Индуцирование спасения полипа в коралловых колониях для получения индивидуализированных микропропагатов для лабораторного экспериментального использования

Микроразмножение кораллов все еще находится в зачаточном состоянии. Оптимизация протоколов для спасения полипов является ключом к заполнению этого пробела, позволяя ученым использовать полипы в качестве моделей для изучения кораллов в лабораторных условиях. Спасение полипа позволяет создавать множественные размножения из небольших фрагментов кораллов.

Полипы могут быть использованы в различных экспериментах, облегчающих наблюдение микроскопических процессов в кораллах, например. Коралловые рифы находятся под угрозой. Наша цель состоит в том, чтобы использовать эту воспроизводимую модель для разработки стратегий защиты кораллов от обесцвечивания и других экологических угроз эффективным и неинвазивным способом.

Этот метод может помочь в исследовании физиологии кораллов, взаимодействий микробиома хозяина и механизмов, участвующих в обесцвечивании. Такие результаты могут способствовать оптимизации коралловых пробиотиков, например. Использование морской воды с адекватной соленостью является ключевым.

Соленость должна начинаться на уровне естественной среды коралла и увеличиваться медленно, чтобы стресс не был чрезмерно вредным. Сбор полипов в нужный момент и выбор тех, которые наиболее неповреждены, имеет решающее значение для их выживания. Визуальная демонстрация может иметь жизненно важное значение для понимания этих сигналов.

Сначала используйте диагональные плоскогубцы, чтобы вырезать небольшие фрагменты из коралловой колонии, затем поместите их в небольшие чашки Петри, заполненные 12 миллилитрами морской воды, к которой акклиматизировалась коралловая колония. Оставьте пластину открытой примерно на 24 часа при температуре окружающей среды, чтобы вода испарилась и ее соленость постепенно увеличивалась. Когда между полипами наблюдается переваривание тканей, используйте 1-миллилитровую переносную пипетку, чтобы создать мягкий поток рядом с коралловой тканью.

Поток медленно поможет завершить отслоение полипов, которые уже переварили ткань вокруг них от скелета, затем с помощью пипетки медленно обменять воду в чашке Петри с изосмотической водой. Чтобы приготовить морскую воду с высокой соленостью, возьмите обычную морскую воду и добавьте хлорид натрия в морскую воду, чтобы подготовить три литра морской воды с высокой соленостью, пока соленость не увеличится на 85% После разрезания небольших фрагментов кораллов, как было продемонстрировано ранее, поместите их в 10-литровый контейнер с тремя литрами изосмотической морской воды, подключенной к перистальтическому насосу. Наполните этот контейнер тремя литрами предварительно приготовленной морской воды с высокой соленостью в течение 24 часов со скоростью 126 миллилитров в час, чтобы увеличить соленость примерно на 40% Используя пипетку, создайте мягкий поток воды для освобождения полипов из скелета.

Медленно обменивайте воду в емкости с изосмотической морской водой. Добавьте 26,29 грамма хлорида натрия, 0,872 грамма хлорида калия, 2,16 грамма сульфата магния, 11,94 грамма хлорида магния, 3,42 грамма сульфата натрия и 0,26 грамма бикарбоната натрия в один литр деионизированной воды для приготовления морской воды без кальция, а затем наполните чашки Петри этой морской водой без кальция. После разрезания небольших фрагментов кораллов погрузите их в безкальциевую морскую воду в чашки Петри.

Поместите чашки в орбитальный инкубатор на три часа со скоростью вращения 80 об/мин, затем перенесите фрагменты в чашки Петри, наполненные 20%-ным DMEM, приготовленные искусственной морской водой из 40 практических единиц солености и содержащие 100 миллиграммов на литр ампициллина. Инкубируйте фрагменты при 26 градусах Цельсия и 80 об/мин. Обменивайтесь средами каждый день до тех пор, пока не будет наблюдаться переваривание тканей между полипами, и отдельные полипы не начнут отделяться от скелета, затем переносят полипы в стерилизованную морскую воду и инкубируют в течение одного часа.

Как только полипы будут возвращены в отфильтрованную морскую воду с ненапрягающей соленостью, выберите жизнеспособные полипы, наблюдая за целостностью тканей и движением, вызванным цилиарным потоком под стереомикроскопом. Поместите выбранные полипы в чашку Петри и накройте чашку Петри планктонной сеткой размером сетки 200 микрометров, чтобы полипы не отплывали от чашки. Поместите чашку Петри в аквариум с соответствующими условиями для используемых видов кораллов.

Чтобы предотвратить разрастание водорослей, открывайте чашку Петри не реже одного раза в неделю, чтобы обновить воду и очистить посуду. После выбора полипов, как показано ранее, с помощью трансферной пипетки поместите их в колбу поверхностной ячейки площадью 75 квадратных сантиметров, заполненную 50 миллилитрами изосмотической морской воды, затем закройте колбу и поместите их в инкубатор, установленный при 12-часовых световых циклах, 26 градусах Цельсия и 40 оборотах в минуту. Если колба наполнится водорослями или биопленками, перенесите содержимое в чистую колбу.

В этом исследовании спасение полипа было вызвано тремя различными методами. Метод испарения воды привел к полному спасению в течение 24 часов после инкубации, а соленость увеличилась с 40 до 59 единиц практической солености через 24 часа. Метод подачи соленой воды также привел к спасению полипа после 24 часов инкубации.

Здесь соленость увеличилась с 40 до 52 единиц практической солености после 12 часов инкубации, а затем до 59 единиц практической солености через 24 часа. Индукция спасения через инкубацию в морской воде без кальция была завершена после трех часов инкубации полипов в ней, за которой последовали 20 часов инкубации в среде 20% DMEM. Коралловые полипы, образующиеся методом испарения, могут выживать в течение шести недель, тогда как полипы, полученные методом подачи морской воды с высокой соленостью, могут выживать в течение восьми недель в чашках Петри внутри аквариумов.

Полипы, полученные методом испарения морской воды, хранящиеся в колбах клеточных культур внутри инкубаторов, выживали до трех недель без полной диссоциации их тканей. При отсоединении полипов от скелета важно быть щадящим. Если они не полностью отделены, принудительное отслоение путем сильного пипетирования воды приведет к повреждению и снижению выживаемости.

С помощью этих методов можно индуцировать расселение полипов. Поселение полипов может ответить на вопросы о процессах его кальцификации и роста. После разработки индукции спасения полипа исследователи смогли изучить первоначальное формирование кораллового скелета и непосредственно визуализировать обесцвечивание кораллов в масштабе полипов.