Name: Выделение первичных глиальных клеток Мюллера сетчатки мыши (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-30T12:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 39 s
Description: Изучите метод выделения первичных глиальных клеток Мюллера сетчатки мыши. Этот протокол позволяет получить чистые культуры клеток без загрязнения эпителием пигментного слоя для исследований.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Эта работа была поддержана Национальным институтом глаза (NEI), Национальным институтом глаза (NEI) фондом R01 EY029751-04. Мы хотели бы выразить признательность доктору Сильвии Б. Смит, так как этот протокол был модифицирован на основе ее протокола выделения клеток Мюллера.

Все эксперименты на животных соответствовали заявлению ARVO об использовании животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения и проводились в соответствии с нашим протоколом для животных, утвержденным Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) и политикой Оклендского университета (протокол No 2022-1160)
1. Подготовка сред и растворов
<ol><li>Приготовьте раствор для глаз с клетками Мюллера, добавив модифицированную орлиную среду Dulbecco (DMEM, подробности в таблице материалов) пенициллином/стрептомицином в разведении 1:1000. Например, на 10 мл DMEM добавьте 10 мкл пенициллина/стрептомицина. ПРИМЕЧАНИЕ: Это простая среда, приготовленная без сыворотки. Кроме того, нагрейте готовую среду на водяной бане при температуре 37 °C перед использованием для работы с клеточными культурами.</li>
	<li>Приготовьте полную первичную питательную среду для клеток Мюллера, добавив в DMEM 10% фетальную сыворотку крупного рогатого скота (FBS, инактивированную при нагревании) и 1% пенициллин/стрептомицин. Например (500 мл среды DMEM + 50 мл FBS + 5 мл пенициллина/стрептомицина).</li>
	<li>Приготовьте 0,05% раствор Трипсин-ЭДТА с Коллагеназой IV в концентрации 200 Ед/мл (Трипсин-ЭДТА используется для растворения рассчитанного количества порошка Коллагеназы IV для достижения необходимой концентрации).</li>
</ol>2. Энуклеация
<ol><li>Этично усыпьте мышь с помощью ингаляцииCO2 в соответствии с рекомендациями IACUC.<ol><li>Вкратце, поместите животное (животных) в камеру сСО2 , чтобы ввести 100%СО2 со скоростью заполнения 30-70% объема/мин камеры сСО2 для достижения цели быстрой потери сознания в течение 2-3 минут с минимальным дискомфортом для мышей.</li>
		<li>Поскольку мыши находятся в молодом возрасте (~10 дней), выполняйте вывих шейки матки в качестве вторичного метода, чтобы обеспечить надлежащую эвтаназию.</li>
	</ol></li>
	<li>После стерилизации рабочей зоны 70% этанолом поместите мышь на стерильную подкладку.</li>
	<li>Извлеките глаза, поместив дужки пинцета в заднюю часть глаза, осторожно потянув за орбитальную область, и энуклеируйте глаза, надавливая пинцетом в стиле 5/45 на орбитальную область, чтобы вызвать проптоз. ПРИМЕЧАНИЕ: Перед вскрытием стерилизуйте инструменты для вскрытия 70% этанолом с последующим добавлением фосфатного буферного раствора.</li>
	<li>Убедитесь, что зрительный нерв все еще соединен с глазом, путем медленной энуклеации глаза. Обязательно потяните зрительный нерв (визуально идентифицируемый как белый шнур) за глазом. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг не обязательно должен выполняться под микроскопом, и может быть выполнен на стерилизованном столе.</li>
</ol>3. Лечение энуклеированных глаз
<ol><li>Накройте пробирку центрифуги объемом 15 мл алюминиевой фольгой и заполните пробирку 10 мл раствора для глаз клеток Мюллера.</li>
	<li>Поместите рассеченные глаза в пробирку объемом 15 мл с раствором для глаз из клеток Мюллера и оставьте их на ночь или около 18 часов при комнатной температуре.</li>
	<li>Через 18 ч сцедите глазной раствор и кратковременно промойте глаза 2-3 мл подогретого (37 °C) фосфатно-солевого буферного раствора (PBS).</li>
	<li>Сцедите PBS и переместите глаза в чашку Петри диаметром 100 мм, содержащую 10 мл раствора трипсина. (подготовлено на шаге 1.3). ПРИМЕЧАНИЕ: Трипсин используется на всем энуклеированном глазу, действуя как диссоциативный агент для облегчения отделения клеток от слоев сетчатки во время диссекции. Вскрытая сетчатка содержит множество клеток, в том числе клетки RPE, которые являются липкими и, скорее всего, загрязняют культуру клеток Мюллера14. Микроскопическое исследование наглядно показало, что после 5 дней изоляции (при первой смене среды) клетки РПЭ отделились от пластины и погибли13 человек. Средой, используемой для выделения РПЭ, является DMEM/F-12, с составом, отличным от DMEM (используемого при выделении клеток Мюллера), содержащей пируват натрия и низкое содержание глюкозы.</li>
	<li>Поместите чашку в инкубатор и инкубируйте от 1,5 до 2 часов при 37 °C и 5% CO2.</li>
	<li>После инкубации перенесите глаза в чашку Петри диаметром 60 мм, содержащую примерно 5 мл полной первичной среды для роста клеток Мюллера.</li>
</ol>4. Вскрытие
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура должна проводиться в стерильной среде капюшона. Следовательно, важно тщательно простерилизовать поверхности вытяжки 70% спиртом, а также все инструменты и микроскоп для вскрытия. Стоит отметить, что видео было записано вне капота для лучшей видимости и более четких демонстрационных целей.
<ol><li>Положите в чашку небольшой кусочек стерилизованной лабораторной салфетки, чтобы стабилизировать глаза во время вскрытия. Поместите глаза под препарирующий микроскоп, чтобы начать вскрытие. ПРИМЕЧАНИЕ: Использование лабораторной ткани облегчает маневрирование глаз в наполненной жидкостью чашке (полная среда), обеспечивая точное рассечение.</li>
