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生物化学精要

本系列介绍了常用的纯化方法, 如亲和层析, 以及分析方法, 如 MALDI。此外, 视频展示了评估生物相互作用和功能的方法, 如 co-immunoprecipitation 和代谢标记。

  • Biochemistry

    05:25
    透析: 基于扩散的分离

    透析是生物化学中用于分离分子扩散的常用技术。在这个过程中, 透膜允许某些分子基于大小的运动。这种方法可以用于去除缓冲, 称为脱盐, 或交换缓冲分子或离子从蛋白质溶液.

    本视频介绍了透析的原理和一般程序. 和 #160; 综述了几种透析方法的应用, 包括去除离心后的梯度试剂, 去除膜蛋白后的洗涤剂通过改变溶液环境来提取和重组蛋白质.

    生物化学样本通常具有较高的缓冲浓度, 可以破坏下游的处理和分析。透析是一种常见的, 廉价的技术用于分离分子的基础上扩散。该方法利用半膜, 允许基于大小的某些成分的移动。这个视频将显示透析的概念, 一个一般的程序, 以及它在生物化学中的一些用途.

    透析的最重要的方面是半膜, 它的毛孔会施加分子量的限制, 使分子低于一定的大小才能通过。例如, 10k 膜通常会保留大于 10 kilodaltons 的分子。然而, 分子量的截止不是一个离散或精确的边界。该膜通常含有广泛的孔隙大小,样品。一旦收集, 根据实验的性质, 可以对样品进行分析或进一步处理. 现在我们和 #39; 我看了一个一般的透析程序, 让和 #39; 我们看到了这种技术用于生物化学的一些方法. 密度梯度是分离复杂生物样品的常用方法。这个概念依赖于小颗粒的分布, 通常是蔗糖或氯化铯离子。一旦完成, 这些试剂通常需要删除之前, 收集的样本可以处理。透析可以利用纯化的样品进行未来的分析. 在细胞和 #39 的脂质双层中发现某些蛋白质, 通常通过散脂质囊的方法研究它们。首先用洗涤剂提取蛋白质和脂质。透析可以用来慢慢去除洗涤剂, 形成 proteoliposomes. 纯化后, 某些蛋白质错误或变性, 导致功能丧失。导致结构变化的化合物可以通过透析去除, 导致功能性分析的改革. 您和 #39; 我刚刚看过朱庇特和 #39 的透析视频。您现在应该了解这种扩散方法, 一个简单的实验过程, 以及使用此技术. 感谢收看!

  • Biochemistry

    08:06
    酶活性实验及动力学

    酶动力学描述的催化作用的酶,是促进化学反应生物体所需的生物分子。酶的作用,对分子,简称为底物,以形式的产品。通过直接或间接测量基板或产品浓度随着时间的推移变化的测定,确定酶动力学参数。

    这个视频将覆盖 (包括速率方程) 的酶动力学和动力学模型的基本原则。此外讨论了关于酶测定结果的概念,其次是典型的比色法测定。应用程序部分论述了福斯特共振能量转移 (FRET) 分析,表征胞外酶活性在环境中,通过酶法和调查 DNA 修复动力学使用分子探针。

    酶是生命来说是必不可少的生化催化剂。酶检测方法用于研究阐明酶的催化作用的酶促反应的动力学特性。这个视频将涉及酶动力学和化验,复习一般的程序,并显示一些应用程序.

    酶是蛋白质分子作用于反应物分子,称为基底。酶降低生化反应的活化能。这允许反应发生在更快的速率,与降低能源需求。

    酶促反应可以分为三个基本组件。第一是酶-底物的成因复杂,形成由基质酶活性位点的绑定。复合体可以分解成其原始的成分。这方案,以产生一种有色的化合物。吸光度测量,密谋反对浓度来生成的标准曲线。 若要执行检测,已知底物浓度的准备加上适当的酶。酶和底物混合并允许孵育设定的时间间隔。缓冲溶液并加热块的 ph 值和温度控制。猝灭剂添加停止反应。开发人员解决方案是添加到反应,然后混合。解决方案然后放在小试管和测定吸光度。底物消耗的量是通过比较测量吸光度标准曲线确定的。使用所收集的数据,初步反应速率取决于绘制浓度随着时间的推移。最后,浓度与速率数据,米氏情节了。这允许营业额数量和酶效率等酶的动力学性能的测定。 既然我们已经回顾了检测程序,让我们看看其他进行检测的方法和他们的应用程序。 在此过程中 FRET 分析方法来研究一种蛋白酶水解蛋白质肽键的动力学。这些排放量可以被测量,允许为衬底消费和生产的连续和定量的分析,协助确定反应动力学。 酶活性实验可以在环境科学中用于确定在环境中的胞外酶活性的水平。水、 土壤和沉积物可以收集从环境和在实验室中进行处理。胞外酶的活性,这些材料的特点然后可以使用酶测定结果。这是一个有用的工具,对于理解环境如何处理有机物质。 细胞核中发现的酶动力学研究,可以评价细胞 DNA 修复机制。率的一种酶中移除 DNA 损伤或损坏,可以测定荧光分子信标,只发出荧光,当绑定到独特的 DNA 序列。DNA 修复的水平可以通过检测荧光标记的裂解产品实时测量。 你刚看了朱庇特的视频对酶动力学和检测方法。这个视频说明酶动力学、 覆盖检测概念,走过去一般的程序,并描述某些应用程序。 谢谢观赏 !

