Заражение корней картофеля паразитическими нематодами in vivo и in vitro для оценки индуцированных структурных изменений

В протоколе описано заражение корней Solanum tuberosum паразитическими нематодами растений в тепличных условиях in vivo и трансгенных корней картофеля in vitro для гистохимического анализа структуры корней с помощью оптической микроскопии.

Исследования паразитарных инфекций нематод в сельскохозяйственных культурах зависят от изменчивости условий окружающей среды, что может существенно повлиять на результаты экспериментов и воспроизводимость данных.

Мы разработали in vitro культуры трансгенных корней картофеля с паразитическими нематодами растений в качестве надежной альтернативы, которая занимает меньше места, требует меньше времени для получения, а также не подвержена загрязнению или генетической изменчивости хозяина.

Отслеживание временного прогрессирования инфекции нематоды в корнях сельскохозяйственных культур остается сложной задачей. Методы дифференциального окрашивания обеспечивают надежный метод идентификации очагов инфекции и точного различения стадий жизни нематоды.

По сравнению с тепличными испытаниями, тяжелые корни картофеля поддерживают непрерывную и контрольную систему для обеспечения всех стадий развития нематоды, независимо от сезонных или климатических изменений.

Таким образом, описанный протокол предлагает несколько многообещающих будущих применений. Например, это позволяет детально изучить молекулярные и клеточные механизмы, позволяющие понять, как паразитические нематоды растений заражают хозяев и манипулируют ими.

