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细胞分子生物学中的基本方法

该集合演示了如何执行在细胞和分子生物学中普遍使用的基本技术。

  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    10:18
    使用细胞计数板计数细胞

    许多生物医学实验为了得到精确,可重复性,且有统计意义的数据,需要操作已知数目的细胞。因此,了解如何计数细胞是任何一个成功生物医学科学家要掌握的尤为关键的技术。计数细胞最常用的方法是使用细胞计数板-它是一种有两个激光蚀刻网格的工具,用来帮助在简单的光学显微镜下计数取样细胞。得到的数据可以用来推算出实验样品中细胞的数目。

    本短片将演示:如何调整实验样品浓度避免计数过多或过少的细胞;如何使用细胞计数板来计数微量(10μl)

  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    09:45
    限制性内切酶消化

    限制性酶或内切酶会识别并切开DNA上的某个特定序列。这些酶在细菌中天然存在,用来抵御感染细菌的病毒-噬菌体的攻击。细菌中的限制性内切酶会切开入侵噬菌体的DNA,而细菌本身的DNA由于有甲基化,将不会受到影响。

    本短片讲述了限制性内切酶的基本原理:内切酶是如何命名的,已有的酶切位点和突出端类型。并将讲解常用的限制性内切酶消化的逐步操作过程,包括所需组分,添加各组分到混合物中的顺序,以及常用的消化温度和时间。还将提及灭活限制性内切酶来抑制非特异性活性的重要性。短片还给出了操作多酶消化及酶切中使用对照的小技巧。

  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    07:34
    DNA连接反应

    分子生物学中,连接是指通过形成磷酸二酯键将两个DNA片段连起来。连接反应是由一种叫连接酶的酶催化进行的。在细胞内,连接酶用于修复在DNA复制过程中的单链或双链的断裂。在实验室里,DNA连接酶用于分子克隆来连接插入片段和载体-它是宿主生物内复制目的片段的DNA载体分子。

    本短片介绍了DNA连接。讲述了连接的基本原理以及准备一个常用的连接反应的逐步步骤,并讨论了连接反应中的关键因素,例如粘末端突出端的长度对反应温度的影响,如何调整DNA插入片段与载体的比例来防止自身连接。还将提及辅助连接的分子生物学工具如Klenow片段和虾的碱性磷酸酶SAP,并讲述连接的应用,例如邻位连接和为测序在片段上添加接头序列。

  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    07:28
    细胞转染介绍

    转染是将遗传物质如DNA和双链RNA导入到哺乳动物细胞内的过程。将DNA导入细胞使得它可利用细胞自身的细胞机制表达和合成蛋白质,将RNA导入细胞则是用来通过终止翻译来降低某特定蛋白的合成。转染的RNA在细胞质中发挥作用,DNA则需被转运到细胞核中从而达到有效的转染。在核内,DNA会被短暂表达或整合到基因组DNA而将该遗传改变传代到下一代细胞。

    本短片讲述了化学转染的基本原理,介绍了一些最常用的试剂,包括带电荷脂质体,聚合物和磷酸钙。我们将讲解从准备转染的细胞开始到最后分析转染效率过程中的每个步骤。另外,本视频文章的应用部分还讲述了导入核酸到哺乳动物细胞的其他方法,电击转染和基因枪转染。它还介绍了转染的更进一步的应用,同时转染DNA和干扰RNA来下调某天然存在的蛋白并同时引入该蛋白的突变体到同一细胞。

  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    08:47
    蛋白免疫印迹杂交

    蛋白免疫印迹杂交用来鉴定电泳分离的样品中是否存在某特定蛋白。样品通过聚丙酰胺凝胶电泳,也称SDS-PAGE得到分离后,再通过凝胶转移将蛋白质从聚丙酰胺凝胶转移到一张膜上,这样可将蛋白质固定在其特定的分离位置。接下来,用抗体对膜进行杂交,这一过程称之为免疫杂交。免疫杂交是通过抗体与目标蛋白、以及抗体与抗体之间特定识别位点的结合来实现,它的高特异性使得可以鉴定单一蛋白。对抗体的识别则用含酶的报告系统来完成。酶结合在抗体的末端,与底物起反应产生颜色或者光的变化。这些信号会被捕捉成像,并可用光密度计量学对其进行定量。

