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Grundlegende Methoden in der Zell- und Molekularbiologie

Diese Sammlung demonstriert die Ausführung grundlegender Techniken, die üblicherweise in zelluläre und Molekularbiologie verwendet werden.

  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    10:18
    Das Benutzen einer Zählkammer zum Zählen von Zellen

    Bei vielen biomedizinischen Experimenten muss die Zellanzahl bekannt sein, um genaue, reproduzierbare, und statistisch-relevante Daten zu erhalten. Daher ist es für einen erfolgreichen Biowissenschaftler wichtig zu lernen wie man Zellen zählt. Der häufigste Weg um Zellen zu zählen ist mit der Zählkammer – also mit einem Instrument mit zwei laserbeschrifteten Liniennetzen, das die Zellzählung von Teilproben mit Hilfe eines Lichtmikroskopscht. Diese Daten können dann verwendet werden, um die Gesamtanzahl von Zellen in einer experimentellen Probe zu bestimmen.Dieses Video zeigt wie man die Probenkonzentration angleicht, so dass man weder zu viele noch zu wenige Zellen zählt; wie man eine Zählkammer benutzt um eine ~10 μl Teilprobe zu zählen; wie man bestimmt welchen Quadranten des laserbeschrifteten Liniennetzes man für die Zählung benutzt; wie man die Gesamtzellzahl der experimentellen Probe berechnet, und wie man die Lebendzellzahl mit Hilfe von Trypanblau bestimmt. Außerdem erläutern wir bei welchen experimentellen Situationen eine genaue Bestimmung der Zellzahl nötig ist, einschließlich der Benutzung von automatisierten Zellzählern.

  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    09:45
    Verdaue mit Restriktionsenzymen

    Restriktionsenzyme oder Endonukleasen erkennen und schneiden spezifische DNA Sequenzen. Diese Enzyme treten in Bakterien als Abwehrsystem gegen Bakteriophagen auf – also Viren, die Bakterien infizieren. Restriktionsenzyme in Bakterien schneiden diese invasive Bakteriophagen-DNA, lassen aber die bakterielle DNA unangetastet weil dort Methylgruppen vorhanden sind.

    Dieses Video erklärt die grundlegenden Prinzipien der Restriktionsenzyme,nschließlich der Nomenklatur von Restriktionsenzymen, der Art der Erkennungssequenzen und welche Überhangstrukturen vorkommen. Wir stellen auch eine allgemeine Schritt-für-Schritt Anleitung bereit wie man einen Verdau ansetzt, einschließlich der notwendigen Reagenzien, der Reihenfolge in der die Reaktion angesetzt werden soll, und die häufigsten Inkubationsdauern und Temperaturen. Wir erläutern außerdem, dass es wichtig ist die Reaktion zu inaktivieren um unspezifische Aktivität zu vermeiden. Außerdem geben wir Hinweise zu dem Ansetzen von Reaktionen mit mehreren Restriktionsenzymen und wie man Kontrollen in dem Verdau verwendet.

  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    07:34
    DNA Ligationsreaktionen

    In der molekularen Biologie bezieht sich das Wort Ligase auf die Verknüpfung von zwei DNA Fragmenten durch die Bildung einer Phosphodiesterbindung. Ein Enzym, das auch DNA Ligase genant wird, katalysiert die Ligasereaktion. In Zellen reparieren DNA Ligasen DNA Einzel- oder Doppelstrangbrüche, die während der Replikation auftreten. Im Labor wird die DNA Ligase in der molekularen Klonierung verwendet, um ein DNA Fragment mit einem Vektor (alsoA Moleküle welche die DNA Fragmente in Wirtszellen replizieren) zu verknüpfen.Dieses Video ist eine Einführung in die DNA Ligation. Die grundlegenden Prinzipien einer Ligation als auch eine Schritt-für-Schritt Arbeitsanleitung für eine allgemeine Ligationsreaktion werden erläutert. Die wichtigen Aspekte einer Ligation werden erklärt, zum Beispiel wie die Länge eines klebrigen Endes die Reaktionstemperatur beeinflusst und wie das Verhältnis zwischen dem DNA-Fragment und dem Vektor moduliert werden kann um die Selbstligation des Vektors zu verhindern. Molekulare Werkzeuge, die man bei einer Ligation verwenden kann, wie zum Beispiel das Klenow-Fragment und die Shrimp Alkalinphosphatase, werden erwähnt, und Anwendungen wie zum Beispiel Ligationen von DNA-Fragmenten nach PCR-Amplifizierung und die Anhängung von DNA Linkern um DNA Fragmente zu sequenzieren, werden erläutert.