	<li>Используйте ножницы Vannas и пинцет в стиле M5S, чтобы удалить соединительную ткань, экстраокулярные мышцы и зрительный нерв.<ol><li>Захватите глаз пинцетом в стиле M5S и сделайте надрез в области ora пильчатой с помощью ножниц Vannas или иглы шприца. ПРИМЕЧАНИЕ: Существует светло-голубая круговая линия между передней и задней частями глаза, называемая ora serrata, которая может быть использована в качестве ориентира для точного направления во время вскрытия.</li>
		<li>Захватите разрез пинцетом в стиле M5S и вытяните или оторвите роговицу от задней части глаза. Потяните с небольшим шагом, чтобы целостность сетчатки оставалась неповрежденной. ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги направлены на удаление передней части глаза (роговицы, радужной оболочки и хрусталика) из задней части наглазника (нервная и пигментированная сетчатка).</li>
		<li>Чтобы сохранить целостность слоев сетчатки, осторожно потяните и удалите пигментный эпителий сетчатки из нервной сетчатки. Нервная сетчатка должна быть свободна от каких-либо черных пятен, чтобы обеспечить максимальную чистоту изоляции, так как слой RPE обычно липкий и прикреплен к нейрональной сетчатке.</li>
		<li>Разрежьте рассеченную нервную сетчатку на мелкие кусочки перед тем, как собрать ее в пластину, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток на пластине.</li>
	</ol></li>
	<li>Поместите нервную сетчатку в колбу T25, содержащую 4 мл полной первичной среды для роста клеток Мюллера.</li>
	<li>Наконец, поместите колбу в инкубатор и инкубируйте при 37 °C и 5%CO2.</li>
</ol>5. Культивирование первичных глиальных клеток Мюллера
<ol><li>Не перемещайте колбу в течение 3-5 дней, чтобы способствовать росту клеток.</li>
	<li>Меняйте среду после пятого дня и через день после этого до тех пор, пока клетки не слияются на 90%.</li>
</ol>6. Пассирование первичных глиальных клеток Мюллера
<ol><li>Аспирируйте питательную среду для клеточных культур Мюллера, а затем 2 мл промывки в PBS и аспирируйте PBS. Добавьте 2 мл 0,25% трипсина-ЭДТА (1x) или достаточно, чтобы покрыть пластину.</li>
	<li>Выдерживать 5-10 минут при комнатной температуре.</li>
	<li>Убедитесь, что клетки отделены от планшета под микроскопом. Затем соберите клеточную суспензию и добавьте в пробирку для сбора 4 мл предварительно подогретой (37 °C) полной первичной среды для выращивания клеток Мюллера (приготовленной на шаге 1.2).</li>
	<li>Центрифуга в течение 7 мин при 300 x g. После аспирации надосадочной жидкости ресуспендируйте гранулу в 10 мл полной первичной питательной среды для клеток Мюллера. Поскольку количество клеток может варьироваться в зависимости от количества рассекаемых глазков, поэтому лучше подсчитывать клетки перед посевом и инкубацией. Рекомендуемая плотность высева составляет 3,0 х 106 ячеек в колбе Т75. ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки можно пропускать до 4-5 раз. Однако наиболее последовательные результаты эксперимента обнаруживаются после 1-2 проходов.</li>
</ol>7. Иммунофлюоресценция
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте протокол иммунофлюоресценции для окрашивания и подтверждения специфичности клеток Мюллера. Вот краткий обзор иммунофлюоресцентного протокола. Этот шаг выполняется после первого прохода12.
<ol><li>Засейте клетки в предметное стекло камеры для клеточных культур (30 000 клеток на лунку для предметного стекла с 8-луночной камерой).</li>
	<li>Культивируют выделенные клетки в течение 24-48 ч в полной среде для культивирования клеток Мюллера (приготовленной на стадии 1.2) при 37 °C и 5%CO2.</li>
	<li>Отсадите среду и промойте предметное стекло камеры 250-300 мкл 1x PBS на каждую лунку, когда ячейки сливаются на 80-90%.</li>
	<li>Зафиксируйте предметное стекло на 10-15 минут в 250-300 мкл 4% параформальдегида на каждую лунку, после чего промойте PBS/TX-100 (по 5 мин каждая/3x).</li>
	<li>Добавьте блокирующий буфер на 1 ч при 37 °C (см. Таблицу материалов).</li>
	<li>Аспирируйте блокирующий раствор, затем добавьте первичные антитела, специфичные для клеток Мюллера, чтобы подтвердить чистоту выделенных клеток с помощью глутаминсинтетазы и виментина 5,12. Инкубировать в течение 3 ч при 37 °C (используя концентрацию антител 1:100-1:200 в блокирующем буфере в объеме 150-200 мкл/слайд). Вымойте предметное стекло с помощью смывок PBS/TX-100 (по 5 и 10 минут). ПРИМЕЧАНИЕ: Эти антитела были выбраны потому, что они являются отличительными признаками для идентификации клеток Мюллера и обеспечения успеха и чистоты клеточной культуры Мюллера.</li>
	<li>Добавьте вторичное антитело (с концентрацией антитела в диапазоне от 1:1000 в блокирующем буфере в концентрации 150-200 мкл/слайд) и инкубируйте в течение 1 ч при 37 °С. Затем постирайте PBS/Triton X-100 три раза (по 5-10 минут каждый).</li>
	<li>Нанесите каплю монтажной среды DAPI для маркировки ядер, прежде чем накрыть предметное стекло покровным стеклом. Избегайте образования пузырьков воздуха при размещении покровного стекла.</li>
	<li>Используйте флуоресцентный микроскоп для проверки предметного стекла и получения изображений (см. Таблицу материалов). ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки расположены с помощью DAPI в точке ex/em 359/461 при 10-кратном увеличении для определения местоположения ячеек; Большее увеличение может захватывать клетки. Другие длины волн будут зависеть от выбранного цвета. Зеленый цвет (GFP) - ex/em 488/510. Красный цвет (Cy3) - ex/em 555/569.</li>
</ol>

