Осмотическая помповая доставка лекарств для исследований in vivo Remyelination в центральной нервной системе

Демиелинизация происходит при множественных заболеваниях центральной нервной системы. Надежная техника доставки лекарств in vivo необходима для повторного тестирования лекарств. Этот протокол описывает метод на основе осмотического насоса, который позволяет осуществлять долгосрочную доставку препарата непосредственно в паренхиму головного мозга и улучшает биодоступность препарата, с широким применением в исследованиях ремиелинизации.

Осмотическая помпа имеет большое значение для исследований регенерации миелина, особенно для препаратов с коротким периодом полувыведения, плохой проницаемостью гематоэнцефалического барьера и различными периферическими побочными эффектами. Осмотический насос может обходить гематоэнцефалический барьер и доставлять препараты непосредственно в мозолистое тело, что эффективно улучшает биодоступность лекарств, особенно для некоторых препаратов с коротким периодом полувыведения. Для начала закрепите голову анестезированной мыши в стереотаксическом аппарате зубной перекладиной и ушными вкладышами.

Накройте тело животного, за исключением места операции. Используя скальпель, сделайте сантиметровый средний сагиттальный разрез кожи от основания шеи до промежутка между глазами, чтобы обнажить череп. Используя ватный тампон, содержащий 30% перекиси водорода, аккуратно протрите поверхность черепа, чтобы визуализировать черепные структуры.

Отрегулируйте высоту зубчатой перекладины и ушных вкладышей, чтобы поместить лямбда-точку и точку брегмы на одну высоту. Осторожно поместите наконечник иглы шприца 10 микролитра и 33 калибра в точку брегмы и сбросьте координаты X, Y и Z до нуля. Переместите шприц к месту инъекции.

Медленно просверлите небольшое отверстие для заусенцев через череп в месте инъекции, не проникая в твердую мозговую оболочку с помощью одного микролитра 26 калибра и иглы шприца 0,45 миллиметра. Медленно вставляйте микролитровую иглу шприца в ткани мозга через отверстие до тех пор, пока не будет достигнута определенная глубина. Вводят 1,5 микролитра 1% лизолецитина со скоростью 0,5 микролитра в минуту.

Подождите пять минут, прежде чем вытащить шприц, и сшьют кожу 5-0 хирургическими швами. Поместите мышь, которая перенесла операцию, в клетку и ежедневно следите за мышью после операции. Прикрепите три прокладки для регулировки глубины к игле канюли для инфузии мозга с тканевым клеем для достижения глубины инъекции 1,5 миллиметра, которая близка к мозолистой.

Заполните осмотический насос, прикрепив иглу шприца с пакетом насоса к одномилитровому шприцу, и аспирируйте препарат. Удерживайте насос в вертикальном положении. Вставьте шприц в отверстие в верхней части насоса и медленно вводите препарат, не создавая пузырька воздуха.

Медленно вытащите шприц, когда жидкость вытечет из отверстия. С помощью ножниц или плоскогубцев снимите белый фланец с регулятора потока. Вставьте замедлитель потока в насос.

Чтобы определить, есть ли пузырьки в осмотическом насосе, взвесьте осмотический насос отдельно, до и после наполнения. Обрежьте катетер до необходимой длины в соответствии с размерами животного. Прикрепите катетер к мозговой инфузионной канюле.

Наполните катетер лекарственными препаратами с помощью шприца без введения воздуха. Подключите катетер к замедлителю потока так, чтобы он покрывал около четырех миллиметров открытого замедлителя потока. Погружайте заполненные насосы в стерильный 0,9% физиологический раствор или PBS при температуре 37 градусов Цельсия в течение не менее четырех-шести часов.

Предпочитают продлевать на ночь после реализации. Снова закрепите мышей на стереотаксическом аппарате. Откройте ранее сшитый хирургический разрез и разверните разрез до лопаток.

Отделите кожу от подкожной соединительной ткани в лопатке, используя гемостатические плоскогубцы или пинцет, чтобы открыть полость, и поместите осмотический насос в полость. Ватным тампоном аккуратно протрите и обнажите отверстие на поверхности черепа, созданное при установлении модели демиелинизации. Вставьте канюлю инфузии мозга через точечное отверстие перпендикулярно и закрепите его на черепе тканевым клеем.

Снимите съемную вкладку над канюлей для инфузии мозга ножницами. Сшить разрез или прикрепить его тканевым клеем. Поместите животное в клетку в одиночку после операции.

После выполнения выполнения окрашивания DAPI выявлено, что точечное отверстие в мозговой ткани лежит чуть выше белого вещества, что свидетельствует об успешном осуществлении мозговой инфузионной канюли осмотического насоса. Эксперимент по гибридизации in situ проводился с помощью зрелого олигодендроцитарного маркера MAG-зонда, который использовался для маркировки вновь дифференцированных олигодендроцитов. Результаты показали, что лечение UM206 дало больше MAG-положительных клеток в демиелинизированной области, чем контрольная группа.

Просвечивающая электронная микроскопия демиелинизированной области показала, что количество миелинизированных аксонов было увеличено в группе лечения UM206 по сравнению с контрольной группой, предполагая, что UM206 индуцировал более высокий уровень ремиелинизации. При подготовке осмотического насоса будьте осторожны, чтобы не ввести пузырь в систему.