  • Biochemistry

    07:26
    MALDI TOF 质谱

    基质辅助激光解吸电离 (MALDI) 是理想的生物分子分析中的质谱离子源。而不是电离气体状态的化合物,样品嵌入在一个矩阵,由激光触击。矩阵吸收的大部分能源;一些这种能量然后转移到样品,由于电离。然后可确定样品离子分析仪飞行时间 (TOF)。

    这部影片讲述了 MALDI TOF,包括矩阵的选择和如何使用 TOF 来澄清质量电荷比原则。此过程显示 MALDI 板,样品在盘子里,装卸操作的飞行时间质谱仪的制备。在最后一节,应用程序和变化显示,包括全细胞分析、 表征复杂的生物样品和电喷雾电离。

    基质辅助激光解吸电离或 MALDI,是理想的生物分子分析中的质谱离子源。大多数离子源删除大、 脆弱的生物分子的结构信息。MALDI 维护结构的完整性,并因此信息,同时加速分子质量分析器,分离化合物基于大小和电荷。最常见耦合与 MALDI 是飞行或质量分析器 TOF 的时间。本视频将显示在生化的 MALDI 电离,一般的程序,和一些它的用途的概念。

    对函备好第二个矩阵含三氟乙酸或反式脂肪酸,饱和的溶液。反式脂肪酸有助于离子进入气相。 接下来,该示例解决方案被加上干的矩阵点。添加包含 TFA 在样本,从而完成"三明治"矩阵的矩阵解决方案。可以验证均匀性的现场,低功耗的显微镜下。 板的校准标准,这是广泛已知质量的一种混合物,用来关联到 m/z 飞行时间。最后,板矩阵单独作为阴性对照。 要分析点,请将靶板放入仪器。确保没有碎片存在,允许紧真空的形成。在软件中,选择标准,消极控制和感兴趣的样品。标签具有正确识别点。 可以操纵的离子源和镜头电压提高性能的分析。这将取决于具体的工具和示例。专注于标准点和校准仪器与软件。 接下来,从每个样本点收集光谱。尝试几个不同的地点,当场要最大限度地收集数据的质量。一旦完成,MALDI 板可以收集和清洗后重复使用。 现在,我们已经检讨了程序,让我们看看一些 MALDI 被运用的方法和一种不同的电离技术。 除了生物分子,MALDI 可以用于分析的活细胞。巨噬细胞是免疫细胞,采用几种不同的形式,基于其微环境之一。后细胞暴露于各种信号分子或细胞因子,他们可以直接添加到盘子里,和分析。MALDI 谱可以作为唯一的"指纹",具体取决于使用的细胞因子。 复杂的生物样品,如哺乳动物的皮脂腺分泌物需要净化 MALDI 分析前一步。薄层色谱法是依赖组件的极性的其中一种技巧。化合物是收集从颈部薄层色谱法、 纯化,和转移到 MALDI 基质。由此产生的光谱核实身份和从哺乳动物的皮脂腺分泌物分离生物分子的纯度。 另一个常见离子源的生物分子是电喷雾电离或 ESI。在此方法中,样品注入的仪器,在那里施加高电压,创建的荷电液滴气溶胶。在液滴溶剂蒸发,电荷被搬到样品分子,直到他们完全气体。ESI 不需要的点样的程序,和样品可以直接注入的仪器。另一方面,ESI 是更敏感的存在缓冲区组件和其他污染物,这意味着 MALDI 更健壮。 你刚看了 MALDI 质谱的朱庇特的视频。这个视频描述仪器背后的理论,走过去一般的程序,和覆盖的一些技术的使用。谢谢观赏 !

  • Biochemistry

    07:08
    串联质谱

    串联质谱感兴趣的生物分子分离生物样本,然后分裂成多个亚基,帮助澄清其组成和序列。这被通过质谱仪在系列。第一次的光谱仪电离荷比特定质量取样和过滤离子。过滤的离子是支离破碎,然后传递给第二个的质谱仪分析碎片了。

    此视频介绍了串联质谱,包括质比选择和分离方法的原理。此外显示分析生化化合物的一般程序使用串联质谱与碰撞诱导解离。应用程序部分包括选择反应监测,测定蛋白质翻译后修饰和他克莫司血浓度的检测。

    串联质谱联结在一起的多级质谱对第一次分离的生物分子,,然后确定其化学组成方面。生物分子有大型、 复杂的结构,因此很难确定其分子组成。串联质谱选择分子后分裂成多个亚基,可以帮助澄清识别及其序列的兴趣。本视频将显示在生化的串联质谱的概念、 一般的程序,和一些它的用途。

    串联质谱开始作为一种典型的质谱文书:比。扫描所需的次数取决于信号强度的原始的前体离子和可以从 3 到 300。 在此示例中,脂质 A 从大肠埃希氏大肠杆菌 K-12,分析物后 CID 了 19 大片段。脂质 A 的一般结构是众所周知的允许软件重建从样品的具体构成。 现在,我们看过的程序,让我们看看一些生物化学用串联质谱的方法。 串联质谱中常见的扫描方式是选择的反应监测,或固体火箭发动机。在 SRM,这两个大规模分析仪被固定到所选的质量电荷比,侧重于具体的前体和产品离子。由于开关磁阻电机的高程度的敏感性,肽标准的已知浓度的光谱可以利用和相比,未知样品,允许利益量化的蛋白质。 蛋白质通常修饰后翻译,通常由官能团如甲基基团、 磷酸基团或糖,糖被称为加法。这些是重要的细胞信号传导过程,阐明细胞彼此的沟通。因为串联质谱碎片蛋白质成更小的组件,就可以确定到特定的片段或甚至氨基酸 PTM 的位置。一些修改,如乙酰化和 trimethylation,很难区分由大众独自一人,所以之前质谱进行色谱分离。 病人的血液中的很多分析物浓度低于典型的质谱检测的限制在被发现。开关磁阻电机的另一个优势是,它会放弃所有,但一个产品离子,提高灵敏度和检测下限提高达 100 倍。在此示例中,免疫抑制剂药物,他克莫司,可以检测到各级的 1ml 吴。 你刚看了串联质谱的朱庇特的视频。这个视频讨论了该仪器的原理、 走过去一般的程序,和解释了一些技术目前被利用的途径。谢谢观赏 !

