Применение иммобилизации тканей дрозофилы с сгустками Фибрина для живой визуализации

В этом протоколе описывалась иммобилизация образца с помощью фибриновых сгустков. Образцы переносят в каплю фибриногенсодержащей питательной среды на поверхность покровного стекла, после чего вызывают полимеризацию добавлением тромбина. Под микроскопом для вскрытия с помощью кисти перенесите личинки L3 в девятилуночную чашку из боросиликатного стекла, содержащую PBS.

Перемешивайте, чтобы отделить большую часть корма от мух от личинок, и переложите его в другую лунку, содержащую питательную среду. С помощью щипцов захватите личинку по всему ее диаметру в середине длины ее тела и перенесите ее в другую лунку боросиликатной пластины, содержащую 200 микролитров свежей питательной среды. Не выпускайте личинку.

Чтобы разрезать личинку пополам по всему ее диаметру, либо измельчите захваченный участок боковым движением кончиков щипцов, либо просуньте один кончик другой пары щипцов между двумя кончиками щипцов, удерживающими личинку. Используйте щипцы, чтобы удерживать личинку за кутикулу, и еще одну пару щипцов, чтобы отделить кутикулу, не натягивая мозг. Повторяйте это до тех пор, пока не станут видны нервы, идущие из мозга, и не будут доступны органы, соединяющие мозг с ротовыми частями.

Удерживая щипцами нервы, идущие от мозга, разрежьте связь между мозгом и ротовыми частями другой парой щипцов, отделив мозг от остальной части кутикулы. Удерживайте мозг за аксоны, выходящие из вентрального нервного канатика, и выщипывайте окружающие органы, мягко оттягивая их от мозга. Затем захватите соединение между глазными имагинальными дисками и мозгом с помощью другой пары щипцов и разрежьте это соединение, не натягивая мозг.

Убедитесь, что мозг надлежащим образом очищен от других тканей и не поврежден. Отбраковывайте мозг, если на нем проявляются признаки повреждения. Пипетируйте покрывающий раствор с помощью P20 внутрь и наружу, чтобы покрыть кончик пипетки, затем аспирируйте мозг с покрытым кончиком вместе с тремя микролитрами среды и выведите его в другую лунку, содержащую 200 микролитров чистой питательной среды.

Повторяйте этот процесс до тех пор, пока не будет препарировано достаточное количество мозгов, время от времени заменяя питательную среду лунки, в которой проводится вскрытие. С помощью пипетки P20 с покрытым наконечником перенесите расчлененные мозги в другую лунку боросиликатной пластины, содержащую 200 микролитров питательной среды и фибриноген. Аспирируйте один мозг вместе с девятью микролитрами питательной среды и фибриногеном.

Когда конец наконечника почти касается дна покровного стекла чашки для клеточной культуры, выведите пипетку из нее так, чтобы питательная среда коснулась защитного стекла сразу после выхода из наконечника пипетки. Используйте один кончик щипцов или закрытую пару щипцов, чтобы мягко надавить и расположить мозг в питательной среде и каплях фибриногена. Если необходимо визуализировать вентральную часть мозга, индуцируйте свертывание фибриногена, чтобы правильно сориентировать мозг внутри тромба.

Надавите на мозг в одну сторону от капли. Коснитесь кончиком пипетки края капли на противоположной стороне мозга и добавьте один микролитр тромбина. Подождите одну-две минуты, пока фибриноген начнет полимеризуться, в результате чего на одной стороне капли образуется мутный осадок, затем аккуратно надавите и заправьте мозг в фибриновый сгусток, следя за тем, чтобы вентральная сторона находилась как можно ближе к покровному сгустку, не деформируя мозг.

Выведите пипеткой один микролитр раствора тромбина ближе к той стороне мозга, которая не заправлена в фибриновый сгусток. Подождите две-три минуты, пока второй фибриновый сгусток схватится, затем надавите на края сгустка, чтобы он сильнее прилип к покровному сгустку, стараясь не деформировать мозг. Если мозг кажется слишком далеким от покровного сгустка, приблизьте его, прижав фибриновый сгусток ближе к мозгу.

Чтобы вызвать фибриновый сгусток для визуализации дорсальной части мозга, расположите мозг в центре капли, дорсальной частью к покровному стеблю. С помощью пипетки P2 коснитесь кончиком пипетки края капли на противоположной стороне мозга и выведите из пипетки один микролитр тромбина. Подождите две-три минуты, пока фибриноген начнет полимеризуться, в результате чего образуется мутный волокнистый осадок, затем надавите на края сгустка, чтобы он сильнее прилегал к покровному слипу, стараясь не деформировать мозг.

Расположив конец наконечника примерно на 0,5 сантиметра над сгустком, аккуратно капните 390 микролитров питательной среды без фибриногена на верхнюю часть сгустка. Не добавляйте питательную среду по бокам сгустка, так как это может отсоединить его от покровного стекла. Чтобы вымыть излишки тромбина, удалите из чашки 300 микролитров, затем добавьте 300 микролитров чистой питательной среды, следя за тем, чтобы сгустки оставались полностью погруженными.

Чтобы изменения температуры не приводили к изменению концентрации, поддерживайте температуру раствора с реагентами при той же температуре, что и в чашке для культивирования. Снимите крышку посуды для культуры, не смещая саму посуду. Для более легкого снятия перед визуализацией поместите крышку 35-миллиметровой тарелки вверх ногами вверх

Расположите наконечник пипетки P1000 близко к поверхности среды внутри чашки для культивирования и осторожно выпустите на него достаточное количество раствора реагента, не создавая сильных потоков, которые могли бы отделить сгустки. Чтобы гомогенизировать раствор в чашке для культивирования, с помощью пипетки P200 медленно втягивайте и выводите небольшое количество раствора пять раз. Установите на место крышку, не смещая чашку для культивирования, и возобновите визуализацию.

Когда один NAPP1 был добавлен в иммобилизованный фибрин мозг личинок, экспрессирующих GFP-меченую базуку, мозги, несущие аналоговую чувствительную мутацию aPKC, демонстрировали сокращение нейронного эпителия, а также яркие кластеры Baz в нейробластах и их потомстве. Нейробласт продолжал делиться на протяжении всего таймлапса, что указывает на то, что ткань оставалась здоровой. И мозг показал небольшой дрейф, несмотря на изменение среды культуры.

Аналогичным образом, применение одного NAPP1 к яичникам, экспрессирующим GFP-меченую базуку, индуцировало сокращение аналоговых чувствительных мутантных фолликулярных клеток aPKC, но не контрольной группы. Гиперстек, отображающий как боковой, так и сфокусированный дрейф, сначала был скорректирован на боковой дрейф, а затем на дрейф фокуса, что привело к значительному уменьшению движений, наблюдаемых в исходном гиперстеке. При использовании этого протокола важно заправить мозг в частично полимеризованный фибриновый сгусток, пока сгусток еще податливый, но достаточно твердый, чтобы стабильно удерживать мозг.

Поэкспериментируйте с манипуляциями с пустыми сгустками и осторожно прощупайте сгусток во время его полимеризации, чтобы проверить, насколько он прочный.