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Métodos Básicos en Biología Celular y Molecular

Esta colección demuestra cómo ejecutar técnicas básicas comúnmente usadas en biología celular y molecular.

  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    10:18
    Usando un hemacitómetro para conteo de células

    Muchos experimentos biomédicos requieren manipulación de una cantidad conocida de células, con el fin de lograr exactos, reproducibles y los datos estadísticamente relevantes. Por lo tanto, aprender a contar las células es una técnica indispensable para cualquier éxito científico biomédico. La forma más común para contar las células es mediante un hemacitómetro - un instrumento que lleva dos rejillas grabado a láser, que ayudan a lae una alícuota células bajo un microscopio simple de luz. Esta información puede utilizarse entonces para extrapolar el número de células en la muestra experimental. Este video le mostrará cómo: ajustar la concentración de la muestra experimental por lo que no intenta contar demasiadas o demasiado pocas células; Cómo utilizar un hemacitómetro para contar una alícuota de pequeño (~ 10 μl) de las células; Cómo determinar qué cuadrante de la red de láser hemacitómetro para contar; Cómo calcular el número total de células en la muestra experimental, dependiendo de qué cuadrante fue utilizado; y cómo determinar la viabilidad de la población de la célula experimental mediante exclusión del azul tripán. Además, varias situaciones experimentales que confiable y precisa determinación del número de células es necesario, incluyendo un ejemplo usando un contador de células automatizado, también se discuten.

  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    09:44
    Resúmenes de la enzima de la restricción

    Enzimas de restricción o endonucleasas reconocen y cortan el ADN en una secuencia específica. Estas enzimas se producen naturalmente en bacterias como una defensa contra bacteriófagos - virus que infectan bacterias. Bacteriano enzimas de restricción cortan el DNA de bacteriófagos invasores dejando el ADN genómico bacteriano ileso debido a la adición de grupos metilo.

    Este video explica los principios básicos de las enzimas deción incluyendo: cómo se nombran las enzimas de restricción y los tipos de sitios de reconocimiento y proyecciones que existen. También es un procedimiento generalizado paso a paso de cómo configurar un repertorio de restricción incluyendo los componentes necesarios, el orden en el que la mezcla debe ser montada, y la temperatura de incubación típico y tiempo. Se menciona la importancia de enzimas inactivadoras de restricción para evitar que la actividad estrella. También se ofrecen consejos para realizar resúmenes de enzimas múltiples y uso de controles en las reacciones de la digestión.

  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    07:33
    Reacciones de ligadura de ADN

    En biología molecular, la ligadura se refiere a la Unión de dos fragmentos de ADN mediante la formación de un enlace fosfodiéster. Una enzima conocida como una ligasa cataliza la reacción de ligadura. En la célula, ligasas reparación de roturas del filamento solo y doble que se producen durante la replicación del ADN. En el laboratorio, ligase de la DNA se utiliza durante la clonación molecular para unir fragmentos de ADN de insertos con – las moléculas de ADN del portador que se reproducen fragmentos del destino en los organismos de acogida. Este video proporciona una introducción a la ligadura de la DNA. El principio básico de la ligadura se describe así como un procedimiento paso a paso para configurar una reacción generalizada de la ligadura. Se discuten los aspectos más importantes de las reacciones de ligadura, como cómo la longitud de una proyección final pegajoso afecta la temperatura de reacción y cómo la proporción de ADN coloca a vector debe ser adaptados para prevenir uno mismo-ligadura. Herramientas moleculares que ayudan con trompas como la fosfatasa alcalina fragmento Klenow y camarón (SAP) se mencionan, y aplicaciones como trompas de proximidad y la adición de conectores a los fragmentos de la secuencia también se presentan.