<ol><li>Liu, Y., Wang, C., Su, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+signaling+in+m%C3%BCller+glia%3A+Progenitor+cells+for+regenerative+and+neuroprotective+responses+in+pharmacological+models+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ophth%22%5BJournal%5D)">Cellular signaling in müller glia: Progenitor cells for regenerative and neuroprotective responses in pharmacological models of retinal degeneration.</a> J Ophth. 2019, 5743109(2019).</li>
<li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (7), 431-442 (2014).</li>
<li>Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -J., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell-dependent+regeneration+of+the+neural+retina%3A+An+overview+across+vertebrate+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems.</a> Dev Dyn. 245 (7), 727-738 (2016).</li>
<li>Kobat, S. G., Turgut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+M%C3%BCller+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Beyoglu+Eye+J%22%5BJournal%5D)">Importance of Müller cells.</a> Beyoglu Eye J. 5 (2), 59-63 (2020).</li>
<li>Liu, X., Tang, L., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+M%C3%BCller+cell+isolation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Mouse Müller cell isolation and culture.</a> Bio Protoc. 7 (15), e2429(2017).</li>
<li>Bringmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+cells+in+the+healthy+and+diseased+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Ret+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Müller cells in the healthy and diseased retina.</a> Prog Ret Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).</li>
<li>de Melo Reis, R. A., Ventura, A. L. M., Schitine, C. S., de Mello, M. C. F., de Mello, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glia+as+an+active+compartment+modulating+nervous+activity+in+the+vertebrate+retina%3A+neurotransmitters+and+trophic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Müller glia as an active compartment modulating nervous activity in the vertebrate retina: neurotransmitters and trophic factors.</a> Neurochem Res. 33 (8), 1466-1474 (2008).</li>
<li>Fischer, A. J., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glia+are+a+potential+source+of+neural+regeneration+in+the+postnatal+chicken+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Müller glia are a potential source of neural regeneration in the postnatal chicken retina.</a> Nat Neurosci. 4 (3), 247-252 (2001).</li>
<li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+%28Danio+rerio%29+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+of+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> J of Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).</li>
<li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+of+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> J of Vis Exp. (133), 56997(2018).</li>
<li>Sarthy, P. V., Bunt, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ultrastructure+of+isolated+glial+%28M%C3%BCller%29+cells+from+the+turtle+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">The ultrastructure of isolated glial (Müller) cells from the turtle retina.</a> Anat Rec. 202 (2), 275-283 (1982).</li>
<li>Shanmugam, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+receptor+membrane+component+1+%28PGRMC1%29+expression+in+murine+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Progesterone receptor membrane component 1 (PGRMC1) expression in murine retina.</a> Curr Eye Res. 41 (8), 1105-1112 (2016).</li>
<li>Moustafa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((12-HETE+activates+M%C3%BCller+glial+cells%3A+The+potential+role+of+GPR31+and+miR-29%5BTitle%5D)+AND+%22Prostag+Oth+Lipid+M%22%5BJournal%5D)">12-HETE activates Müller glial cells: The potential role of GPR31 and miR-29.</a> Prostag Oth Lipid M. 171, 106805(2024).</li>
<li>Pereiro, X., Ruzafa, N., Acera, A., Urcola, A., Vecino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+method+to+isolate+and+culture+adult+porcine%2C+rats+and+mice+m%C3%BCller+glia+in+order+to+study+retinal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a method to isolate and culture adult porcine, rats and mice müller glia in order to study retinal diseases.</a> Front Cell Neurosci. 14, 7(2020).</li>
</ol>