[Рассказчик] Для начала вымойте морковь под проточной водой из-под крана, а затем с помощью обычного моющего раствора, чтобы удалить мусор. После сушки бумажным полотенцем вставьте стерилизованную металлическую шпажку в верхнюю часть моркови примерно на один-два сантиметра внутрь. С помощью моющей бутылки с насадкой намочите морковь 96% этанолом. Промокните нижний кончик моркови на стерилизованной фильтровальной бумаге. Затем осторожно пропустите его через пламя. Стерильной овощечисткой очистите морковь сверху вниз и повторите обжиг. Отбросив верхнюю и нижнюю части, поместите среднюю часть в стерильную чашку Петри. С помощью стерильного лезвия и пинцета отрежьте срезы толщиной в один сантиметр. Переложите срезы в стерильные чашки Петри. После запечатывания тарелки подержите ее под ультрафиолетовым светом в течение 60 минут с каждой стороны для стерилизации морковных дисков. Инкубируйте морковные диски при температуре 25 градусов Цельсия в темноте в течение одной-двух недель. Затем стерильным лезвием сделайте Х-образный надрез в центре морковного диска, разрезая только наполовину. Пипеткой в разрез впрыскивают 50 микролитров суспензии корневого поражения нематоды, содержащей не менее 50 смешанных жизненных стадий. Запечатав чашку Петри, выдержите ее при температуре 25 градусов Цельсия в темноте до трех месяцев. Чтобы извлечь поражение корня нематоды, переложите морковные диски с видимым некрозом на сито с ячеями 75 микрометров диаметром восемь сантиметров, помещенное в стерильную стеклянную посуду. Далее налейте на сито раствор антибиотика до тех пор, пока диски не будут покрыты. После ночной инкубации в темноте с помощью стерилизованной пипетки перенесите нематод со дна миски в стерилизованный стеклянный витражный блок. Нанесите пипеткой один миллилитр раствора антибиотика в красящий блок и дайте нематодам осесть в течение 30-40 минут. Отпижите использованный раствор антибиотика пипеткой и повторите процесс промывания четыре-пять раз. Используйте суспензию корневого поражения нематоды немедленно, или храните при температуре 11 градусов Цельсия. Выберите картофельные клубни одинакового размера и выбросьте те, у которых есть дыры, помятости или мягкие срезы. Наполните пятилитровые горшки смесью автоклавной почвы и песка один к одному и добавьте 22,5 грамма удобрения NPK с медленным высвобождением. Затем посейте картофель на глубину до девяти сантиметров ниже поверхности почвы. Поместите горшки в теплицу с влажностью от 50 до 70%. Поливайте часто, чтобы поддерживать влажность почвы на уровне 70% от максимальной водоудерживающей способности, избегая перепадов температур. Как только картофельные растения взойдут, создайте равномерно распределенные четыре-шесть лунок вокруг каждого растения, чтобы увидеть глубину. Пипеткой восемь миллилитров суспензии, содержащей 30 000 живых нематод смешанной стадии поражения корня в отверстия. Затем засыпьте лунки почвенной смесью. Для борьбы с горшками и горшками, содержащими корневые поражения нематодами, следует воздержаться от полива в день прививки. После двух месяцев культивирования выкорчевайте растения картофеля и отделите побеги и корни для взвешивания. Тщательно промойте корневую систему. Изучите корни сайтов атак RLN с помощью соответствующих методов окрашивания. Вымытые и простерилизованные клубни картофеля поместите в контейнер. Накройте клубни 25% раствором отбеливателя. Закройте емкость и перемешивайте в течение 15 минут. После того, как отбеливатель будет утилизирован, трижды промойте клубни стерилизованной водой из-под крана. Далее в проточный колпак погрузите клубни в 80% раствор этанола на 15 минут при энергичном перемешивании. После дозирования этанола трижды промыть стерилизованной водой из-под крана. Стерильным скальпелем удалите периферийные участки клубней. Разрежьте внутреннюю центральную часть на сегменты толщиной 0,5 сантиметра. Для посева срезов сначала смешайте один миллилитр суспензии Rhizobium rhizogenes с девятью миллилитрами среды SH. Окуните кончик стерильного скальпеля в разведенную суспензию и обмотайте поверхность картофельных долек пять раз. После того, как сегменты высохнут, поместите их в полутвердую среду SH и инкубируйте при температуре 25 градусов Цельсия в течение трех дней в темноте, чтобы облегчить трансфекцию плазмид. В конце третьих суток перенесите инфицированные сегменты в пластины, содержащие полутвердую среду SH с добавлением антибиотиков. Через три месяца с помощью стерильного пинцета соберите кластер трансгенных корней весом в один грамм. Перенесите корни в центр пластины со свежей полутвердой средой SH без антибиотиков. Чтобы собрать из нематоды яичные массы, получить корневые галлы. Используйте пару стерильных ультратонкоточечных пинцетов, чтобы осторожно извлечь яйцеклетки под бинокулярным стереомикроскопом с 20-кратным увеличением. Поместите яичные массы в закрытую чашку Петри, содержащую пять миллилитров стерильной водопроводной воды, и дайте им вылупиться в течение 48 часов. Затем в проточном колпаке пипеткой нанесите пять миллилитров суспензии J2, содержащей 100 нематод на миллилитр, на сетчатое сито с ячейкой 20 микрометров. После промывки стерильной водой из-под крана погрузить нижнюю половину сита, содержащего нематоды J2, в 20% раствор перекиси водорода, и перемешивать круговыми движениями в течение 15 минут. Слейте стерильную воду из-под крана через сито над нематодами и повторите процесс промывания два раза. Наклоните сито так, чтобы нематоды собрались на границе во время окончательной стирки. Затем пипеткой наберите один миллилитр стерильной сверхчистой воды с края сита для восстановления нематод. В проточном колпаке субкультурируйте один грамм трансгенных корней картофеля на SH-пластинах со 100 стерильными нематодами. Регулярно контролируйте кокультуру под инвертированным микроскопом при 100-кратном увеличении. Когда яичные массы станут заметными, подкультивируйте корни к новой SH средней пластине. Использование морковных дисков привело к увеличению популяций нематод в среднем в 100 раз в течение трех месяцев. У растений картофеля не наблюдалось видимых симптомов при численности популяции нематод с низким поражением корней. В коре корня после окрашивания кислотным фуксином наблюдалось несколько жизненных стадий Pratylenchus penetrans, что свидетельствует о проникновении в ткань и связанных с этим некротических поражениях, которые были хорошо видны на инфицированных участках. Развитие трансгенных корней картофеля показало первоначальный рост клеточной массы вдоль скальпелевых индуцированных ран в отделе клубней картофеля с последующим появлением трансгенных корней. В культуральной среде наблюдался устойчивый рост корней, и корневые пучки были успешно перенесены в свежую культуральную среду для продолжения роста. Трансгенные корневые культуры картофеля были успешно заражены молодью Meloidogyne chitwoodi второй стадии для создания сокультур растительных нематод. В инфицированных культурах наблюдались корневые галлы, содержащие взрослых самок и массы яиц. Галловые ткани, образованные Meloidogyne chitwoodi, были заметны после заражения трансгенных корней картофеля с четко выраженными стадиями развития и размножения нематод, включая формирование яичных масс и яиц.