  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    07:28
    Eine Einführung in die Transfektion

    Eine Transfektion ist der Prozess durch den man genetisches Material, wie zum Beispiel DNA oder doppelsträngige RNA, in Säugerzellen einfügt. Die Einfügung des Gens ermöglicht die Expression von Proteinen durch die zelleigene Maschinerie, wohingegen RNA in einer Zelle genutzt wird um die Expression eines Proteins durch das Hemmen der Translation zu verhindern. Die transfizierte RNA ist hauptsächlich im Zytoplasma aktiv, wohingegen die DNA für fiziente Transfektion in den Nukleus transportiert werden muss. Dort kann die DNA dann entweder transient (also für eine kurze Zeit) exprimiert werden, oder in die genomische DNA eingefügt werden und dadurch an Tochterzellen weitergegeben werden.Dieses Video beschreibt die Grundlagen, die hinter der chemischen Transfektionen stehen, und behandelt einige der am häufigsten verwendeten Reagenzien, einschließlich elektrisch geladener Liposomen, Polymeren und Calcium-Phosphat. Wir beschreiben jeden Schritt wie man Zellen für eine Transfektion vorbereitet bis zu wie man die Transfektionseffizienz bestimmt. Zusätzlich beschreibt der Anwendungsteil des Videos alternative Methoden für die Transfektion, wie zum Beispiel Elektroporation und biolistische Transfektion. Es wird außerdem eine fortgeschrittenen Technik beschrieben, in der man siRNA und DNA in einen Zelle gleichzeitig einfügt, um ein zelleignes Protein zu hemmen und dann die Funktion eines mutierten Proteins zu untersuchen.

  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    08:47
    Der Western Blot

    Ein Western Blot wird benutzt, um spezifische Proteine in einer elektrophoretisch aufgetrennten Probe nachzuweisen. Nach der Auftrennung mit Hilfe eines Verfahrens das “Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese”, oder SDS-PAGE, genannt wird, benutzt man einen Westerntransfer um Proteine aus dem Polyacrylamidgel auf eine Membran zu übertragen, welche die Proteine in ihrer Position festhält. Danach wird die Membran mit Antikörpernert – ein Prozess der auch Immunblotting genannt wird. Beim Immunblotting finden Antikörper-Protein und Antikörper-Antikörper Bindungen durch spezifische Bindungsseiten statt, wodurch die hohe Spezifizität die gebraucht wird um ein einzelnes Protein nachzuweisen, sichergestellt wird. Die Detektion von Antikörpern findet mit Hilfe von Reportersystemen statt, welche die Benutzung von Enzymen einschließen. Diese Enzyme sind an einem Ende des Antikörpers angebracht und reagieren mit Substraten um Farb- oder Lichtänderungen zu bewirken. Diese Signale können dann abgebildet und mit Densitometrie quantifiziert werden.Dieser Videoartikel präsentiert einen Überblick über die Western Blot Methode und beschreibt einen Westerntransfer, die Benutzung von Antikörpererkennung und Bildanalyse. Die Schritte im Westerntransfer, wie zum Beispiel der Aufbau des “Sandwiches” und die Transferbedingungen, sowie die Theorie hinter der Antikörperbindung und wie man diese Antiköper erkennt, werden im Det

  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    06:29
    Gelaufreinigung

    Die Gelaufreinigung wird verwendet um DNA Fragmente nach elektrophoretischer Auftrennung zurückzugewinnen. Die DNA Rückgewinnung besteht aus 3 einfachen Schritten: dem Binden, Waschen und der Eluierung aus der Silica-Säule. Die DNA bindet das Silica durch Salzbrücken, wenn hohe Salzkonzentrationen vorhanden sind. Nach dem Binden wird die DNA gewaschen um Verunreinigungen wegzuspülen, und dann unter niedrigeren Salzbedingungen, welche diebrücken unterbrechen, eluiert. Dieses Video gibt eine Schritt für Schritt Anleitung eines allgemeinen Verfahrens, welches das Ausschneiden und die Auflösung des Gelstücks, die Aufreinigung der DNA durch deren Bindung an die Silica-Säule, und die nachfolgende Eluierung, beinhaltet. Zusätzlich dazu geben wir einige nützliche Hinweise für eine erfolgreiche Gelaufreinigung, wie zum Beispiel das Laufen des Agarose-Gels mit einem Marker oder einer DNA-Leiter, um die genaue Größe des DNA Fragments zu bestimmen.