  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    07:27
    Una introducción a la transfección

    La transfección es el proceso de inserción de material genético, como el DNA y el RNA trenzado doble, en células de mamíferos. La inserción de ADN en una célula permite la expresión, o la producción de proteínas utilizando la maquinaria propia de células, mientras que la inserción de ARN en una célula se utiliza abajo-para regular la producción de una proteína específica deteniendo la traducción. Mientras que el sitio de acción transfectedsma, ADN debe ser transportado al núcleo para transfección eficaz. Allí, el ADN puede expresarse transitoriamente por un período corto de tiempo, o ser incorporado en la DNA genomic, donde el cambio se pasa de célula a célula como divide. Este video describe los conceptos básicos detrás de química mediadas transfecciones y presenta algunos de los reactivos más comúnmente utilizadas, como cargados lípidos, polímeros, fosfato de calcio. Se describe cada paso de la preparación de las células para la transfección a través del análisis de eficiencia de transfección. Además, la sección de aplicaciones de este artículo de video describe el uso de electroporación y una transfección biolística como métodos alternativos para introducir ácidos nucleicos en células de mamíferos. También describe un uso avanzado de la transfección donde co transfección de interferencia RNA y DNA se introduce como una forma abajo-para regular una proteína que ocurre naturalmente mientras que al mismo tiem

  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    08:47
    El Western Blot

    Western Blot se utiliza para identificar la presencia de proteínas específicas en muestras separadas electroforéticamente. Después de separación mediante una técnica conocida como electroforesis en gel de poliacrilamida sodio dodecil sulfato, o SDS-PAGE, transferencia occidental se utiliza para mover las proteínas de un gel de poliacrilamida en un pedazo de membrana que atrapa las proteínas en sus respectivos localizaciones. A continuación, anas son sondeadas con los anticuerpos en un proceso llamado immunboblotting. Immunoblotting utiliza anticuerpos de proteínas y de unión de anticuerpos anticuerpos a través de sitios de reconocimiento específicos, proporcionando la alta especificidad necesaria para la identificación de una sola proteína. La detección de anticuerpos lleva a cabo utilizando sistemas de reportero que incluye el uso de enzimas. Las enzimas pueden fijarse al final de un anticuerpo y reaccionan con los sustratos para producir cambios de color o luz. Estas señales entonces pueden ser reflejadas y cuantificados mediante un proceso llamado densitometría ósea. Este artículo de vídeo presenta un resumen de la técnica de inmunoblot describiendo transferencia western, el uso de la detección del anticuerpo y análisis de imágenes. Los pasos involucrados con la transferencia western como la Asamblea de los sandwich de transferencia y condiciones de transferencia se discuten en detalle, así como la teoría de

  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    06:29
    Purificación del gel

    Purificación del gel se utiliza para recuperar los fragmentos de ADN después de la separación electroforética. Recuperación de ADN de un gel de agarosa incluye tres pasos básicos: encuadernación, lavado y liberador de una columna de sílice. ADN se cree que se unen a la sílice en presencia de sal alta a través de un puente de sal. Siguiendo el enlace, ADN es lavado de impurezas y eluyen condiciones bajo sal interrumpir esta interacción.

    eo va a través de un procedimiento generalizado, paso a paso de cortar una banda de gel, gel de solubilización, purificación mediante el enlace a una columna de sílice y la elución de DNA purificado. Además, la presentación discute varios consejos para asegurar la purificación del gel de éxito, incluyendo la importancia de correr un gel de agarosa con un marcador o una escalera que tiene ADN de tamaño conocido.
  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    08:15
    Purificación del plásmido

    Purificación del plásmido es una técnica utilizada para aislar y purificar ADN de plásmido de ADN genómico, las proteínas, los ribosomas y la pared celular bacteriana. Un plásmido es un pequeño, circular, doble cadena de ADN que se utiliza como transportador de moléculas de ADN específicas. Cuando se introduce en un organismo anfitrión a través de la transformación, un plásmido se replicarán, creando numerosas copias del fragmento de DNA enp>En este video, se describe un procedimiento generalizado paso a paso de cómo realizar la purificación del plásmido. Purificación del plásmido incluye tres pasos básicos: crecimiento del cultivo bacteriano, cosecha y lisis de las bacterias y purificación del plásmido ADN. El video contiene una explicación donde puede encontrarse el plásmido en cada paso del protocolo y cuantitativamente y cualitativamente analizar ADN de plásmido con un espectrofotómetro o gel de electroforesis. Existen diferentes tipos de plásmido purificación los métodos disponibles, que están orientados a la producción deseada, número de copias del plásmido y volumen de cultivo bacteriano.