  • Biochemistry

    07:38
    蛋白质结晶

    蛋白质结晶,获得一个坚实的格子的生物分子,阐明了蛋白质的结构,并使蛋白功能的研究。结晶涉及干燥组合的许多因素,包括 ph 值、 温度、 离子强度、 蛋白质浓度下的纯化的蛋白。一旦获得晶体,可以通过 x 射线衍射和电子密度模型计算阐明蛋白质结构。

    本视频介绍了蛋白质结晶和显示的一般程序。的过程中,涵盖了蛋白的表达和纯化、 结晶和 x-射线衍射。蛋白质结晶的应用包括在硅片药物设计、 绑定现场测定和膜蛋白结构分析。

    蛋白质结晶是获得格构式固体形式的一种蛋白质的过程。这些水晶是结构生物学家,协助蛋白功能的研究尤为重要。其他技术,如质谱法或 SDS-PAGE,只能提供信息的一维结构的蛋白质。蛋白质结晶被辅的重组蛋白的表达和 x 射线衍射技术。本视频将显示在生化领域的蛋白质结晶,一般实验室程序,和几个及其应用原则。

    在过程中所需的第一步是蛋白的获得毫克量的很纯,通常使用重组蛋白的表达。对应于感兴趣的蛋白质的基因表达载体,克隆并表决方案吸取到每口井,上方的架子上,然后托盘布满了透明胶带。托盘然后放在孵化室,并在井监视增长第二天,然后每隔几天。 一旦它获得了适当的水晶是准备 x 射线衍射分析。水晶被安装在测角仪定位在所选的方向位置的晶体。水晶被照明用的 x 射线在所有的角度,产生衍射图案单色光束。该软件将转换的二维图像,在不同的方向,对三维模型的测定原子在晶体中的位置晶体中的电子密度。 我们已经讨论了一种程序,让我们回顾一些有用的应用程序的蛋白质结晶和另一种结晶技术。 可用于蛋白质结晶硅药物设计中。流感病毒聚合酶碱性蛋白 2,其中已链接到病毒感染在哺乳动物中,三维结构测定结晶和 x 射线衍射。潜在的蛋白结合位点的可视化,并使用对接程序,设计了一个三维分子,会插入在蛋白质中的裂缝。 合作的结晶的蛋白质-DNA 复合物也是一个有用的技术。DNA 结合蛋白调节种类繁多的生物功能,如转录和 DNA 聚合和 DNA 修复;和这些配合物的晶体结构可以洞察蛋白质的功能、 机制及特异性相互作用的性质。大肠杆菌蛋白 SeqA,负性调节因子的 DNA 复制,是与半甲基化 DNA 位共同结晶。 一体式膜蛋白质如 G 蛋白偶联受体或 GCPRs,很难结晶由于其数量有限的极性表面积供形成晶体的晶格接触,导致融合蛋白辅助蛋白质结晶的发展。编码 β 2 肾上腺素能受体、 GCPR 和溶菌酶基因被插入表达载体。Β2AR 溶菌酶融合蛋白质结晶过程被达到由于增加胞外亲水表面自然疏水 β2AR,提供的溶菌酶,成型包装的相互作用在晶体点阵的必要条件。 你刚看了朱庇特的视频对蛋白质结晶。这段视频描述其原则、 广义的议定书 》,和一些及其在生物医学领域的应用。谢谢观赏 !

  • Biochemistry

    07:50
    基于色谱的生物大分子分离纯化方法

    在生物化学领域,基于色谱的分离纯化方法来隔离从复杂混合物的化合物。两个常用的生物化学家这种方法有尺寸排阻色谱法及亲和层析。在尺寸排阻色谱中,挤满了多孔珠列分隔组件基于的混合料大小。另一方面,亲和层析可允许更具体分离的生物分子所使用的固定相,其中包含特定于目标的配体组成的列。

    这个视频被作为导论尺寸排阻以及亲和层析,并管理他们的概念。所述的组氨酸标签的蛋白质固定化金属离子亲和色谱纯化的分步过程。这两种色谱方法在生物化学和生物医学研究中的应用也被异形。

    "色谱"指的是广泛的方法用来隔离组件从一个复杂的混合物之前可以确定生物分子的性质和活动, 的一个重要步骤。每个色谱技术具有分离,根据样本矩阵和目标化合物的不同机制。这个视频将集中原则和操作的两种方法共同的生物化学: 和亲和尺寸排阻色谱法。

    尺寸排阻色谱法或 SEC 基于样品中的化合物的大小。向与多孔材料的列添加包含样品流动相: 固定相。样品中的分子可分为三个类别 1。

    分子太定到的配体。 一个品种是固定化金属离子亲和层析,"IMAC"的简称,在那里像镍或钴,粘金属配体,将绑定到组氨酸残基被修饰蛋白上。通过分子生物学技术,目标蛋白质生成的重复组氨酸残基,称作应运而生标记,将绑定到组氨酸的咪唑侧链通过金属。绑定后,蛋白质可以收集与免费咪唑通过反向作用具体洗脱,后来用在各种各样的下游应用程序。 现在,您已经看到亲和色谱的原理,让我们看看在实验室 IMAC 过程。 在 IMAC,固定相可以直接添加到混合物的流动相和样品,允许他标记蛋白的绑定。这个浆然后倒入的列,地方非绑定化合物滴入废物,虽然浆。浆料容器冲洗才能收集树脂残留和样品,添加到列。 树脂搅拌以确保绑定的组件自由流动。添加洗缓冲区有助于用水冲掉。一旦所有的未绑定的组件已被删除,废物被替换为一个容器,以收集目标蛋白。 含咪唑的缓冲区是添加、 搅拌,和允许休息要解除绑定的靶分子。咪唑将绑定到金属,替换和释放标记的蛋白质。收集了被释放的蛋白质,和重复咪唑步骤以确保总的集合。要进一步净化样品,可以在样品分析前运行秒。 现在,我们已经看到的理论和程序的这两种技术,让我们看看一些他们在生化领域应用的方法。 纯化目的蛋白的常见原因是研究及其在疾病中的作用。囊性纤维化是由囊性纤维化跨膜电导调节因子蛋白或 CFTR 缺陷引起的。成长与酵母中的他标记蛋白以后, 亲和性和尺寸排阻色谱法允许分离蛋白质,其次是其功能的研究。 在某些情况下,应运而生的标记的存在可以改变蛋白质的结构,从而影响其功能。另一个常见的标记是麦芽糖结合蛋白或 MBP,将绑定来绑定列中的直链淀粉。麦芽糖然后用于释放复杂。MBP 可以劈开然后删除与美国证交会产生纯所需的蛋白质。 你刚看了朱庇特的视频尺寸排阻及亲和层析。它覆盖技术的理论,走过去一般程序,并涵盖了一些技术的使用。 谢谢观赏 !

