Выделение первичных глиальных клеток Мюллера сетчатки мыши

В данной рукописи описан подробный протокол выделения глиальных клеток Мюллера сетчатки из глаз мышей. Протокол начинается с энуклеации и диссекции глаз мыши, за которыми следует выделение, посев и культивирование клеток Мюллера.

Клетки Мюллера являются основными глиальными клетками сетчатки. Они выполняют очень важную роль в поддержании высокометаболически активных нейронов сетчатки. Наша лаборатория разработала метод выделения клеток Мюллера из глаз мышей. Эта методика позволит изучить роль клеток Мюллера при различных заболеваниях сетчатки, понять патогенез заболеваний, а также разработать терапевтические мишени.

[Рассказчик] Этично усыпьте мышь в соответствии с методами, одобренными вашим учреждением. Энуклеируйте глаза, надавливая пинцетом в формате 5/45 на орбитальную область, чтобы вызвать проптоз, с последующим извлечением глаза путем расположения дужек пинцета в задней части глаза, с последующим аккуратным вытягиванием из орбитальной области. Поместите глаза в 10 мл раствора для глаз клеток Мюллера и дайте им посидеть ночь или около 18 часов при комнатной температуре. Через 18 часов сцедите глазной раствор, вылив его из тюбика, который нужно выбросить. Промойте глаза подогретым фосфатным буфером или PBS. Снова сцедите PBS, вылив его из тюбика, который нужно выбросить. Затем поместите глаза в 100-миллиметровую чашку Петри, содержащую 10 мл раствора трипсина. Поместите чашку в инкубатор и инкубируйте от 1,5 до 2 часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2. После инкубации перенесите глаза в 60-миллиметровую чашку Петри, содержащую примерно пять мл полной первичной среды для роста клеток Мюллера. Стоит отметить, что видео было записано снаружи капота для лучшей видимости и четкой демонстрации. Для реальных экспериментов их следует проводить в ламинарном проточном колпаке, как показано на рисунке. Поместите глаза под препарирующий микроскоп и начните препарирование. Используйте пинцет в стиле M5S и ножницы Vannas для удаления соединительной ткани, экстраокулярных мышц и зрительного нерва. Здесь зрительный нерв разрезается ножницами Vannas. Захватите глаз пинцетом в стиле M5S и сделайте надрез в области ora пильчатой с помощью ножниц Vannas или иглы шприца. Захватите разрез двумя пинцетами в стиле M5S и начните вытягивать или отрывать роговицу из задней части глаза. Потяните с небольшим шагом, чтобы целостность сетчатки оставалась неповрежденной. Вот демонстрация того, как удалить роговицу из задней части наглазника. После того, как хрусталик и нервная сетчатка обнажены, удалите пигментный слой глаза, к которому, вероятно, прилипла радужная оболочка. Затем удалите нервную сетчатку с хрусталика. Удалите любую пигментированную ткань из нервной сетчатки, чтобы повысить чистоту изоляции. Учитывая липкую природу нервной сетчатки, маловероятно, что вы удалите всю пигментированную ткань. Соберите все нейронные сетчатки и разорвите их на более мелкие кусочки. Поместите нервную сетчатку в колбу T25, содержащую четыре мл полной первичной среды для роста клеток Мюллера. Наконец, поместите колбу в инкубатор и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2. На панели А показана здоровая культура клеток Мюллера на нулевом и первом пассажах. Недостаток пигмента свидетельствует об отсутствии клеток РПЭ, которые являются основным загрязнением в изоляции. На панели B он усилен RP65, специальным маркером RP.