к сведению вес. Сделайте расчеты, чтобы знать точный объем для инъекций. Для достижения дозы 120 микрограммов на грамм веса, используйте следующую формулу.
Разделите окончательную дозу на дозу рабочего раствора и преобразуй это число в микролитеры, умножая на 1000, чтобы получить объем 120 мкг цисплатина. Затем умножьте это число на вес рыбы, чтобы получить окончательный объем, который будет введен. Поместите рыбу на влажную губку, с маленькой чашкой, чтобы держать его.
С брюшной стороны вверх и заполнить инсулин шприц с расчетным объемом цисплатина. Вставьте иглу на брюшной средней линии под мелким углом, осторожно потянув брюшной стенки, чтобы избежать прокола внутренних органов. А потом впрыснуть раствор.
После инъекции поместите рыбу в бак, чтобы оправиться от анестезии, и ждать признаков восстановления, таких как плавание и соответствующие движения. Монитор для этого рыбы два раза в день в течение следующих дней. При такой дозе цисплатин вызывает около 30% смертности в первые 24 часа.
Усыпание рыбы и высушить избыток воды в бумажном полотенце. После удаления головы и внутренних органов, использовать вскрытия иглы, чтобы закрепить стенки тела. Найдите почку в спинной стенке рыбы и используйте типсы, чтобы отсоединить почку.
Поместите почку в шесть хорошо пластины с холодным раствором одного 1X PBS, 2%FBS и держать на льду. Затем возьмите ткань с некоторой жидкостью и передать его через 40 микрон-клеточный ситечко, и осторожно macerate ткани со шприцем поршень. Вымойте дважды с одним 1X PBS, 2%FBS.
И соберите клетки в соколиной трубке в 50 миль. Затем центрифуга в течение пяти минут при 400 Г.Осторожно пикап супернатант с пипеткой и отбросить его. Добавьте 500 микролитров холодного 1X PBS, чтобы повторно приостановить клетки и поместить их в пятимилю течь цитометрии трубки.
Держите их на льду. Возьмите 10 микролитров образца и смешайте его с 90 микролитров трипан-голубого цвета в трубке Эппендорфа. Добавьте 10 микролитров смеси в камеру Neobauer и подсчитайте клетки в микроскопе.
Возьмите клетки для чтения цитометром, а затем проанализировать результаты выбора населения ваших интересов. Для этой процедуры усытворяйте рыбу и удаляйте внутренние органы, оставляя почку прикрепленной к телу. Затем прикрепите стенки кузова к поверхности пробки и поместите ее на поэтапное решение фиксации.
Держите его на четыре градуса на ночь. На следующий день, вскрыть почку с тонкой типп. Старайтесь не нарушать его.
Поместите его в небольшую чашку Петри или Эппендорф трубку с 1X PBS для полоскания. Изменение PBS и подготовить 2%agarose для создания матрицы поддержки для почек, прежде чем они прочно процесса. Отбросьте все оставшиеся PBS и залить агарозу медленно.
Затем, положение почки с тонкой типсов для предотвращения его сложить. Пусть агароз затвердеет при комнатной температуре. После затвердевания агарозы используйте скальпель, чтобы разрезать агарозу вокруг почек, образуя мелкие кубики.
Поместите кубики агарозы в гистологическую кассету и отправьте их на гистологическую обработку для встраивания ткани в парафин. Парафин блоков, мы затем сократить в пять микрон толщиной разделов. Де-воск слайды и держать их в дистиллированной воде.
Подготовьте темную камеру инкубатора, положив мокрые бумажные полотенца на дно. Поместите слайды в темную камеру и добавьте протеиназу K для протеабилизации ткани. Инкубация в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия.
В то время как образцы инкубированы, подготовить смесь реакции TUNEL, добавив 50 микролитров ферментного раствора на 450 микролитров этикетки раствора. И держать защищены от света. Возьмите темную камеру и мыть ломтик дважды с одним 1X PBS.
Затем высушите слайды и на смеси реакции TUNEL. И инкубировать при 37 градусах Цельсия в течение двух часов. После инкубации, мыть эти слайды снова с одним 1X PBS.
И добавить DAPI для ядра счетчик окрашивания. Инкубация при комнатной температуре в течение пяти минут, защищенная от света. Промыть три раза с одним 1X PBS.
А потом, плесень слайды с анти-fade гидрофильной среде. Поместите крышку скольжения. И печать с лаком для ногтей.
Визуализуууу в образцах флуоресцентного микроскопа. На этом графике можно увидеть, что цисплатин имеет эффект реакции дозы на выживание рыб, по сравнению с контролем, введенным только с 0,9% хлорида натрия. Красная линия на этом графике представляет собой дозу 120 микрограмм на грамм, используемую в этом видео.
Эти дозы могут быть применены к мужчинам и женщинам, так как статистической разницы между ними обнаружено не было. Цитометрия потока позволяет количественно оценить различные клетки, присутствующие в ткани. Популяции гематопоэтических клеток идентифицируются в почках нескольких рыб по размеру или форварду рассеяния и детализации или рассеяния размеров.
Таким образом, можно разделить популяции в эритроцитах, лимфоцитах, гранулоцитах и гематопоэтических прекурсорах. Здесь текущая стратегия ворот, выбираюющая гранулоциты, синглеты и положительные клетки МПО, позволяет найти популяцию нейтрофилов в почках, отмеченных флуоресценцией экспрессии миелопероксидазы. В этом случае инъекция цисплатина индуцировала увеличение доли нейтрофилов, присутствующих в почках.
Анализ TUNEL позволяет обнаружить апоптотические клетки в ткани, наблюдая слайд ткани почки с помощью флуоресцентного микроскопа, можно увидеть апоптотический сигнал внутри ядер некоторых клеток, здесь, в красном цвете. Контрастные ядерного пятна в таком DAPI здесь в синем. Инъекции цисплатина увеличили присутствие апоптотических клеток в почках, которые можно количественно количественно вручную или с помощью программного обеспечения изображения.
В конце этого видео вы должны быть в состоянии знать, как вводить и корректировать дозу цисплатина, чтобы вызвать острую травму почек у взрослых рыб зебры. И как вскрыть почку для разных целей. Цитометрия потока является отличным инструментом, который поможет вам понять профиль различных типов клеток в зависимости от наличия линий трагенклава в вашей лаборатории.
Не забудьте рассмотреть цвет линий транспортеров, если вы хотите использовать антитела для обозначения всех своих типов клеток. Анализ TUNEL является простым инструментом, который позволяет нам обнаружить апоптотические клетки и ткани, и может быть проанализирован не только с помощью микроскопии, но и поток цитометрии. Помните, всегда используйте средства индивидуальной защиты в течение всей процедуры.
Этот протокол описывает процедуры, чтобы вызвать острую травму почек (AKI) у взрослых зебры с использованием цисплатина в качестве нефротоксического агента. Мы подробно шаги для оценки воспроизводимости техники и два метода для анализа воспаления и гибели клеток в почечной ткани, цитометрии потока и TUNEL, соответственно.
Read Article
Цитировать это СТАТЬЯ
Morales Fénero, C., Padovani, B. N., do Amaral, M. A., de Barros, G. J. B., de Oliveira, I. K. X., Hiyane, M. I., Camâra, N. O. S. Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (171), e61575, doi:10.3791/61575 (2021).
Copy