  • Biochemistry

    07:30
    二维凝胶电泳

    二维凝胶电泳 (2DGE) 是一种技术,可以解决数以千计的生物分子混合物。这种技术涉及被耦合在一起的两种不同分离方法: 等电聚焦 (IEF) 和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)。这身体分离化合物横跨两轴间的一种凝胶由其等电点 (电化学性能) 和其分子量。

    在这个视频程序包括 2DGE 和表征复杂蛋白质溶液组成的一般程序的主要概念。在应用程序部分,包括生物标志物检测疾病的启动和进展,监测治疗的患者和蛋白后翻译后修饰 (PTM) 的研究显示了这种技术的三个示例。

    二维,或 2D,凝胶电泳是一种技术,利用两种不同分离方法可以从单一的混合物分离数千种蛋白质。一个技术,SDS — PAGE 或钠十二烷基硫酸聚丙烯酰胺凝胶电泳,完全不能分开单独的复杂混合物。二维凝胶电泳夫妇 SDS — PAGE 对第二个方法、 等电聚焦或等电聚焦分离基于等电点,允许该决议可能所有蛋白质在细胞裂解液。本视频将显示原则的二维凝胶电泳、F 仪器上。高电流,和蛋白质开始迁移。 完成后的第一个维度,为 SDS-PAGE 凝胶铸造装置中。IPG 带被治疗放下来在 SDS 含平衡缓冲区中。电泳单位是电泳缓冲液加上准备好了。处理后的 IPG 条收集使用镊子,放置在凝胶板,顶部和密封与琼脂糖凝胶密封解决方案。电压源,然后将应用电场,举行直到快蛋白质凝胶的底部从 1 厘米。 完成后的电泳,蛋白质必须被可视化。传统上,这是由染色与考马斯亮蓝或银硝酸执行。感兴趣的蛋白质可能从凝胶转移和免疫印迹分析。 第二次的辨识方法涉及切除的蛋白质从凝胶,消化它们,比质谱法对它们进行分析。 现在,我们已经审查的程序,让我们看看一些二维凝胶电泳的用途。 这种技术最常见的用途之一是参与疾病的启动和进展的分子鉴定。二维凝胶电泳、 质谱,在病区与身体健康的人可以发现特定蛋白质向上或向下调节。 此外,二维凝胶电泳是反应的有用的进度病人对潜在的治疗药物。可能从各时相的治疗给药后患者取标本。以这种方式,再加上印迹或质谱分析的二维凝胶电泳可以检测蛋白质与消极的反应,如发炎; 关联或者缺乏蛋白质处于缓解状态。 二维凝胶电泳的另一个用途是在研究蛋白质结构和功能的翻译后修饰或 PTM,是补充蛋白质翻译后 mRNA。PTM 的可以调节各种功能,包括蛋白信号转导、 基因表达,或造成氧化损害。二维凝胶电泳是敏感的修改,例如甲基化或乙酰化作用,这可能会导致一个转变 pI 以及分子量。 你刚看了二维凝胶电泳的朱庇特的视频。这段视频描述技术,一个典型的实验程序,和几个及其在生物医学领域中的应用的原则。 谢谢观赏 !

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    08:27
    代谢标记

    代谢标记用来探测生化转换和修改发生在一个单元格中。这被通过使用模拟天然生物分子的结构的化学类似物。细胞利用其内源性的生化过程,生产标有的化合物的类似物。该标签允许成立为法团的检测及亲和标签,然后可以用来阐明使用其他生化分析技术,如 SDS — PAGE 和核磁共振的代谢途径。

    该视频介绍代谢标记和显示两个一般程序的概念。 第一个使用同位素标记法,来表征的一种蛋白质磷酸化。第二封面感光的标签来表征蛋白质-蛋白质相互作用的代谢标记也三个应用程序内介绍: 植物材料贴标 RNA 来衡量动力学,标签在胚胎发育中的糖。

    代谢标记用来探讨机械的一个单元格。这被通过使用化学类似物探测的生化变化和发生的修改。本视频将显示代谢标记,典型的原则,同位素和感光贴标过程和一些应用程序。

    可以使用一系列的战略进行代谢标记。在这里,我们将描述同位素、 感光,和生物正交标记。

    同位素标记法使用执行的结构类似物与对应的天然,化学完全相同,但有罕见32,用作模拟。必须采取适当措施防止电离辐射。这包括设置工作区域、 穿着适当的防护装备,以及检查放射性污染。一旦采取了安全措施,被制备含有同位素类似物的介质。从文化媒介是删除,替换成一个含同位素化学类似物,然后孵化。后孵化,细胞的裂解。裂解是收集和净化。 纯化后用 SDS-PAGE,然后转移到聚偏氟乙烯膜解决蛋白质。放射自显影由暴露膜 x 射线胶片和用荧光粉成像仪测量。免疫印迹用于测量聚偏氟乙烯膜相关蛋白水平。在此示例中磷酸化水平的富含亮氨酸重复激酶在 293T 细胞测定中合成。Autoradiogram 显示多少磷被纳入蛋白质。免疫印迹阐明了 LRRK 蛋白的水平。图像分析软件用于获取的蛋白质磷酸化水平的定量数据。 在这接下来的过程中,证明感光标签。首先,编写、 培养细胞。感光模拟是中期日志阶段添加到单元格和孵化。在此过程中使用了 p-benzoylphenylalanine。样本收集超过间隔,放在冰上。样品然后暴露,随着时间的推移获取快照的生化途径。感兴趣的蛋白质是经过提纯和解决使用 SDS — PAGE。 感光的标签策略用于标识与感兴趣的蛋白质进行交互的化合物。免疫印迹表明蛋白条带,表明高分子量蛋白质与辐照样品中存在。这些是从蛋白质-蛋白质相互作用在 UV 照射期间发生交联。 既然我们已经回顾了代谢标记程序,让我们看看一些过程的使用的方式。 代谢标记概念可以扩展到多细胞生物。植物生长在一个密封的环境,丰富的生产标记的植物材料的稳定同位素。含有碳-13 的二氧化碳被添加到存储模块,而氮-15 使用丰富的肥料。由此产生的收获的植物材料可以帮助回答问题关于碳和氮循环的生态系统。 标记使新合成的 RNA 分离旧 RNA。通过改变初始浓度的模拟,可以确定新的 RNA 合成反应动力学。结果表明,4 thiouridine 浓度影响多少新的 RNA 转录。此外,可以用分光光度计直接量化成 RNA 标签注册率。 使用双正交点击化学,可以标记在斑马鱼胚胎中的糖。鸡蛋被注射炔烃标签上糖结果标记化合物。在幼虫糖然后结扎对染料化合物在预期的发展阶段。在胚胎中的糖然后成像。不同时间点产生的糖可以通过标记在胚胎发育的不同阶段使用不同的颜色识别。 你刚看了朱庇特的视频