  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    10:05
    El método de ELISA

    Un análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) se realiza generalmente para detectar la presencia o la cantidad de una proteína diana de interés dentro de una muestra experimental. Detección de la proteína Diana es hecha posible por los anticuerpos, que hacen el ELISA de un inmunoensayo. A través de una serie de incubación y de pasos de lavado, estos anticuerpos, que con frecuencia están vinculados, o conjugado, a una enzima, detectaa capa el fondo de un pozo en una placa de microtitulación. Cuando se expone a un sustrato, enzima anticuerpo causará un cambio de color, lo que indica la presencia de la proteína de interés en la muestra. En este video, se explica la teoría detrás de cómo funcionan los ELISAs, incluyendo una discusión de tanto enlace con anticuerpos primarios y secundarios y la importancia de bloquear pasos. Teoría es seguida por la práctica, como el vídeo avanza a explicar el procedimiento paso a paso. Finalmente, las variaciones de la norma ELISA como el sándwich y Elisa competitiva son introducidas y reales aplicaciones de este método, tales como pruebas de embarazo de venta libre se explican.

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    12:18
    Transformación bacteriana: electroporación

    El término "transformación" refiere a la ingestión celular de ADN extraño. En la naturaleza, la transformación puede ocurrir en ciertos tipos de bacterias. En biología molecular, sin embargo, transformación es inducida artificialmente a través de la creación de poros en las paredes celulares bacterianas. Las células bacterianas que son capaces de tomar ADN del ambiente se denominan células competentes. Espectro de células se pueden el laboratorio y la transformación de estas células se puede lograr mediante la aplicación de un campo eléctrico que crea poros en la pared celular a través del cual el ADN puede pasar. El video explica el equipo utilizado en la electroporación como una cubeta electroporator y electroporación. El video también pasa a través de un procedimiento paso a paso sobre cómo crear células de espectro y electroporate las células de interés. Predicción del éxito de una transformación de un experimento, mediante la observación de la constante de tiempo, así como la importancia de eliminar la sal de las soluciones cuando electroporating, también se mencionan.

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    11:00
    Transformación bacteriana: El método de descarga de calor

    Transformación es el proceso que ocurre cuando una célula ingiere ADN extraño de sus alrededores. Transformación puede ocurrir en la naturaleza en ciertos tipos de bacterias. En biología molecular, transformación es reproducir artificialmente en el laboratorio mediante la creación de poros en las membranas celulares bacterianas. Las células bacterianas que son capaces de tomar ADN del ambiente se denominan células competentes. En elrio, las células bacterianas pueden hacerse competentes y ADN introducida posteriormente por un procedimiento llamado el método de choque de calor. Transformación de choque de calor utiliza un ambiente rico de calcio proporcionado por cloruro de calcio para contrarrestar la repulsión electrostática entre el ADN plásmido y la membrana celular bacteriana. Un aumento repentino en la temperatura crea poros en la membrana plasmática de las bacterias y ADN plásmido permite entrar en la célula bacteriana. Este video va a través de un procedimiento paso a paso sobre cómo crear bacteria químicamente competente, realizar transformación de choque de calor, placa de la bacteria transformada y calcular la eficiencia de transformación.

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    07:28
    Separación de proteínas SDS-PAGE

    Electroforesis del Gel de poli-acrilamida de sodio dodecil sulfato, o SDS-PAGE, es una técnica utilizada para separar mezclas de proteínas basadas en su tamaño y nada más. SDS, un detergente aniónico, se utiliza para producir una carga uniforme a lo largo de las proteínas que han sido linealizado. Primera carga en un gel hechos de poliacrilamida y aplicando un campo eléctrico sobre el gel, luego se separan proteínas SDS-revestida. El campoco actúa como la fuerza impulsora, dibujo las proteínas SDS cubierto hacia el ánodo con proteínas más grandes, más lentamente que las proteínas pequeñas. Para identificar las proteínas por tamaño, estándares de proteínas de tamaño conocido se cargan junto con las muestras y bajo las mismas condiciones. Este video presenta una introducción a SDS-PAGE primero explicando la teoría detrás de él y más tarde demostrando su procedimiento paso a paso. Se discuten diversos parámetros experimentales, como la concentración de poliacrilamida y voltaje aplicado el gel. Aguas abajo como Coomassie y plata manchas se introducen los métodos y variaciones del método de tinción, como 2D electroforesis en gel se presentan.