Авторы не имеют никаких конфликтов интересов, которые могли бы иметь отношение к содержанию данной статьи.

Выделение первичного пигментного эпителия сетчатки (РПЭ) у мышей ранее было задокументировано нашей лабораторией. В данной рукописи подробно описан демонстрационный протокол выделения первичных клеток Мюллера. Эта процедура включает в себя энуклеацию, лечение, диссекцию, сбор, посев, культивирование и характеристику клеток Мюллера, выделенных из глаз мышей. Он основан на ранее успешном протоколе, найденном в более ранних публикациях, и нашем модифицированном протоколе, который мы использовали в недавней публикации1, 2,13. Несмотря на простоту шагов, успешная изоляция клеток Мюллера требует соблюдения определенных ограничений и основных требований. После многочисленных проб и ошибок попыток оптимизировать этот протокол было выявлено множество факторов, влияющих на его успех.
Было обнаружено, что идеальный возраст мышей, как было установлено в наших экспериментах, составляет от 5 до 11 дней для того, чтобы изолированные клетки выросли до четырех проходов. На культуру также влияет то, сколько глаз изолировано и культивировано. Для одиночной изоляции требуется не менее двух глаз, чтобы получить достаточное количество клеток, чтобы иметь возможность расти и размножаться. Еще одним важным аспектом является продолжительность между энуклеацией и покрытием; Поэтому этот шаг нужно выполнить относительно быстро. Было замечено, что длительные манипуляции с тканями глаза оказывают пагубное влияние на способность клеток прилипать к колбе и размножаться. Чтобы убедиться, что близость изолированных клеток достаточно близка для стимулирования пролиферации, мы советуем использовать колбу T25. После того, как будет сделан первый проход, ячейки могут быть покрыты на T75. Также клетки не следует нарушать после выделения и посева путем извлечения колбы с культурой тканей из инкубатора или путем переключения среды не менее чем на 5 дней. Наконец, клетки можно пропустить только около четырех раз, прежде чем они перестанут прилипать. Несмотря на то, что эта процедура проста и проста в выполнении, она имеет некоторые ограничения, включая возраст мышей, ограниченное количество клеточных проходов и т. д.
Существует не так много протоколов для выделения клеток Мюллера, но есть некоторые заметные отличия от протоколов, которые доступны 5,14. Во-первых, время между энуклеацией и изоляцией существенно отличается. Другие протоколы предполагают вскрытие вскоре после энуклеации, обычно в течение 10 минут. В то время как текущий протокол предполагает период покоя не менее 18 часов, так как это обеспечило наилучшие результаты изоляции в данном протоколе. Еще одним существенным отличием этого протокола от других протоколов является точка, в которой глаза обрабатываются ферментами. В этом протоколе глаза обрабатываются до того, как будет выполнено любое рассечение, даже до удаления соединительной ткани и экстраокулярных мышц. В то время как другие протоколы изолируют сетчатку от глаза перед лечением ферментами. Кроме того, рецептура фермента также отличается. В этом протоколе ферментный раствор состоит из трипсина и коллагеназы IV типа. В аналогичных протоколах для переваривания тканей используются папаин и ДНКаза. Кроме того, сосуд для культивирования отличается, этот протокол предлагает культивирование на Т25, а затем на Т75 после первого прохода. В то время как в других протоколах используются чашки Петри или многолуночные планшеты. Наконец, этот протокол предполагает, что колбу не следует тревожить (в течение 5-7 дней), чтобы способствовать росту клеток. В то время как в других протоколах смена среды производится через один день.