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    06:56
    电泳迁移分析法 (EMSA)

    电泳迁移分析法 (EMSA) 是用来阐明蛋白质与核酸之间的绑定的生化过程。在这种测定方法中混合了放射性标记的核酸和蛋白质测试。绑定通过凝胶电泳分离组件基于质量、 电荷和构象。

    该视频演示 EMSA 和一般的程序,包括凝胶和蛋白质的制备、 绑定、 电泳,检测的概念。覆盖在此视频的应用程序包括的染色质重塑的酶,包含 biontinylation,改性 EMSA 的分析与研究结合部位的细菌响应监管机构。

    EMSA,电泳迁移分析法,也被称为凝胶转移检测,是一个多才多艺和敏感的生化过程。EMSA 通过检测转移乐队在凝胶电泳中阐明了蛋白质和核酸之间的绑定。

    这个视频描述了 EMSA 的原则,所提供的一般过程,并探讨了一些应用程序。

    DNA 复制、 转录、 和维修,以及 RNA 加工是所有关键的生化过程。他们都涉及到蛋白质与核酸之间的绑定。许多严重的疾病和障碍都与此绑定中修改。EMSA。三缓冲溶液编写和添加蛋白质和探针。Ph 值应该是类似于生理条件和盐浓度足以防止形成弱键与非靶核酸蛋白。使反应进行 20-30 分钟在 4 ° c。 下一步是电泳。利用低离子强度和 ph 值类似,在结合反应中使用的缓冲区。它产生一种"锁定效应",稳定配合物,增加流动性,减少产生的热量。后电泳,凝胶组分转移到滤纸上。在一个黑暗的房间里,过滤纸然后暴露电影。如果蛋白绑定到探头,两个不同的标记的区域将在转让中可见。一个表示复杂和一个单独的表示未绑定的探针。这种蛋白质成功绑定到核酸分离演示 现在,我们已经看到的基本程序,让我们看看一些应用程序。 染色质是紧凑的复杂的 DNA 和蛋白质发现真核细胞。染色质重塑酶修改要打开到转录 DNA 的结构。随着这变化的复杂流动性,可以用 EMSA 来探索结合活性的酶。 标签的另一种方法充分利用了甲基转移酶与 DNA 相互作用。可以修改辅助因子,以永久绑定到 DNA 甲基转移酶通过。而不是标签与磷-32,辅酶共轭与生物素结合,这是有利的因为它不是放射性。因为辅酶是特定于站点在其附件中,它是有关的基因分型、 甲基化检测和基因传递。Biotinilated 核酸通过紫外荧光进行检测。 当环境刺激激活组氨酸激酶时,磷酸化"反应调节"。这反过来将绑定到 DNA,影响转录,可通过 EMSA 研究。例如,表现出弧菌寻常型反应调节要绑定到感兴趣的基因。EMSA 用于验证绑定发生。 你刚看了朱庇特的视频上电泳迁移分析法。现在,您应该了解其原理的操作,其过程和其主要的操作参数中的步骤。 谢谢观赏 !

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    08:48
    光度法蛋白的测定

    测量浓度是许多生化检测方法的基本步骤。光度法蛋白质测定利用这一事实,越样品含有吸光物质,少光将传送通过它。由于浓度与吸收之间的关系是线性的这种现象可以用于测量样品中的浓度在哪里是未知。

    这个视频的光度蛋白测定基础知识,介绍了布拉德福德测定和洛瑞法。视频中的过程将涵盖典型的布拉德福德测定。应用程序覆盖包括直接测量很小卷的核酸浓度和纯度进行了表征,耦合效率的一种仿生材料和另一种变异的光度蛋白测定使用雷染料的测定。

    样品中的蛋白质浓度测定的是在许多不同的生化分析的基本步骤。光度法测定可以用样本量太小。越多样本含有吸光物质,少光将传送通过它。这提供了吸收物质的定量测定。这些概念是如此根本的科学的文章,介绍的两种技术是在三个最常被引用文件中的所有时间。本视频将显示背后一些最常见的光度蛋白质的概念,测定技术、 执行的方式和如何对收集的数据进行分析。