  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    09:21
    Electroforesis de DNA

    Electroforesis de ADN es una técnica utilizada para la detección y separación de las moléculas de ADN. Un campo eléctrico se aplica a una matriz de gel de agarosa, y dentro del gel, carga de partículas serán migrar y separar según el tamaño. Los fosfatos cargados negativamente de la espina dorsal de la DNA causan fragmentos de ADN avanzar hacia el ánodo - un electrodo cargado positivamente.

    El video explica el mecanismo por el que ADNs se resuelven en un gel de agarosa, y proporciona un procedimiento generalizado paso a paso de cómo preparar geles de agarosa, cargar muestras de ADN, un gel de DNA, visualizar fragmentos de ADN y deshacerse del gel y almacenador intermediario corriente concluido el experimento.

  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    13:27
    PCR: La reacción en cadena de polimerasa

    La reacción en cadena de polimerasa, o PCR, es una técnica utilizada para amplificar DNA a través de termociclaje rápido – cyles de cambios de temperatura en intervalos de tiempo fijo. Usando una polimerasa termoestable de la DNA, PCR puede crear numerosas copias de ADN de bloques de ADN llamado Dinucleósido trifosfatos o dNTPs. Hay tres pasos en PCR: desnaturalización, recocido y elongación. Desnaturalización es el primer paso en el ciclo el ADN derretir interrumpiendo enlaces del hidrógeno entre las bases en el ADN. Recocido disminuye la temperatura suficiente para permitir a la Unión de las cartillas del oligonucleótido a la plantilla de la DNA. Durante la elongación paso polimerasa de la DNA sintetiza nuevo ADN de doble hebra. Este video proporciona una introducción al procedimiento de PCR. Se describen los principios básicos de la PCR así como un procedimiento paso a paso para configurar una generalizada reacción de PCR. El video muestra los componentes necesarios para una reacción de PCR, incluye la instrucción para el diseño de la cartilla y proporciona consejos útiles para garantizar el éxito reacciones de PCR.

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    10:01
    Pases de células

    Las líneas celulares se utilizan con frecuencia en experimentos biomédicos, ya que permiten la rápida cultura y extensión de tipos de células para análisis experimental. Líneas de células se cultivan en condiciones similares en comparación con las células recién aislado, o primaria, pero con algunas diferencias básicas importantes: (i) células requieren sus propios cócteles de factor de crecimiento específico y (ii) su crecimiento debe serontrolar que las células primarias, como las mutaciones que les permiten ser cultivadas indefinidamente también pueden conducir rápidamente a su crecimiento excesivo. Por lo tanto, cuando una línea celular alcanza el punto de crecimiento en la cultura donde cubre la mayor parte de la parte inferior del contenedor de cultura, o sobre un 90% de confluencia, las células deben ser suspendidas, lavadas, utilizadas experimentalmente, congeladas para su uso posterior o volver a sembrar para expansión en recipientes nuevos de la cultura. Este video muestra cómo utilizar indicadores de medios de comunicación para determinar salud de la cultura de célula, que reactivos y equipos es útil para eliminar con seguridad líneas de células adherentes de cultura y diversos métodos para la transferencia de estos robusta expansión nuevas células en se discutirán las culturas. También son métodos de cómo las células de cultivos alimentador (importantes para proporcionar factores de crecimien

  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    09:54
    Clonación molecular

    Clonación molecular es un conjunto de métodos que se utilizan para introducir ADN recombinante en un vector - un portador de las moléculas de ADN que se replican fragmentos de ADN recombinante en los organismos huésped. El fragmento de ADN, que puede ser un gen, puede ser aislado de un espécimen de procariota o eucariota. Tras aislamiento del fragmento de interés, o insertar, el vector y el inserto deben ser corte con enzimas de restricción icados. Las piezas purificadas se unen entre sí, aunque una técnica llamada ligadura. La enzima que cataliza la reacción de la ligadura es conocida como ligasa. Este video explica los principales métodos que se combinan, en tándem, por el procedimiento de clonación molecular en general. Se discuten los aspectos críticos de la clonación molecular, como la necesidad de la estrategia de clonación molecular y cómo hacer un seguimiento de colonias de bacterias transformadas. También se mencionan los pasos de verificación, como comprobación de plásmido purificado para la presencia del inserto con resúmenes de la restricción y la secuenciación.

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