  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    08:16
    Plasmidpräparation

    Die Plasmidpräparation ist ein Verfahren, mit dem man Plasmid-DNA von der bakteriellen genomischen DNA, Proteinen, Ribosomen und Zellwänden trennt und aufreinigt. Ein Plasmid ist ein kleines, ringförmiges, doppelsträngiges DNA Molekül, das als Träger bestimmter DNA Moleküle benutzt wird. Wenn sie in Gastorganismen durch Transformation eingefügt werden, können Plasmids repliziert werden, wodurch vielfache Kopien des DNA Fragmentsn.In diesem Video stellen wir ein Schritt-für-Schritt Verfahren vor, mit dem man Plasmide isoliert. Plasmidpräparationen beinhalten 3 Schritte: das Wachsen der bakteriellen Kultur, dem Ernten und der Lysierung der Bakterien, und der Aufreinigung der Plasmid-DNA. Dieses Video erklärt wo sich die Plasmid-DNA in jedem Schritt des Protokolls befindet und wie man die Plasmid-DNA quantitativ und qualitativ mit einem Spektrophotometer oder mittels Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Es gibt verschiedene Arten von Plasmidpräparationsverfahren, die auf die Ausbeute, den Replikationsursprung und das bakterielle Kulturvolumen ausgerichtet sind.

  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    10:06
    Das ELISA Verfahren

    Ein Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) wird normalerweise gemacht um die Anwesenheit und die Menge eines Zielproteins in einer experimentellen Probe nachzuweisen. Der Nachweis des Zielproteins passiert durch Antikörper, was den ELISA zu einen Immunverfahren macht. Durch eine Reihe von Inkubations- und Waschschritten erkennen die Antikörper, die oft an ein Enzym gekoppelt sind, ein Protein das an der Oberfläche einer Mikrowellplattet. Wenn es mit einem Substrat in Berührung kommt, bewirken die antikörpergebundenen Enzyme einen Farbwechsel, wodurch die Anwesenheit des Proteins angezeigt wird. In diesem Video wird die Theorie hinter einem ELISA erklärt, einschließlich von primären und sekundären Antikörpern und der erforderlichen Blockierschritte. Danach folgen praktische Anwendungen mit Schritt-für-Schritt Anleitungen. Dann führen wir Variationen des ELISA Verfahrens ein, wie zum Beispiel den “Sandwich-ELISA” oder den kompetitiven ELISA. Außerdem erläutern wir Anwendungen des ELISAs, wie zum Beispiel freiverkäufliche Schwangerschaftstests.

  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    12:18
    Transformation von Bakterien: Elektroporation

    Das Wort Elektroporation bezieht sich auf die Aufnahme von Fremd-DNA von Zellen. Transformationen können ganz natürlich in Bakterien vorkommen. In der molekularen Biologie kann die Transformation jedoch künstlich erzeugt werden, indem man kleine Poren in die bakterielle Zellwand einführt. Bakterien, die DNA aus ihrer Umgebung aufnehmen können, nennt man kompetente Bakterien. Elektrokompetente Zellen können im Labor produziert werden. Dieformation dieser Zellen kann mit Hilfe eines elektrischen Feldes, das Poren in die Zellwand einführt durch welche die DNA eingeschleust wird, durchgeführt werden.Dieses Video erklärt die Geräte, die für die Elektroporation notwendig sind, wie zum Beispiel den Elektroporator und die Küvette. Dieses Video zeigt auch eine Schritt-für-Schritt Anleitung wie man elektrokompetente Bakterien herstellt und wie man diese elektroporiert. Wir erwähnen außerdem wie man den Erfolg der Elektroporation durch das Messen der Zeitkonstante einschätzen kann und wir sprechen darüber, dass es wichtig ist Salz aus allen Lösung vor der Elektroporation zu eliminieren.