    光度法蛋白测定基于浓度与光吸收能力之间的关系。这就是所谓的啤酒 —方法的数据分析是相似的我们将介绍,之后我们看看布拉德福德测定。 在这里,与牛血清白蛋白标准 96 孔板上进行布拉德福德蛋白测定。若要开始,BSA 股票解决方案做好准备。 未知的解决方案被稀释用去离子水,以确保浓度检测的范围之内。根据试剂,考马斯亮染料可能还需要稀释。然后,校准曲线是由 96 孔板中加入牛血清白蛋白标准设置的。 加去离子的水达到所需的浓度来生成标准曲线。未知的样品应添加到一式三份,确保采取准确的测量板。考马斯亮染料下一步添加到每个井,用吸管搅拌。 去离子的水被添加到空井作为一片空白,测量吸光度。等待 5 分钟染料要绑定后, 吸光度测量板阅读器在 590 毫微米。 现在,我们已经进行了几个检测方法,让我们看看如何来分析数据。每个光度蛋白质测定方法基于啤酒 — 朗伯定律。 标准测量吸光度用于创建校准曲线,然后用来确定未知样品的浓度。这条曲线可以手动绘制,虽然新的分光光度法工具将创建校准曲线,一旦测量了所有的标准。这些系统还将计算蛋白质浓度未知的样品进行分析。 既然我们已经讨论了如何分析光度法蛋白质测定数据,让我们看看一些利用这些程序的方法。 光度法蛋白质测定的原则也可以用于直接测量核酸浓度。Nanodrop 分光光度计接受样品的光学活性的基座上体积很小。然后测定吸光度,和系统自动确定核酸浓度。因为蛋白质和其他来源可以干扰测量,样品纯度分析确定了 280 到 260 nm 和 260 到 230 nm 吸光度比值。纯核酸通常产生大约 1.8 和大约 2.0 的比率为 DNA 和 RNA,分别。 光度法蛋白质测定也可以用于生产的仿生材料的灵感来自于自然,征求特定细胞的反应。重组的表面被绑定到聚苯乙烯珠子来模拟细菌吸附到宿主细胞。布拉德福德测定用于确定珠在仿生材料的生产重组粘附的耦合效率。 替代的光度蛋白质检测可以用于检测和表征蛋白抗菌药物。雷亮蓝 R 染料是以共价键键合到热杀死细菌。抗菌蛋白是染色溶液中孵化的。然后,离心分离样品,和吸光的上清液在 595 nm 衡量使用酶标仪。增加的吸光度,释放到标记的细菌,培养上清的可溶性染料是酶活性的定量测定。 你刚看了光度蛋白质测定的朱

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    08:41
    密度梯度超速离心法

    密度梯度超速离心法是一种常用的技术,用来分离和纯化生物大分子和细胞的结构。这项技术利用这一事实,悬浮稳定性高,是比溶剂密度的颗粒将泥沙,而那些不那么密集会浮起。为了分离生物分子内密度梯度,可以通过降低密度离心管分层液体建立情况下,高速离心用来加速这一进程。

    该视频将覆盖密度梯度超速离心法,包括演示、 创作以及蔗糖梯度超速离心法,分馏物收集样品制备过程的原则。应用程序部分讨论隔离多蛋白复合物核酸合成物,和使用氯化铯密度梯度分离的隔离。

    密度梯度超速离心法是常用的方法进行分离纯化生物化学实验的细胞结构。该技术使用高速、 或超,离心机无损分离密度梯度中的细胞成分。这个视频描述了密度梯度超速离心法的原则,提供的一般过程使用蔗糖梯度,并探讨了一些应用程序。

    让我们开始通过检查超速和密度梯度的原则。悬浮液含有颗粒液体溶剂中。由于重力,粒子密度比溶剂沉淀出来而那些比溶剂浮密度较低。差额越大,密度之间的粒子和溶剂,越快的分离。

    离心包含一步的过程。 离心法应尽快开始。将管置于转子,然后平衡通过在反对槽中放置的同等重量的空白解决方案。转子被摆在超速离心和密封系统。温度和转速和时间设置。典型值为 4 ° C,超过 100,000 x g 为 16 h 力。 离心后管撤出转子,注意保持它直立,不受干扰。不同的细胞组分有分割成离散乐队解决方案层之间。可以用注射器收集馏分。交替,管底部可以用精细、 消毒的针头刺破,流出收集在无菌试管中。现在已分离的细胞组成。可以将它们存储在-80 ° c。 现在,我们已经看到的基本程序,让我们看看一些应用程序。 典型的应用是在植物细胞中多蛋白质复合物的分离。在此示例中,配合物负责循环电子流被隔离从类囊体膜,该网站在光合作用的光反应。此过程使用离散解的 14 至 45%的蔗糖。离心法发生了 100,000 x g 为 14 h 在 4 ° c。 因为核酸是比蔗糖密度大,等密度离心法不能把他们分开细胞器无损。 使用不同的技术,称为"率纬向离心"。它将基于其沉积速率,取决于它们的密度,但其构象的细胞器分离出来。连续渐变用于分隔组件基于此属性。 程序步骤是类似于那些为等密度线例。在此示例中,核糖体 RNA 配合物孤立使用连续渐变的 5%至 20%,在 230,000 x g.离心离心后几个小时,以防止共沉淀中断。 密度的基础上,可以互相分离核酸链。 这是因为股富含鸟嘌呤和胞嘧啶密度比那些富含腺嘌呤和硫胺素。在这种情况下,梯度不能由蔗糖,因为蔗糖是密度小于核酸的密度。相反,我们会因为他们有足够的密度和粘度低,使用铯氯化渐变,通常从 1.65 至 1.75 g/毫升。 在这里我们看到浮游生物 DNA 被纯化使用连续铯氯化梯度。离心发生在真空条件下 18 小时超过 1,000,000 x g。 你刚看了朱庇特的视频上采用蔗糖密度梯度超速离心法。现在,您应该了解密度梯度是如何工作、 如何构建步骤梯度,以及如何装载和运行离心。谢谢观赏 !

  • Biochemistry

    08:07
    沉淀和拉下化验

    联合沉淀 (CoIP) 和下拉法是密切相关的方法, 以确定稳定的蛋白质-蛋白质相互作用。这些方法与沉淀有关, 这是一种将靶蛋白与游离蛋白抗体结合的方法。在 CoIP, 抗体结合蛋白本身绑定到另一个不与抗体结合的蛋白质, 这是一个分离过程, 保存蛋白质-蛋白质复合物。下拉法的区别是, 亲和标记的诱饵蛋白取代抗体, 亲和层析是用来分离蛋白蛋白复合物。

    这个视频解释 CoIP, 下拉化验, 并在实验室的实施。包括用于纯化和分析束缚蛋白的试剂、仪器和仪器, 涵盖了每种技术的 step-by 步骤协议。此外, 该视频的应用部分描述了一个研究 myxovirus 蛋白如何抑制流感核的过程, 通过下拉法对钙调素的作用进行了调查, 并对表征瞬态蛋白相互作用。