Клетки Мюллера (МЦ) являются основными и наиболее распространенными глиальными клетками, обнаруженными в ткани сетчатки. Они играют ключевую роль в обеспечении структурной целостности и метаболических функций в сетчатке1. Стратегическая структура МК распределена по всей толщине сетчатки, тем самым обеспечивая поддержку сетчатки. В дополнение к своим скаффолдоподобным свойствам, они выполняют метаболические функции для нейронов сетчатки, снабжая их энергетическими субстратами, включая глюкозу и лактат. Эти функции имеют решающее значение для поддержания здоровой функции нейронов. Сообщалось, что нарушенные МК способствуют развитию различных заболеваний сетчатки, включая возрастную макулярную дегенерацию, диабетическую ретинопатию и глаукому 2,3. МК могут быть эндогенными клеточными источниками для регенеративной терапии в сетчатке1. Они также составляют значительную часть сетчатки, и убедительные данные свидетельствуют о том, что у некоторых видов эти клетки могут быть стимулированы для замены отсутствующихнейронов. Они благотворно взаимодействуют с нейронами, а конически ветвящиеся концевые ноги клеток Мюллера плотно обнажают кровеносные сосуды и соединяют нейронные компоненты сетчатки. Для того чтобы поддерживать развитие нейронов и их пластичность, клетки Мюллера выступают в качестве мягкого субстрата для нейронов, защищая их от механических травм3. Кроме того, при патологических обстоятельствах клетки Мюллера могут дифференцироваться в нейральные предшественники или стволовые клетки, которые реплицируют или регенерируют утраченные фоторецепторы и нейроны 2,3,4. Клетки Мюллера сохраняют характеристики стволовых клеток сетчатки, включая различные уровни потенциала к самообновлению и дифференцировке 5,6. Глиальная клетка Мюллера имеет значительную линию сетчатки, которая продуцирует нейротрофические факторы, поглощает и перерабатывает нейротрансмиттеры, пространственно буферизует ионы и поддерживает гематематический барьер для поддержания сетчатки в гомеостазе 7,8,9. Это подчеркивает потенциал клеток Мюллера в качестве многообещающего инструмента в клеточной терапии для лечения заболеваний, связанных с дегенерацией сетчатки. Клетки Мюллера — это первичная глия, распределенная по всей сетчатке, соединяющаяся как с нейронами, так и с кровеносными сосудами. Они играют решающую защитную роль, обеспечивая необходимую структурную и метаболическую поддержку для поддержания жизнеспособности и стабильности клеток сетчатки. К сожалению, в литературе найдено очень мало протоколов для первичного выделения клеток Мюллера из сетчатки10,11.
Мы представляем усовершенствованный подход к надежной изоляции и культивированию первичных клеток Мюллера у мышей. Этот протокол был использован в нашей группе для выделения клеток Мюллера от мышей дикого типа C57BL/6 и трансгенных мышей12,13. Для этого протокола используются мыши в возрасте от 5 до 11 дней, не имеющие предпочтений по половому признаку. Клетки были пройдены до 4 раз; однако на Р4 они перестают прилипать к колбе, и выращивать здоровую культуру становится сложно. Культура часто контаминируется клетками пигментированного эпителия сетчатки (РПЭ), поэтому клетки должны быть пропущены по крайней мере один раз перед проведением каких-либо дополнительных экспериментов на клеточной линии. Пассаж обеспечивает дальнейшую изоляцию от загрязняющих веществ. Таким образом, представленный протокол предлагает быстрый и эффективный способ выделения мышиных клеток Мюллера, которые затем могут быть использованы в качестве надежной платформы для исследования терапевтических мишеней и оценки потенциальных методовлечения заболеваний сетчатки.

