В естественных условиях Кальциевая визуализация реакции нейронов ганглиев дорсального корешка на соматические и висцеральные раздражители

Наши исследования сосредоточены на нейронах и цепях соматосенсорной системы, участвующих в описании обезболивающих эффектов иглоукалывания на висцеральную боль, пытаясь скорректировать нейронные реакции нейро DRG на акупунктурные стимулы. Традиционные методы, такие как электрозапись, не могут эффективно исследовать достаточное количество клеток и отчетливые специфические клеточные связи для идентификации висцеральных или соматически чувствительных нейронов in vivo. Изучение функциональной роли нейронов DRG в обезболивающем эффекте иглоукалывания было затруднено из-за технологических ограничений.

Мы представили общий подход к наблюдению за ответственностью нейрона DRG номер шесть к внутрикишечному и акупунктурному моделированию in vivo. В протоколе изложены процедуры наблюдения за активностью нейронов DRG in vivo в ответ на соматический и висцерный вход. Это улучшение по сравнению с предыдущим исследованием, которое было сосредоточено только на изучении реакций нейронов в L5 DRG под соматическими стимулами.

В будущем, при правильной настройке, визуализация DRG in vivo CAS может быть выполнена в грудном или шейном сегментах, что является более мощным инструментом для изучения эффектов висцеральной ноцицепции и иглоукалывания. Этот метод необходим для изучения исследователями акупунктуры. Для начала поместите трахеостомированную мышь в положение лежа на грелке.

Сделайте семисантиметровый разрез по средней линии в нижней части спины и продлите его от пятого поясничного отдела до первого крестцового позвонка. Затем осторожно отодвиньте в сторону длинные мышцы поясницы, чтобы обнажить остистые отростки трех позвонков. Переместите внутренние части двустороннего длинного поясничного отдела, дорсальных поясничных мышц позвоночника и дорсальных поясничных полухребтовых мышц, чтобы обнажить последовательные три суставных и молочных отростка с регистрирующим сегментом в середине позвонков.

Теперь надежно обездвижите животное зубными щипцами на двусторонних суставных отростках соседних позвонков. С помощью щипцов ронжера удаляют левый или правый суставной и молочный отростки четырех или шести поясничных позвонков. Осторожно обнажите левую или правую поясничную шестерку DRG после очистки соединительных тканей над ней.

Убедитесь, что эпиневрий не поврежден на выбранной стороне поясничного отдела шести позвонков. Накройте открытые участки DRG маленькими ватными шариками, смоченными в физрастворе, для поддержания активного состояния. Теперь подключите систему доставки анестезии с низким потоком к трахеальной канюле, чтобы интубировать мышей.

Поместите животное с открытым DRG на грелку, расположенную на сцене индивидуального спинального зажима. С помощью двух зажимов на позвоночных столбах соседних позвонков обезопасьте животное, чтобы свести к минимуму движения во время испытаний. Затем замените ватные тампоны, смоченные солевым раствором, пока операционная область не станет достаточно чистой.

Вставьте специальный спинальный зажим в специально разработанный предметный столик микроскопа. Для получения изображения расположите воздушную линзу с большим рабочим расстоянием от конфокального микроскопа над экспонируемой DRG. Захват покадровых Z-стеков неповрежденных поясничных четырех или шести DRG с 25 микрометрами на шаг и разрешением 512 на 512 или 1, 024 на 1 024 пикселя.

Выполните сканирование DRG XYZT с помощью четырех-восьми стеков, охватывающих от одного до трех исходных состояний, два-три иглоукалывательных или висцеральных колоректальных раздражителя и от одного до двух состояний после стимулов. Затем примените чистящие или щипывающие стимулы к нижней части спины, задней конечности или задней лапе животного, чтобы оценить наиболее чувствительное рецептивное поле визуализируемых нейронов DRG. Вводите акупунктурные стимулы вручную или с помощью имеющегося в продаже акупунктурного и нервного стимулятора.

Используйте колоректальное растяжение с помощью самодельного манометра для стимуляции висцеральных раздражителей. С помощью конфокального микроскопа измерьте увеличение зеленой флуоресценции нейронального GCaMP при связывании с внутриклеточным кальцием после соматических или висцеральных стимулов. Используя программное обеспечение для работы с изображениями, осветлите видео с помощью цветового параметра.

Вручную разграничьте видимые клетки и определите размер клеток и относительную интенсивность флуоресценции. Экспрессируйте интенсивность флуоресценции как отношение увеличения максимальной вызванной флуоресценции к базальному уровню. В шести нейронах DRG поясничного отдела, как правило, отсутствует исходная флуоресценция GFP, что, возможно, обусловлено уровнями экспрессии GCaMP и хирургическим повреждением.

Колоректальные стимулы растяжения индуцировали быстрое, преходящее увеличение флуоресценции GCaMP. Аналогичные реакции наблюдались при применении электроакупунктуры BL25. Тепловые карты и линейные диаграммы показали реакцию всех обведенных нейронов на колоректальное растяжение и электроакупунктуру BL25.

На гистограмме показаны диаметры нейронов, реагирующих на колоректальное растяжение и электроакупунктуру BL25.