    蛋白质-蛋白质相互作用在多种生物功能中起着重要作用。大多数蛋白质-蛋白质相互作用和它们的生物效应尚待确定。联合沉淀, 或 CoIP, 和下拉法是两个密切相关的方法, 以及发现未知的蛋白质相互作用。 现在, co-immunoprecipitation 和下拉分析的原理已经讨论过了, 让我们看看他们的实验室程序。 首先让我们讨论 co-immunoprecipitation。对一系列的离心管, 添加了以下内容: PBS 缓冲剂和50% 蛋白 a-琼脂的溶液, 一种与抗体结合的树脂蛋白复合物。离心管被旋转以确保适当的分布, 然后用额外的 PBS 缓冲液冲洗树脂。细胞裂解物, 含有所需的蛋白质, 和2微克的抗体被添加到离心管, 和混合物是旋转1小时在4° c。这些珠子是用离心法颗粒的, 上清液被丢弃, 珠子 re-washed 三次, 用缓冲器除去 non-bound 蛋白。含有抗体-蛋白质复合物的念珠在减少 sds 页样本加载缓冲, 用于从抗体中去除复合物, 并通过 sds 页和免疫进行分析。 现在我们将讨论下拉化验的程序: "诱饵" 蛋白是用适当的亲和标记在质粒中表达的。在达到对数相生长后, 细胞被裂解, 然后离心。悬浮亲和-琼脂珠, 捕获生物素标记的 "诱饵" 蛋白, pipetted 成一个离心管。然后离心的珠子和上清小心地被抽走。然后用缓冲器、离心和清液去除珠子。 含有假定的 "猎物" 蛋白的细胞, 其对 "诱饵" 蛋白有亲和力, 可通过离心来收获。然后将上清液添加到含有该树脂的离心管中, 并在4° c 下孵育 3 h 在振动筛上。然后将树脂离心, 上清液除去, 树脂洗净以除去 non-bound 蛋白。将洗脱缓冲液添加到树脂中, 并在室温下孵育30分钟的混合物。然后对树脂进行离心, 用免疫分析了含有所需络合物的上清液。 现在我们已经复习了程序, 让我们来看看 co-immunoprecipitation 和下拉分析的一些有用的应用。 沉淀可有助于更好地理解酶的作用机制。Myxovirus, 或 Mx-, 抗性蛋白抑制广泛的病毒, 包括甲型流感, 其机制是不太了解。沉淀用于研究小鼠 Mx1 蛋白与流感核的相互作用。 下拉式分析在研究第二信使的作用方面证明是有用的, 它们是从细胞环境中传达信号的蛋白质。它们是信号通路的一个组成部分, 其中多种蛋白质相互作用以响应环境的提示。钙离子作为次级信使通过结合钙调素, 这反过来

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    07:04
    膜蛋白的重组

    重组是孤立的生物分子回到其原来的窗体或函数的过程。这是研究膜蛋白,使重要的细胞功能,并影响行为的附近血脂尤其有用。为了研究原位纯化的膜蛋白的功能,他们必须重组的将它们集成到人工脂质膜。

    该视频介绍膜蛋白重组概念和相关的手续,如使用洗涤剂,形成的人工泡使用脂类,纳入到人工的囊泡,分离蛋白和洗涤剂溶液中分离的蛋白质分离。最后,介绍了两个应用程序: 膜转运蛋白和重组的捕光色素蛋白的重组。

    重组是将孤立的生物分子还原到其原始的窗体或功能的过程。在研究膜蛋白,使许多重要的细胞过程,并影响周边脂类的行为时,通常使用此方法。然而,细胞环境的复杂性使得膜蛋白的功能难以研究原位。这种蛋白质可以提取和纯化,但不膜不能评估其实际的功能。因此,孤立的膜蛋白是重组的人工脂质膜,如脂质体的融入。这个视频将介绍膜蛋白重组,一般重组过程中和在生物化学中的几个应用的原则。

    细胞膜主要由磷脂和膜蛋白组成。磷脂形成的亲水磷酸元首时与交互后结合蛋白。 洗涤剂然后删除聚苯乙烯珠、 透析或洗涤剂绑定列的吸附。由此产生的脂酶体准备纯化和使用在随后的实验。 既然你已经熟悉的一种膜蛋白重组程序基础知识,让我们看看几种应用蛋白质功能重建的生物化学。 膜运输蛋白重组更清楚瞭解其传输机制。与碘离子的一种流溢,验证了其功能后重建。然后,在各种小分子离子通道抑制剂和增强剂的存在下研究了运输活动。这种方式,可以研究这些小分子与转运蛋白的直接交互。 叶绿素和类胡萝卜素结合膜蛋白在植物光能、 促进电荷分离和减轻光损伤。通过重组这些捕光色素蛋白,可以研究它们折叠动力学和与颜料的互动。重组与这种技术的捕光色素蛋白有天然蛋白质光学属性非常相似。荧光发射光谱法可以用于研究从颜料到重组捕光色素蛋白能量传递。 你刚看了朱庇特的视频上的膜蛋白的重组。重建是重要的蛋白质转移到细胞模仿作进一步调查。这个视频覆盖蛋白重组,重组协议和在生物化学中的几个应用的原则。谢谢观赏 !

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    06:38
    F 和 #246; rster 共振能量转移 (烦恼)

    F & #246; rster 共振能量转移 (苦恼) 是一种用于研究近距离生化相互作用的现象。在烦恼, 一个施主发光分子可以 non-radiatively 转移能量的受体分子, 如果其各自的发射和吸收谱重叠。能量转移和 #8212 的量; 因此, 样品和 #8212 的总体排放;d epends 在一个受体-施主对发光分子附近。焦虑分析与其他生物化学技术相结合, 获得了这一 #8220 的生物分子结构和相互作用的详细信息; 光谱尺. #8221;

    此视频介绍了烦恼分析的原则和概念。该程序的重点是准备样本的烦恼和方式来介绍和解释数据。最后, 应用包括通过标记细胞或蛋白质的部分来监测构象和细胞过程, 监测改变蛋白质结构的酶反应, 并利用焦虑来监测细胞表达的单体聚合.