<table><tbody><tr><td>Стакан: 100 мл</td><td>коллагеназы KIMAX</td><td>14000</td><td></td></tr><tr><td>IV&nbsp;</td><td>Уортингтон&nbsp;</td><td></td><td></td>LS004188</tr><tr><td>Одноразовые градуированные трансферные пипетки: 3,2 мл стерильные</td><td></td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1X) &nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>11885084</td><td>Media будет развивать M&uuml; ller cells&nbsp;</td></tr><tr><td>Фетальная бычья сыворотка (FBS)</td><td>gibco</td><td>26140079</td><td>Для полной среды для культивирования клеток</td></tr><tr><td>Muller Глутаминсинтаза</td><td>Клеточная сигнализация</td><td>80636</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VISO 160i CO2 Инкубатор</td><td>Thermo Scientific</td><td>50144906</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Lok Шприц с прикрепленной иглой 21 G x 1 1/2 in., стерильный, одноразовый, 3 мл</td><td>B-D</td><td></td><td></td>309577</tr><tr><td>Микроцентрифуга Пробирка: 2 мл</td><td>Grainger</td><td>11L819</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>gibco</td><td>15140-122</td><td>Для полного M&uuml; Питательная среда для клеточных культур</td></tr><tr><td>Фосфатный буферный раствор (PBS)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>J62851. </td><td></td>AP</tr><tr><td>Пинцет положительного действия, стиль 5/45</td><td>Dumont</td><td>72703-DZ</td><td></td></tr><tr><td>Ножницы Ирис стандартный прямой 11,5 см</td><td>GARANA INDUSTRIES</td><td>2595</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall St8 Центрифуга</td><td>ThermoScientific</td><td>75007200</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 305 Микроскоп</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Хирургическое лезвие, # 11, нержавеющая сталь</td><td>Bard-Parker</td><td>371211</td><td></td></tr><tr><td>Чашка для суспензионной культуры 60 мм x 15 мм в стиле</td><td>Corning</td><td>430589</td><td></td></tr><tr><td>Чашка для культуры тканей: стиль 100x20 мм</td><td>Трубки Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Tornado: 15 мл</td><td>Midsci</td><td>C15B</td><td></td></tr><tr><td>Трубки для торнадо: 50 мл</td><td>Midsci</td><td>C50R</td><td></td></tr><tr><td>Пинцет 5MS, 8,2 см, прямой, 0,09x0,05 мм Наконечники</td><td>Dumont</td><td>501764</td><td></td></tr><tr><td>Пинцет Positive Action Style 5, биологический, Dumostar, полированная отделка, 110 мм OAL</td><td>Электронная микроскопия Sciences Dumont</td><td>50-241-57</td><td></td></tr><tr><td>Пеленки, умеренный: 23" x 36"</td> <td>McKesson</td><td>4033</td><td></td></tr><tr><td>Ванна Пружинные ножницы - 2,5 мм Режущая кромка</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin&nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>MA5-11883</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioImager Z2</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Zen Blue 2.6</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