    本视频文章将通过讲解凝胶转移,抗体识别和图像分析来全面介绍蛋白免疫印迹技术。将重点讨论凝胶转移步骤中的关于如何搭建转移三明治和凝胶转移条件、以及抗体结合与抗体识别的基本原理。 我们还将举例说明该技术的广泛应用,

  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    06:29
    凝胶纯化

    胶纯化用于回收电泳分离的DNA片段。从琼脂糖凝胶中回收DNA包括三个基本步骤:在硅胶柱上进行结合,清洗和洗脱。高盐环境下,DNA会通过盐桥结合到硅胶上,清洗掉不纯的物质后,再用低盐条件破坏这种相互作用从而将DNA洗脱下来。

    本短片讲述了常用胶回收的基本步骤,从胶中将DNA带切割出来,溶解胶,用硅胶柱结合并洗脱下纯化的DNA。此外,该短片还讨论了要保证胶回收成功的几个技巧,包括跑胶中用上已知分子量大小的DNA标准样的重要性。

  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    08:16
    质粒纯化

    质粒纯化是将质粒DNA与基因组DNA、蛋白质、核糖体以及细菌细胞壁分离开的一种技术。质粒是小的环状双链DNA,用作特定DNA分子的载体。当质粒通过转化技术导入宿主细胞后,将被复制产生大量拷贝的DNA片段用于研究。

    本短片讲述了常用的质粒纯化的逐步过程。质粒纯化包括三个基本步骤:细菌的培养,细菌的收集和裂解,质粒DNA的纯化。视频还解释了操作过程每一步中质粒在哪里会被发现,以及如何用分光光度计和电泳对质粒进行定量和纯度的分析。目前有多种质粒纯化的方法,可以根据所需质粒的产量,质粒的拷贝数目和细菌培养的体积来进行选择。

  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    10:06
    酶联免疫吸附测定法

    酶联免疫吸附检测(ELISA)通常是检测实验样品中是否存在某目的蛋白,以及该目的蛋白的量。目的蛋白的识别归功于抗体,因此ELISA是一个免疫检测。这些抗体通常偶联了一种酶,经过一系列的孵育,洗脱步骤,它们将检测到包被在多孔板孔底部的蛋白。当底物存在时,偶联在抗体上的酶将造成颜色改变,这说明样品中存在目的蛋白。

    本短片将讲解ELISA的工作原理,其中讨论了一抗与二抗结合,以及封闭步骤的重要性。在接下来的练习中,视频演示了其逐步操作过程。最后介绍了标准ELISA的几种变化形式,如三明治ELISA和竞争ELISA,以及该方法的实际应用,例如非处方的测孕试纸

  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    12:18
    细菌转化:电穿孔法

    "转化”这一术语是指细胞摄入外源DNA。自然界中,某些类型的细菌可以发生转化。而在分子生物学中,可通过在细菌细胞壁上穿孔来人工诱导转化。能够从环境中接受DNA的细菌细胞被称为感受态细胞。可在实验室制备电穿孔感受态细胞,并通过施加电场在细胞壁上形成小孔让DNA穿过来转化这些细胞。

    本短片讲解了用于电穿孔转化的设备,如电转化仪和电击杯。视频也演示了如何制备电穿孔感受态细胞和用电穿孔转化目的细胞的逐步步骤。也提到了通过观察时间常量来估计转化实验是否成功和电穿孔时去除掉溶液中的盐离子的重要性。

  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    11:00
    细菌转化:热激法

    转化是指细菌从外部环境摄入外源DNA的过程。自然界中,某些类型的细菌可以发生转化。而在分子生物学中,可通过在细菌细胞壁上穿孔来人工诱导转化。能够从环境中接受DNA的细菌细胞被称为感受态细胞。可在实验室制备感受态细胞,随后通过一种叫热激法的技术来转入DNA。