    F 和 #246; rster 共振能量转移, 或烦恼, 是在发光分子之间的辐射能量转移, 并经常用于研究近距离的生物化学相互作用。只有当荧光分子间隔在10纳米之间时,在, 您理解了烦恼的背后的原则, 让 & #39; 我们来看看一个协议的概述, 以及一些介绍和解释数据的方法. 在实验之前, 感兴趣的生物分子 (通常是 DNA 或蛋白质) 是用荧光标记进行设计的, 使用的是分子结构技术. 和 #160; 介绍修改的常用方法遗传材料进入细胞包括转染和电穿孔. 然后, 这些细胞在荧光显微镜上进行了焦虑的可视化. #160, 例如, 分子可能被固定在一张分子烦恼的幻灯片上, 或者样品被装入油井进行高通量筛选. 然后, 对励磁激光器、显微镜和相关设备进行了准备。(A) 烦恼实验往往涉及强大的激光器;(B) 应使用适当的 PPE 和安全程序. #160; 然后将样品放在仪器中, 用激发激光器照明. 用于监视单元行为的实验, 使用显示差异或发射强度变化的彩色图像。施主和受体的发射强度被绘制在一起, 以跟踪随着时间的烦恼反应. 烦恼数据也可以安装到各种功能, 以进行更复杂的分析。根据实验, 数据可能会以多种方式呈现, 以此来最好地代表结果, 使烦恼成为一种灵活的实验工具. 现在您和 #39; 您熟悉运行和分析苦恼实验的基本知识, 让我们 #39; 我们来看看在生物化学研究中苦恼的一些应用. 烦恼可以用来研究构象变化或细胞过程的标记部分的蛋白质或细胞预测在10纳米之间的相互移动的烦恼对。例如, 蛋白质传感器是通过标记受体与一对荧光。焦虑反应是通过共焦显微镜实时监测的。发射波长和强度的变化表明了构象的变化. 烦恼也可以用来准备分子与积极的烦恼对和观察变化的反应。当基体被劈开时, 烦恼就会被打乱, 导致施主的排放增加, 并减少受体的排放。对排放进行分析, 以确定捐助者, 承兑人, 和烦恼。对青色和黄色荧光蛋白的直接排放因子进行计算后, 可以确定基体的浓度和动力学参数. 细胞设计用来表达含有两个烦恼对功能的单体, #39; 传感器和 #39; 这些单体之间的相互作用。如果这些单体的聚合被诱导, 就会出现焦虑反应。这可用于研究由 #39 引发的蛋白质聚集; 播种和 #39; 错误蛋白。在这里, 细胞被转与感兴趣的蛋白质的集合体, 孵育和分析与流式细胞仪. 您和

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    06:57
    表面等离子体共振 (SPR)

    表面等离子体共振 (SPR) 是无标签生物传感器背后的基本光学现象, 用来评估生物分子的亲和性、动力学、特异性和浓度。在 SPR 中, 生物分子之间的相互作用发生在一个由薄薄的金属层在棱镜上。生物分子的实时相互作用可以通过测量反射在金属下侧的光的变化来监测.

    该视频描述了 SPR 的基本概念, 以及它是如何用于分析和可视化生物分子相互作用的。接下来是一个样品制备和实验协议, 用于调查结合率利用 SPR。在应用部分, 对 spr 成像、局部 spr 和量子点增强 spr 进行了探讨.

    表面等离子体共振 (或 SPR) 是某些无标签生物传感器背后的基本现象, 用于评估生物分子的结合和吸附作用。需要标记的结合化验, 例如 ELISA, 可能是一个费时的过程, 并且也许改变分析物的功能。在 SPR 中, 生物分子之间的相互作用发生在一个特殊的传感器, 由薄薄的金属层在一个棱镜的表面。通过监测金属底部反射光的变化, SPR束缚率和其他动力学信息. 反射率数据也可用于 SPR 成像或 SPRi, 方法是将反射光定向到 CCD 探测器。这将产生整个传感器表面的高对比度图像。利用 SPR 和相关技术, 可以回答有关分子亲和性、动力学、特异度和浓度等问题. 现在, 您了解在 SPR 实验中测量的是什么, 让 & #39; 我们来看一个调查绑定利率的程序. 在开始该过程之前, 必须准备运行和示例缓冲区。运行缓冲区用于将配体沉积到传感器上, 并使用样本缓冲区来存放分析物。传感器芯片被仔细地清洗并且被装载入鞘。然后, 该设备被放置到仪器, 它成为流细胞的底部。为实验和后续分析建立了仪器软件。如有必要, 传感器表面上配有衬底以捕获配体。所述配体流经传感器表面, 在所述运行缓冲器上, 在传感器表面上由所述基板捕获. 然后, 样本缓冲区中的分析物通过流动单元运行, 在这里它有选择地绑定到固定的配体。对反射率的变化进行了绘制和比较对照, 以确定速率常数和其他反应动力学数据的调查反应. 现在您了解了 spr 实验是如何执行的, 请 #39; 我们来看看在生物化学中 spr 的其他一些应用. 在这里, SPR 成像被用来评估蛋白质与阵列的十一受体在传感器上. 根据每种蛋白质的反射率数据, 制备了3D 反射率与时间和受体浓度的关系图。这些和 #34;p rofiles 和 #34; 是每个蛋白质的特征, 因此可以随后用于蛋白质鉴定. 在本实验中, 使用 custom-made LSPR 传感器对细胞分泌物进行了研究。该传感器还兼容 SPRi 和荧光显微镜。在传感器上沉积细胞后, 可以用高空间分辨率测量细胞分泌物与纳米粒子阵列的相互作用. 在这里, 量子点的使用, 纳米半导体, 作为 SPR 信号增强剂混合与分析物进行了研究。这种增强和 #34; 纳米 SPRi 和 #34; 方法与标准 SPRi 和 ELISA 法进行了比较。纳米 SPRi 法大大提高了检测的灵敏度和限制, 同时也比 ELISA 方法的耗时少. 您和 #39; 我刚刚看了朱庇特和 #39 的表面等离子体共振的视频。这种现象被用来监测和图像生物分子的相互作用, 而不使用标签。

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