Один анализ культуры миофибры для оценки функциональности взрослых мышечных стволовых клеток Ex Vivo

В этом протоколе описан метод культивирования и функционального анализа мышечных стволовых клеток in vitro, который сохраняет большую часть их взаимодействий с их эндогенной нишей.

Мышечные стволовые клетки остаются связанными с их эндогенной нишей и могут легко манипулироваться, например, посредством трансфекции siRNA. Этот метод позволяет анализировать мышечные стволовые клетки в культуре в условиях, которые больше напоминают ситуацию in-vivo, чем стандартные модели 2D-культуры, сохраняя нишу. Начните с резки стерильных пастерных пипеток алмазной ручкой.

Для каждой мыши используют одну большую отверстие пипетки с отверстием около 0,3 сантиметра и длиной от 10 до 12 сантиметров и вторую стеклянную пипетку с небольшим отверстием около 0,1 сантиметра и длиной примерно 22 сантиметра. Сглаживание краев обеих пипеток путем удержания кончиков пипеток в пламени горелки Бунзена в течение пяти-10 секунд плавным движением. Непосредственно перед использованием покройте обе пипетки стерильной конской сывороткой, заполнив всю пипетку 2 миллилитрами лошадиной сыворотки в течение пяти минут, затем введя конскую сыворотку и дав пипеткам высохнуть в течение пяти минут при комнатной температуре.

Опрыскивайте все оборудование и задние конечности мыши 70% этанолом. Используйте затвердевшие тонкие изогнутые ножницы и тонкие щипцы, чтобы удалить кожу и обнажить подлежащие мышцы. Удалите окружающие фасции тонкими изогнутыми щипцами, не повреждая нижележащие мышцы.

Чтобы удалить переднюю или ТА большеберцовую кость, захватите дистальное сухожилие ТА щипцами и срежьте его мелкими ножницами. Удерживая ТА на сухожилии, потяните его к колену и разрежьте мышцу близко к колену, чтобы обнажить мышцу EDL. Поднимите дистальное сухожилие EDL изогнутыми щипцами и вырежьте тонкими пружинными ножницами Vannas.

Обнажите проксимальное сухожилие EDL, осторожно потянув EDL к колену. Затем ножницами разрезают проксимальное сухожилие. Инкубируйте мышцы EDL в реакционной трубке при 37 градусах Цельсия на циркулирующей водяной бане.

Остановите пищеварение, когда мышцы ослабнут и видны волокна одной мили. Работая под стерильным бинокулярным микроскопом, оснащенным нагревательной пластиной, промывали мышцы теплой изоляционной средой с помощью пипетки с большим отверстием. Диссоциируйте мышцы с помощью пипетки с большим отверстием до тех пор, пока желаемое количество миофиберов не будет свободно плавать в растворе.

Чтобы промыть мусор, используйте стеклянную пипетку с небольшим отверстием, чтобы перенести незаконтрактованные миофибры во вторую скважину, заполненную изоляционной средой. Затем переложите от 50 до 100 незаконтрактованных миофибров в одну лунку из 24 лунок, заполненных питательной средой миофибры. Инкубируйте миофибры при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 72-96 часов.

Трансфектировать мышечные стволовые клетки, связанные с миофибром, через четыре часа после выделения миофибры. Объединить 25 микролитров Opti-MEM с соответствующим объемом siRNA с 25 микролитрами Opti-MEM, содержащими 1,5 микролитра трансфекционного реагента. Инкубируйте реакционную смесь в течение пяти минут и добавьте ее в ячейки в 24-луночной пластине.

Затем высиживают пластину при 37 градусах Цельсия с уважением ко времени. Здесь демонстрируются только критические этапы протокола иммунофлуоресцентного окрашивания. Осторожно выбросьте питательную среду миофибры, оставив раствор в лунке.

Добавьте 500 микролитров 2% параформальдегида, чтобы зафиксировать миофибры соседними мышечными стволовыми клетками. Инкубировать пластину в течение пяти минут при комнатной температуре. Осторожно удалите супернатант и трижды вымойте миофибры PBS.

Накрывайте пластину фольгой на этапах инкубации после инкубации вторичными антителами. Используйте гидрофобную ручку, чтобы нарисовать круг на микроскопическом стеклянном предметном стекле. Затем переложите миофибры в минимально возможном объеме на горку и рассейте их.

Удалите остаточную жидкость с помощью пастерной пипетки с небольшим отверстием или пипетки объемом 200 микролитров. Используйте две капли водной монтажной среды и накройте миофибры крышкой. Затем дайте слайдам высохнуть и храните их при четырех градусах Цельсия в темноте с последующим микроскопическим анализом.

Этот протокол демонстрирует выведение и культивирование одиночных миофиберов из мышиных мышц EDL. Иммунофлуоресцентное окрашивание для Pax7 использовалось для идентификации ядер мышечных стволовых клеток. Увеличенная область обнажает миофибру с прилегающей к нему мышечной стволовой клеткой и демонстрирует сигнал иммунофлуоресценции PAX7 в ядре мышечной стволовой клетки.

Миогенная прогрессия мышечных стволовых клеток может быть проанализирована по экспрессии маркеров. Наличие Pax7 и отсутствие экспрессии MyoD связано с покоящимися мышечными стволовыми клетками свежеизолированных миофиберов. Экспрессия MyoD может наблюдаться в пролиферирующих мышечных стволовых клетках.

Через 72 часа мышечные стволовые клетки образуют скопления потомств с различными миогенными состояниями, что сопровождается экспрессией различных миогенных маркеров. Только клетки Pax7 являются самообновляющимися стволовыми клетками. Pax7 и MyoD двойные положительные клетки размножаются.

В то время как только клетки myo D являются дифференцирующими клетками. Трансфекция siRNA мышечных стволовых клеток показала накопление цитоплазматической siRNA гранулярным способом, что указывает на эффективное поглощение. Количественная оценка трансфектированных Pax7-положительных клеток на миофибру показала, что количество трансфектированных клеток увеличилось до 74% через 30 часов без какого-либо неблагоприятного влияния на количество мышечных стволовых клеток.

При попытке этого протокола крайне важно тщательно проанализировать EDL, не причиняя никакого ущерба. Помимо трансфекции siRNA, возможен анализ трансгенных животных или инкубация с рекомбинантными белками для дальнейшего функционального анализа мышечных стволовых клеток на соседних с ними миофибрах.