Острый мышь мозга нарезки для расследования спонтанной деятельности гиппокампа сети

Этот протокол описывает подготовку горизонтальных ломтиков гиппокампа-энториналальной коры (HEC) от мышей, проявляли спонтанную резковолную рябь. Фрагменты инкубируются в упрощенном интерфейсе удерживающей камеры, а записи выполняются в условиях погружения с быстротекущей искусственной спинномозговой жидкостью для содействия оксигенации тканей и спонтанному появлению сетевой активности.

Используя этот протокол, исследователи могут исследовать механизмы, лежащие в основе колебаний сети гиппокампа в острых препаратах среза мозга мыши. В этом препарате записи выполняются в погруженных условиях в срезах, генерирующих спонтанные колебания сети, что позволяет использовать фармакологические и оптогенетические методы, а также визуализировать записи отдельных клеток. Для транскардиальной перфузии, непосредственно перед извлечением мыши из изофлурановой камеры, заполните крышку чашки Петри тремя-пятью миллиметрами охлажденного раствора сахарозы, а дно чашки Петри заполните примерно одним сантиметром охлажденного раствора сахарозы.

Быстро перенесите мышь под наркозом на левую впитывающую подушечку и используйте три куска скотча для фиксации передних конечностей и хвоста. С помощью больших тканевых щипцов и хирургических ножниц наложите тент на кожу и сделайте продольный разрез от нижней части грудины до верхней части грудной клетки. Используйте щипцы, чтобы подтянуть грудину, и с помощью ножниц прорежьте диафрагму.

Используйте ножницы, чтобы разрезать грудную клетку с каждой стороны одним большим движением к точке, где передняя конечность встречается с телом, и используйте щипцы, чтобы расположить переднюю часть грудной клетки по направлению к голове. С помощью ножниц сделайте горизонтальный надрез, чтобы полностью удалить ребра, и используйте щипцы, чтобы удерживать сердце на месте, вводя перфузионную иглу 20-го калибра в левый желудочек. Когда игла будет на месте, с помощью небольших ножниц для препарирования сделайте разрез в правом предсердии и дайте крови вымыться из кровеносной системы.

Чтобы извлечь мозг, после обезглавливания с помощью небольших ножниц сделайте два боковых разреза через череп по направлению к средней линии в передней части черепа возле глаз и сделайте два дополнительных разреза с каждой стороны от основания черепа. Погрузите голову в стеклянную чашку Петри, и с помощью ножниц разрежьте по средней линии по всей длине черепа, при этом подтягивая ножницами вверх, чтобы свести к минимуму повреждение подлежащих тканей мозга. Используйте небольшие тканевые щипцы, чтобы крепко захватить каждую сторону черепа, и приподнять кость вверх и в сторону от мозга, чтобы открыть череп, как книгу.

Используя пальцы левой руки, чтобы держать лоскуты черепа открытыми, введите микрошпатель под мозг рядом с обонятельными луковицами и переверните мозг из черепа в сахарозу. Используйте микрошпатель, чтобы разрезать ствол мозга, и промойте мозг, чтобы удалить остатки крови, шерсти или тканей. С помощью большого шпателя перенесите мозг на стеклянную крышку чашки Петри, а с помощью половины обоюдоострого лезвия бритвы сделайте корональный надрез в самой передней части мозга, включая обонятельные луковицы.

Далее сделайте корональный надрез для удаления мозжечка, и нанесите на рампу агар цианоакрилатный клей. С помощью щипцов кратковременно высушите мозг на листе фильтровальной бумаги, прежде чем поместить ткань в клей на агаровой рампе вентральной стороной вниз. Поместите платформу для нарезки в камеру для нарезки микротома и полностью покройте установку охлажденным раствором сахарозы.

С помощью большого шпателя внесите в камеру немного сахарозной суспензии, растапливая замерзшую сахарозу и быстро снижая температуру смеси до одного-двух градусов по Цельсию. Нарежьте ломтики толщиной до 450 микрон со скоростью нарезки 0,07 миллиметра в секунду. По мере того, как каждый срез освобождается, используйте щипцы из небольших тканей и острый скальпель, чтобы разделить два полушария, и отрежьте ткань до тех пор, пока срез не будет состоять в основном из гиппокампа и перигиппокампа.

С помощью пластиковой переводной пипетки срезы по отдельности переносят в камеру восстановления интерфейса, содержащую нагретый аCSF. При этом срезы расположены на границе между аКСФ и воздухом, и только тонкий мениск ФКСЖ покрывает срезы. Когда все ломтики будут собраны, плотно закройте камеру, чтобы они могли восстановиться при температуре 32 градуса Цельсия в течение 30 минут.

В конце восстановительного периода поместите камеру на мешалку, установленную на медленную скорость, чтобы способствовать циркуляции ХКБ внутри камеры. Чтобы записать локальные полевые потенциалы, наполните стакан объемом 400 миллилитров карбоген-пузырьковым аксф и поместите один конец трубки насоса в стакан. Включите перистальтический насос со скоростью от 8 до 10 миллилитров в минуту, чтобы направить aCSF из стакана объемом 400 миллилитров в нагретый резервуар, а из резервуара в камеру регистрации при температуре 32 градуса Цельсия.

Далее кратковременно зажимаем трубку и выключаем насос, чтобы приостановить подачу. С помощью тонких щипцов перенесите срез мозговой ткани в записывающую камеру за угол линзовой бумаги, на которой лежит ткань, срежьте вниз. Снимите с линзовой бумаги, оставив срез в камере звукозаписи, и закрепите его с помощью арфи.

С помощью ручного микроманипулятора медленно продвигайте кончик пипетки для стимуляции, наполненной хлоридом натрия, на поверхность среза под углом от 30 до 45 градусов, затем используйте второй микроманипулятор для медленного продвижения кончика пипетки с потенциалом локального поля, заполненной aCSf, в интересующую область под углом от 30 до 45 градусов. и записать потенциал локального поля образца в соответствии со стандартными протоколами. На этом рисунке можно наблюдать репрезентативные записи из энторинальных срезов коры гиппокампа, подготовленные в соответствии с протоколом, как показано на рисунке. В здоровых срезах электрическая стимуляция должна производить полевой постсинаптический потенциал с малым залпом пресинаптических волокон и большой постсинаптический потенциал с быстрым начальным снижением.

Спонтанная островолновая рябь также должна быть видна как положительные отклонения в потенциале локального поля в пирамидальном слое. В субоптимальных срезах постсинаптические потенциалы вызванного поля демонстрируют большой залп волокон и относительно небольшой постсинаптический потенциал, и такие срезы не демонстрируют спонтанной островолновой ряби. Островолновая рябь in vitro демонстрирует положительный полевой потенциал в слое пирамидального слоя с наложением высокочастотных колебаний в паре с отрицательным потенциалом поля в слое лучистого слоя.

Как показано на рисунке, островолновая рябь в срезах энторинальной коры гиппокампа возникает в рекуррентных цепях CA2/CA3 и распространяется на CA1. Очень важно добавлять карбоген в растворы пузырьками на протяжении всей процедуры, чтобы убедиться, что раствор сахарозы охлажден, и выполнять каждый шаг как можно быстрее. После подготовки этих срезов могут быть выполнены внеклеточные или внутриклеточные записи, а также оптогенетические или фармакологические эксперименты, чтобы определить, как различные типы клеток влияют на функцию нейронных сетей.