Вскрытие и живая визуализация поздней эмбриональной гонады дрозофилы

Динамику клеток легче всего понять с помощью визуализации в реальном времени. Этот протокол позволяет визуализировать в реальном времени стадию развития гонадогенеза, которая ранее была недоступна для визуализации. Тонкие рассечения, необходимые для выделения гонады, требуют тонких и точных манипуляций при большом увеличении.

Только визуальная демонстрация может передать, как выполнять каждый шаг. Новичок в этой технике может столкнуться с трудностями при быстром расчете времени и тонких манипуляциях с тканями, необходимых на определенных этапах. Мы рекомендуем отрабатывать разделы этого протокола отдельно во время обучения.

Начните с того, что разрежьте защитный лист размером 22 на 22 миллиметра на четыре полоски одинакового размера с помощью ножа с алмазным наконечником. Возьмите одну полоску с помощью щипцов, и распределите по 30 микролитров раствора гептанового клея с обеих сторон полоски. Наклоняйте полосу под разными углами, чтобы получить ровный слой остатков клея по мере испарения гептана.

Храните полосу в пустой коробке для крышки. Установите наклонное, но вертикальное положение, чтобы свести к минимуму контакт с коробкой и сохранить ее липкость. Затем закройте коробку.

Перенесите возрастные дехорионированные эмбрионы в маленькое стекло для часов, наполненное от 500 до 750 микролитров гептана. Втяните эмбрионы в узкую часть микропипетки и медленно соберите их возле внутреннего кончика пипетки, прежде чем аккуратно направить пипеткой на предметное стекло. Скрутите уголок салфетки в тонкий кончик и удалите гептан из эмбрионов на предметном стекле, чтобы их было легче захватить на покрытой клеем полоске.

Возьмите покрытую клеем полоску с помощью щипцов и аккуратно прикоснитесь ею к эмбрионам. Поместите полоску в чашку для визуализации, сразу за пределами центра, покрытого поли-D-лизином, стороной эмбриона вверх. Прижмите полоску, привязанную к блюду, чтобы убедиться, что она зафиксирована на месте.

Немедленно залейте посуду от двух до 3,5 миллилитров раствора Рингера, чтобы погрузить эмбрионы и предотвратить их высыхание. Во время рассечения остатки тканей могут прилипнуть к игле для препарирования. Чтобы избавиться от этого мусора, периодически поднимайте иглу чуть выше поверхности раствора Рингера.

Выберите эмбрионы стадии 16 с тремя сужениями кишечника, которые создают четыре сложенных сегмента кишечника. Чтобы начать девителлинизацию, прокалывайте выбранный эмбрион на переднем конце вольфрамовой иглой и отслаивайте вителлиновую мембрану от эмбриона. Проведите иглу через зародыш в области, удаленной от половых желез, и перенесите зародыш в покрытую полилизином область покровного стекла.

Перетащите его на дно, пока он не прилипнет. Точно так же расположите все девителлинизированные эмбрионы в ряд вдоль верхней части покровного стекла, оставив много места внизу. Зародыш должен быть обнажен изнутри и прорезать зародыш от его центра, перемещая иглу кзади между половыми железами.

Вытащите немного внутренней ткани, чтобы открыть гонаду и позволить ей прилипнуть к покровному листу. С помощью иглы разрежьте кусочек ткани, в том числе и половую железу, и отделите ее от оставшейся тушки. Затем натяните эту салфетку на свежий участок покрытой покровной листкой, чтобы приклеить ее к блюду.

Удалите как можно больше окружающей ткани из гонады, осторожно удаляя постороннюю ткань и приклеивая гонаду к свежему липкому участку посуды. Следите за тем, чтобы не прикасаться к удочку напрямую, чтобы не повредить ее. После вскрытия добавьте регистрационные метки на внешнюю сторону чашки для препарирования, чтобы позже помочь найти гонады в конфокальном микроскопе.

Снимите покрытую клеем полоску с посуды, осторожно вставив нижний зубец пары щипцов под полоску, обхватив щипцы, а затем наклонив полоску вверх, чтобы освободить ее от посуды, сводя к минимуму нарушение прилипших половых желез. Поместите чашку для визуализации в держатель предметного стекла с помощью регистрационных меток, чтобы поместить чашку в ту же приблизительную ориентацию, что и при вскрытии. Используйте светлопольную микроскопию и объектив с более низким энергопотреблением, чтобы идентифицировать и сфокусироваться на любом кусочке ткани, прилипшем к покровному листу.

Переключите настройки IP, чтобы показать флуоресценцию, и используйте бинокулярные окуляры для системного сканирования чашки, отмечая положение каждой гонады в программном обеспечении для визуализации. Аккуратно снимите весь держатель сцены в сборе, не опуская в нее чашку для визуализации, и поместите ее на рабочий стол. Удалите часть раствора Ringer с помощью микропипетки P1000 с внутреннего верхнего выступа чашки для визуализации.

Затем удалите примерно от 50 до 100 микролитров раствора из-под поверхности с помощью микропипетки P200, следя за тем, чтобы не удалить весь раствор. Добавьте примерно 200 микролитров среды для визуализации, содержащей инсулин, под поверхность оставшегося раствора Рингера. Добавьте в чашку оставшиеся носители изображений, начиная с крайнего края верхнего выступа.

Во время пипетирования двигайтесь к центральному куполу жидкости и в конечном итоге объедините трубку, проведя наконечником пипетки по обоим направлениям. Переключите микроскоп на объектив с более высокой мощностью и нанесите соответствующую иммерсионную жидкость. Затем замените держатель ступени в сборе.

Отрегулируйте фокус на отмеченное положение гонады и начните снимок. При визуализации изолированной гонады в светлом поле на конфокальном микроскопе видна темная тень, окружающая периферию гонады, которая является внеклеточным матриксом, поддерживающим целостность гонад во время визуализации. Здесь показан пример здоровой хорошо культивируемой гонады, экспрессирующей меченые и соматические гонадные клетки и маркеры гистонов.

Если гонады недостаточно увлажнены во время визуализации, ткань сморщивается. Гонада, внеклеточный матрикс которой поврежден во время диссекции, имеет нарушенную границу, что проявляется в наличии специфических для гонады клеток за пределами гонады. Перед уплотнением формирующаяся ниша стволовых клеток в культивируемой гонаде X-VIVO первоначально выглядит как рыхлый агрегат соматических клеток в передней части гонады.

Клетки ниши окружены стволовыми клетками зародышевой линии. Агрегат ниши изначально имеет неровную границу. В ходе визуализации отдельные ячейки ниши меняют свое положение таким образом, что агрегат ниши приобретает более гладкие границы, что приводит к уменьшению площади ниши.

При использовании этого протокола важно работать быстро при переносе эмбрионов в посуду с покрытием и быть деликатным при рассечении гонады вдали от окружающих тканей. Культуру X-VIVO можно сочетать как с генетическими, так и с фармакологическими манипуляциями, что позволяет использовать многогранные подходы к исследованию событий, происходящих во время мужского или женского гонадогенеза. Эта методика позволила нам визуализировать, как ниша стволовых клеток приобретает свою окончательную архитектуру.

Следовательно, теперь мы можем формировать и проверять гипотезы о динамике клетки, которая управляет ее морфогенезом.