Выделение первичных глиальных клеток Мюллера сетчатки мыши

Isolation of Primary Mouse Retinal Glial M&#252;ller Cells

Первичной опорной клеткой сетчатки является глиальная клетка Мюллера сетчатки. Они покрывают всю поверхность сетчатки и находятся в непосредственной близости как к кровеносным сосудам сетчатки, так и к нейронам сетчатки. Из-за своего роста клетки Мюллера выполняют несколько важных задач в здоровой сетчатке, включая поглощение и переработку нейротрансмиттеров, соединений ретиноевой кислоты и ионов (например, калия K+). Помимо регуляции кровотока и поддержания гемато-ретинального барьера, они также регулируют обмен веществ и поступление питательных веществ к сетчатке. В данной рукописи представлена установленная процедура выделения первичных мышиных клеток Мюллера. Чтобы лучше понять молекулярные процессы, лежащие в основе различных моделей глазных заболеваний у мышей, выделение клеток Мюллера является отличным подходом. В данной рукописи подробно описана процедура выделения клеток Мюллера от мышей. От энуклеации до посева весь процесс длится около нескольких часов. В течение 5-7 дней после посева среду не следует менять, чтобы выделенные клетки могли беспрепятственно расти. Далее следует характеристика клеток с использованием морфологии и различных иммунофлуоресцентных маркеров. Максимальные проходы для клеток – 3-4 раза.

Валидация специфичности, чистоты и барьерной функции изолированных клеток Мюллера Чтобы подтвердить жизнеспособность, морфологию и отличительные качества выделенных клеток Мюллера, клетки исследовали под световым микроскопом. Были записаны изображения P0 и P1 (рис. 1A). Для проверки контаминации выделенных клеток Мюллера клетками РПЭ и подтверждения их чистоты проводили иммунофлуоресцентное окрашивание (ИФ) с использованием антител, специфичных к клеточному маркеру РПЭ RPE65. Пигментные клетки сетчатки человека (ARPE-19) использовали в качестве положительного контроля. Окрашенные элементы RPE65 RPE (красный и синий для ядерного окрашивания) показаны на рисунке 1B (нижняя панель). Специфические антитела к RPE65 не окрашивали выделенные клетки Мюллера (рис. 1B, верхняя панель). Тот факт, что RPE65 окрашивал клетки ARPE-19 (красным) и не окрашивал изолированные клетки, указывает на то, что выделенные клетки не являются клетками RPE. Наличие пирувата и низкого уровня глюкозы в средах создает неблагоприятные условия для роста клеток РПЭ. Следовательно, даже в случае загрязнения элементов СИЗОД, они в конечном итоге отсоединятся от колбы.
Кроме того, для подтверждения идентичности выделенных клеток было использовано иммунофлуоресцентное окрашивание клеток Мюллера на специфические маркеры клеток Мюллера, чтобы подтвердить успешное выделение клеток Мюллера. Использовался промежуточный филаментный белок цитоскелета, называемый виментином,12,13. Кроме того, была использована глутаминсинтетаза (ГС), которая катализирует реакцию конденсации глутамата и аммиака с образованием глутамина, как ключевая функция глиальных клеток Мюллера сетчатки5.
В целом, изолированные клетки были окрашены отрицательно на RPE65 (красный, рисунок 1B), положительный на виментин (зеленый, рисунок 1C) и GS (зеленый, рисунок 1D). Окрашивание ПЧ подтверждает успешное выделение (чистоту и специфичность) выделенных клеток Мюллера. На рисунке 1Е показан отрицательный контроль на виментин (верхняя панель) и GS (нижняя панель), подтверждающий специфичность антител.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66237/66237fig01.jpg"> Рисунок 1: Валидация выделения клеток Мюллера (чистота и специфичность). (A) Изображение световой микроскопии для морфологии пассажей: нулевой пассаж (P0) и (P1). (B) Иммуноокрашивание RPE65 в сочетании с ядерным окрашиванием DAPI. (C) Иммуноокрашивание виментином с помощью ядерного окрашивания DAPI при большом увеличении. (D) Иммуноокрашивание GS при том же большом увеличении. (E) отрицательный контроль для подтверждения специфичности окрашивания виментином и GS-антителами. масштабная линейка = 300 μм, 300 μм, 50 μм, 20 μм, 20 μм, 50 μм, 50 μм соответственно. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66237/66237fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.</a>

В данной рукописи описан подробный протокол выделения глиальных клеток Мюллера сетчатки из глаз мышей. Протокол начинается с энуклеации и диссекции глаз мыши, за которыми следует выделение, посев и культивирование клеток Мюллера.

The primary supporting cell of the retina is the retinal glial M&#252;ller cell. They cover the entire retinal surface and are in close proximity to both ...

isolation-of-primary-mouse-retinal-glial-mller-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

В этом видео мы продемонстрируем, как изолировать сетчатки стволовых клеток из ресничного эпителия мыши глаз и вырастить их в культуру в форме клональной сетчатки сферах. Сферах, которые изолированы обладают кардинальные свойства стволовых клеток: самообновлению и multipotentiality.