  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    11:00
    Transformation von Bakterien: die Hitzeschock-Methode

    Die Transformation ist ein Prozess, bei dem Bakterien Fremd-DNA aus ihrer Umgebung aufnehmen.

    Transformationen können in bestimmten Bakterien von Natur aus auftreten. In der molekularen Biologie wird der Transformationsprozess durch das Einfügen von Poren in die bakteriellen Zellmembranen künstlich im Labor reproduziert. Bakterielle Zellen, die DNA aus ihrer Umgebung aufnehmen können, werden auch kompetente Zellen genannt. Im Labornen bakterielle Zellen kompetent gemacht werden. Danach kann die DNA durch eine Methode, die Hitzeschock-Methode genannt wird, in die Zellen eingefügt werden.Die Hitzeschock-Methode beruht auf eine durch Kalziumchlorid bereitgestellte kalziumreiche Umgebung, die dazu führt, dass die elektrostatischen Abstoßungskräfte zwischen der Plasmid-DNA und der bakteriellen Zellmembran ausgeglichen werden. Ein plötzlicher Temperaturanstieg erzeugt Poren in der Zellmembran der Bakterien, durch welche die Plasmid-DNA in die bakterielle Zelle eindringen kann. Dieses Video erklärt ein Schritt-für-Schritt Verfahren wie man chemisch kompetente Bakterien herstellt, eine Hitzeschock-Transformation durchführt, die transformierten Bakterien kultiviert, und die Transformationseffizienz berechnet.

  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    07:29
    Proteinauftrennung mittels SDS-PAGE

    Die Natriumdodecylsulfat Polyacylamid-Gelelektrophorese, oder SDS-PAGE, ist ein häufig angewandtes Verfahren, um Proteingemische auf ihrer Größe basierend aufzutrennen. SDS, ein anionisches Tensid, wird benutzt um eine gleichmäßige Ladung um die ganze Länge des linearisierten Proteins, zu erzeugen. Durch das Beladen und Laufen des Polyacrylamid-Gels mit einem elektrischen Feld werden die Proteine, welche mit SDS umschlossen sind, aufgetrennt. ektrische Feld führt dazu, dass die mit SDS eingedeckten Proteine in Richtung der Anode migrieren, wobei größere Proteine langsamer als kleinere Proteine sind. Um die Größe der Proteine zu bestimmen, lässt mein einen Molmassen-Standard zusammen mit den Proben unter den gleichen Bedingungen in dem Gel laufen.Dieses Video präsentiert eine Einführung in das SDS-PAGE. Zuerst wird die Theorie, die hinter dem SDS-PAGE steht, erklärt, und dann eine Schritt-für-Schritt Anleitung gegeben. Außerdem erläutern wir verschiedene experimentelle Parameter, wie zum Beispiel die angelegte Spannung oder die Dichte des Polyacrylamid-Gels. Dann werden verschiedenen Methoden zur Färbung des Gels und Abwandlungen der Methode, wie die 2-D Gelelktrophorese, präsentiert.

  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    09:21
    DNA Gelelektrophorese

    Die DNA Gelelektrophorese ist ein Verfahren das benutzt wird, um DNA Moleküle aufzutrennen und nachzuweisen. Ein elektrisches Feld wird auf eine Gelmatrix, die aus Agarose besteht, angewendet. Geladene Partikel migrieren durch das Gel und werden dadurch nach ihrer Größe aufgetrennt. Die negativ geladenen Phosphatgruppen im DNA Rückgrat bewirken das die DNA Fragmente in Richtung der Anode migrieren – also der positive geladenenrode.Das Video erklärt den Mechanismus durch welchen die DNA Fragmente in dem Agarose-Gel aufgetrennt werden, und es stellt eine allgemeine Schritt-für-Schritt Anleitung zur Verfügung, wie man das Agarose-Gel vorbereitet, die Proben lädt, die DNA Fragmente visualisiert, und das Gel und den Laufpuffer richtig entsorgt nachdem das Experiment abgeschlossen ist.

