Оценка активности ДНКазы с помощью ратиометрического флуоресцентного резонансного переноса энергии

Мы решаем проблему чувствительного детектирования слабой нуклеазной активности, требующей длительного наблюдения в различных стадиях. Мы разработали этот ратиометрический анализ FRET для обнаружения и измерения активности ДНКазы различных биомолекул с высокой чувствительностью и в течение длительных периодов времени.

Этот анализ позволяет систематически оценивать, как экспериментальные параметры, такие как pH, температура и состав буфера, влияют на активность ДНКазы в режиме реального времени. Для начала разбавьте образец белка до соответствующей концентрации в каждом буферном растворе в диапазоне от pH 4,8 до pH 6,5. Приготовьте раствор ратиометрического зонда FRET, растворив его в воде, не содержащей нуклеаз, в концентрации, близкой к одному микромоляру или одному пикомоле на микролитр. Теперь подготовьте три лунки в 96-луночной пластине для каждого тестируемого условия pH, добавив в каждую лунку 70 микролитров воды, не содержащей нуклеаз, и 10 микролитров 10X-буфера. В трех отдельных лунках готовят положительные контролы путем соединения указанных реагентов. Для отрицательного контроля замените образец белка водой, не содержащей нуклеаз. Индуцировать реакцию ДНКазы путем добавления растворов зондов к смесям, содержащим белок ДНКазы при различных значениях рН. Тщательно перемешайте все образцы, следя за тем, чтобы не образовались пузырьки. Затем инкубируйте образцы ДНКазы, содержащие ратиометрический зонд FRET, при температуре 37 градусов Цельсия, используя либо водяную баню, либо инкубатор с регулируемой температурой в течение различной продолжительности в зависимости от интенсивности активности ДНКазы. Завершите все инкубационные реакции, добавив в каждую лунку по 100 микролитров 250 мкмолярного буфера соляной кислоты Tris при pH 8. На этом этапе также выравнивается pH во всех образцах. Сразу после выравнивания pH с помощью спектрофлуориметра регистрируются спектры излучения как донорных, так и акцепторных флуорофоров. Выполняйте измерения непосредственно в 96-луночном планшете, возбуждая донорный флуорофор на 488 нанометрах и одновременно регистрируя излучение на 525 нанометрах для донора и 580 нанометров для акцепторного сигнала, полученного FRET. Используйте записанные интенсивности флуоресценции для оценки активности ДНКазы для каждого образца. Затем рассчитайте коэффициент FRET по заданной формуле. Проверьте расщепление FRET-зонда, загрузив 15 микролитров каждого образца в 20% денатурирующий полиакриламидный гель. Запустите гель в течение часа при напряжении 100 вольт. Наконец, поместите гель на лоток системы документирования, оснащенной цветной камерой высокого разрешения и полученными изображениями геля. Анализ денатурирующего полиакриламидного геля показал, что инкубация зонда FRET с ингибитором лейкоцитарной эластазы (LEI) при pH 4,8 в течение 24 часов привела к его расщеплению с образованием отчетливых флуоресцеиновых амидитов, или FAM, и тетраметилродамина, или TAM, меченных фрагментов разной длины. Размер и маркировка изделий спайности указывали на конкретные надрезы вблизи вершин обеих шпилек в зонде, что соответствует уникальному рисунку фрагментации, полученному с помощью кода LEI и отличающемуся от такового у DNase II. Эмиссионные спектры обработанных кодами LEI FRET показали максимальное изменение сигнала при pH 5,2, за которым последовал pH 4,8, а затем pH 5,5, что указывает на пиковую активность ДНКазы в этом кислотном диапазоне без значительной активности в контрольном образце. Количественный анализ соотношений FRET подтвердил, что LEI проявлял значительно более высокую активность при pH 5,2, чем при pH 4,8, и оба показателя были заметно выше, чем при pH 5,5, при этом активность резко снизилась выше pH 5,5.