Выделение стволовых клеток сетчатки от мыши глаз

Это видео демонстрирует культивирование глиальных клеток Мюллера (MG), выделенных из сетчатки мышей. Сетчатка диссоциируется в одноклеточную суспензию с помощью пищеварительных ферментов. Затем клетки выращивают в среде с фактором роста, который способствует пролиферации MG-клеток и смертности нейрональных клеток. Мертвые нейрональные клетки удаляются во время пассирования, а клетки MG выращиваются для дальнейшего анализа.

Создание культуры глиальных клеток Мюллера, полученной из сетчатки мышей

Миллионы людей страдают от дегенеративных заболеваний сетчатки, что приводит к необратимой слепоте. Общим элементом многих из этих заболеваний является потеря ганглиозных клеток сетчатки (RGCs). Этот подробный протокол описывает выделение первичных мышиных РГК положительным и отрицательным выбором с проточной цитометрией.

Выделение первичных клеток сетчатки сетчатки (RGCs) проточной цитометрией

Протокол для изоляции первичных микроглии из мышиных мозги представлены. Этот метод помогает в углублении нынешнего понимания Неврологические заболевания. Плотность градиентного центрифугирования и магнитной сепарации объединяются для получения достаточного урожая высоки чисто образца. Кроме того мы наметим шаги для характеризации микроглии.

Характеристика и изоляция первичной микроглии мыши по плотности градиентного центрифугирования

Мы описываем иммуномагнитная изоляции первичных мыши олигодендроциты, который позволяет быстрый и конкретный изоляции клеток в vitro культуры.

Быстрые и конкретные иммуномагнитная изоляция первичной Олигодендроциты мыши

Здесь мы описываем изоляции кишечных глиальных клеток из кишечника подслизистой хелат двухвалентной катионов и затем инкубации в решение восстановления неферментативного ячейки с помощью последовательного инкубаций ЭДТА. Обшивка результирующая ячейка подвеска на поли D-лизин и Ламинин приводит высокообогащенного культуры подслизистую глиальных клеток для функционального анализа.

Изоляция кишечных глиальных клеток от подслизистой и Lamina Propria взрослых мыши

Здесь мы представляем протокол для выделения и очистки первичной микроглии на животных моделях демиелинизирующих заболеваний с использованием столбчатой магнитно-активированной сортировки клеток.

Выделение первичной микроглии мыши методом магнитно-активированной сортировки клеток на животных моделях демиелинизации

Эта рукопись описывает упрощенный протокол для выделения клеток пигментированного эпителия сетчатки (RPE) из глаз мыши ступенчатым образом. Протокол включает в себя энуклеацию и рассечение глаз мыши с последующим выделением, посевом и культивированием клеток RPE.

Выделение первичных пигментированных клеток эпителия сетчатки мыши

Первичные культуры глии Мюллера, полученные из сетчатки мышей, представляют собой очень прочный и надежный инструмент для изучения глиального превращения в клетки-предшественники сетчатки после лечения микроРНК. Отдельные молекулы или комбинации могут быть протестированы перед их последующим применением подходов in vivo .

Первичные клеточные культуры для изучения потенциала регенерации мышиной глии Мюллера после лечения микроРНК

Пигментный эпителий сетчатки (РПЭ) действует как важнейший барьер между сосудистой оболочкой и сетчаткой, способствуя здоровью и функции типов клеток сетчатки, таких как фоторецепторы. В данной работе мы описываем простой и эффективный протокол выделения и культивирования взрослых мышей RPE.

Упрощенный метод выделения и культивирования клеток пигментного эпителия сетчатки у взрослых мышей

В данной статье представлен подробный протокол выделения первичных клеток Мюллера сетчатки от неонатальных крыс Спрага-Доули (SD). Процедура включает в себя энуклеацию глазных яблок, диссекцию ткани сетчатки, экстракцию и идентификацию клеток, а также ключевые соображения для последующей клеточной культуры.

Выделение и культивирование первичных клеток Мюллера сетчатки у крыс Sprague-Dawley (SD)

Изучите метод выделения первичных глиальных клеток Мюллера сетчатки мыши. Этот протокол позволяет получить чистые культуры клеток без загрязнения эпителием пигментного слоя для исследований.

Выделение первичных глиальных клеток Мюллера сетчатки мыши

Больше видео