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    13:27
    PCR: Die Polymerase-Kettenreaktion

    Die Polymerase-Kettenreaktion, oder PCR, ist eine Methode, bei der DNA durch das sogenannte Thermocycling – also das wiederholte verändern der Temperatur für einen bestimmten Zeitraum – amplifiziert werden kann. Durch die Benutzung einer thermostabilen DNA-Polymerase kann das PCR viele Kopien der DNA, von den DNA Bausteinen, die Deoxy-Nukleotidtriphosphaten, oder dNTPS, genannt werden, herstellen. Es gibt 3 Schritte in einem PCR: dieurierung, Hybridisierung, und Elongierung. Die Denaturierung ist der erste Schritt in dem Zyklus und bewirkt, dass die DNA durch die Unterbrechung der Wasserstoffbrückenbindungen schmilzt und dadurch Einzelstrang-DNA entsteht. Bei der Hybridisierung wird die Temperatur verringert, sodass sich die Oligonukleotidprimer an die Template-DNA binden können. Bei dem Elongierungsschritt synthetisisert die DNA Polymerase die neue, doppelsträngige DNA.Dieses Video gibt eine Einführung in das PCR Verfahren. Wir beschreiben die grundlegenden Prinzipien des PCRs und geben eine Schritt für Schritt Anleitung, um eine allgemeine PCR Reaktion anzusetzen. Das Video beschreibt außerdem die benötigten Komponenten, zeigt wie Primer entworfen werden, und gibt nützliche Hinweise, um eine erfolgreich PCR Reaktion anzusetzen.

  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    10:01
    Das Subkultivieren von Zellen

    Zelllinien werden häufig in biomedizinischen Experimenten benutzt, da sie eine schnelle Kultur und Expansion von verschiedenen Zellarten für die experimentelle Analyse bereitstellen. Zelllinien werden unter ähnlichen Bedingungen kultiviert wir frisch isolierte, oder primäre Zellen. Es gibt jedoch ein paar wichtige Unterschiede: Zellinien benötigen ihre eigenen spezifischen Wachstumsfaktormischungen und ihr Wachstum muss im Gegensatz zuären Zellen häufiger kontrolliert werden, da sie Mutationen haben, welche es ihnen ermöglichen schnell und unbegrenzt zu wachsen, was zu Überwucherungen führen kann. Deshalb muss man Zellen, welche die Mehrheit der Oberfläche der Zellkulturschale bedecken, also circa 90% konfluent sind, resuspendieren, waschen, experimentell nutzen, für die spätere Benutzung einfrieren, oder eben in neue Zellkulturbehälter subkultivieren.Dieses Video zeigt wie man die Indikatoren in dem Nährstoffmedium benutzt, um die Zellgesundheit zu beurteilen, welche Reagenzien und Ausrüstung man braucht um sicher die adhärenten Zellen von der Kultur zu entfernen, und verschiedenen Methoden, um schnell expandierende Zellen in eine neue Kultur zu subkultivieren. Außerdem wird gezeigt wie Fütterzellen, die wichtig für das Bereitstellen von unentbehrlichen Wachstumsfaktoren für Zelllinien sind, kultiviert werden und wie man eine größere Anzahl von Zelllinienkulturen auf einmal produziert.

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    09:55
    Molekulare Klonierung

    Das molekulare Klonieren besteht aus verschiedenen Methoden, die benutzt werden um rekombinante DNA in einen Vektor – also ein Träger-DNA Molekül, das die rekombinante DNA in einem Wirtsorganismus vervielfältigt - einzufügen. DNA Fragmente, wie zum Beispiel Gene, können von prokaryotischen oder eukaryotischen Quellen isoliert worden sein. Nachdem das gesuchte Fragment isoliert worden ist, müssen sowohl der Vektor als auch das Fragment durchtionsenzyme geschnitten und danach aufgereinigt werden. Die aufgereinigten Stücke werden dann durch eine Methode, die Ligationsreaktion genannt wird, zusammengeklebt. Das Enzym, das die Ligation katalysiert, wird als Ligase bezeichnet.Dieses Video erklärt die verschiedenen Methoden, die nacheinander kombiniert werden, und damit das gesamte Klonierungsverfahren darstellen. Wir behandeln die wichtigen Aspekte der molekularen Klonierung, wie zum Beispiel die Notwendigkeit einer Klonierungsstrategie und wie man den Überblick über die transformierten Bakterien behält. Außerdem erwähnen wir die Validierungsschritte, wie zum Beispiel das Prüfen der Anwesenheit des DNA Fragments in dem auf gereinigten Plasmid durch Restriktionsverdaue und Sequenzieren.

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