    热激转化利用氯化钙来产生富含钙离子的环境,从而抵消质粒DNA和细菌细胞膜之间的静电排斥。温度的急剧提高可以在细菌胞膜表面形成小孔,质粒DNA就可进入细菌细胞。本短片逐步介绍了如何制备化学感受态细菌。如何进行热激转化,涂板转化的细菌,以及计算转化效率。

  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    07:29
    用SDS-PAGE技术分离蛋白

    十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳,也称SDS-PAGE,是一种被广泛使用,仅根据分子量大小来分离蛋白质混合物的技术。 阴离子去污剂SDS,在变性的线性蛋白表面沿长度均匀分布使其带电。 将它们上样到聚丙烯酰胺凝胶后, 施加电压,这些表面覆盖SDS的蛋白将被分开。电场作为驱动力,牵引SDS结合的蛋白朝阳极移动,分子量大的蛋白将比小的蛋白移动慢。为了判断蛋白的大小,已知分子量大小的蛋白质标准也会和样品一起上样并在同等条件下跑胶。

    本短片介绍SDS-PAGE技术, 首先将解释其背后的原理,然后演示每一步的操作过程。视频还将讨论实验中的各种参数,如聚丙烯酰胺浓度,和用于跑胶的电压。还会介绍电泳之后的考马斯亮蓝和银染色方法,以及其他电泳技术,如双向凝胶电泳。

  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    09:21
    DNA凝胶电泳

    DNA凝胶电泳是用来检测和分离DNA分子的一种技术。施加一个电场到由琼脂糖构成的凝胶基质上,凝胶中的带电粒子将根据其大小进行移动和分离。DNA骨架上带负电的磷酸集团会使得DNA片段移向阳极 – 它是带正电荷的电极。

    本视频解释了DNA片段在琼脂糖凝胶上分离的原理,

  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    13:27
    PCR: 聚合酶链式反应

    聚合酶链式反应,或称PCR,是一种通过热循环反应来扩增DNA的技术,热循环是指在固定的时间间隔内温度变化的循环。采用热稳定的DNA聚合酶,PCR可以用DNA的合成原料,脱氧核苷三磷酸合成大量的DNA拷贝。PCR反应包括三步,变性,退火,和延伸。变性是PCR循环的第一步,它将DNA碱基之间的氢键打开来熔解DNA双链而产生单链DNA。退火则是将温度降到足够低,使寡聚核苷酸引物能够结合到DNA模板上。在延伸过程中,DNA聚合酶将合成新的双链DNA。

    本短片将介绍PCR的过程。除了逐步讲述如何准备一个常用的PCR反应,还将描述PCR的基本原理。视频展示了一个PCR反应的所需组分,以及引物设计的规则,并给出了保证PCR反应成功的一些有用技巧。

  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    10:01
    基本的组织培养:细胞传代

    生物医学实验中常常会用到细胞系,因为它们可以快速生长和扩增提供实验分析要用到的细胞。细胞系与新分离的或原代细胞的培养条件相类似,但也有一些基本不同的地方:(1)每个细胞系需要其特定的生长因子混合物(2)与原代细胞相比,它们的生长需要更严密的监测,因为使它们无限生长的突变同时也会造成它们很快达到过度生长。因此,当细胞系生长到了几乎覆盖整个培养器皿底部,也就是90%的密度时,细胞需要重悬洗涤用于实验或冻存以备将来使用,或者重新接种到新的培养器皿进一步扩增。

    本短片将演示如何使用培养液指示剂来判断细胞培养的健康程度,安全转移贴壁细胞所需要的试剂和仪器,并将讨论转移这些快速增殖的细胞到新培养液中的不同方法。还将同时演示如何培养饲养细胞(这对提供细胞必需的生长于因子很重要)和如何大规模培养细胞系的方法。

  • Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

    09:55
    分子克隆

    分子克隆是将重组DNA插入到载体中的一套方法,载体作为DNA分子的携带者,将在宿主体内复制重组DNA片段。化该连接反应的酶被称为连接酶。本短片将按顺序介绍构成整个分子克隆操作过程的主要方法。并将讨论分子克隆技术的重要方面,例如分子克隆方案的必要性和如何追踪转化的菌落。也将提及其检测步骤,如用限制性酶切和测序来判断纯化的质粒中是否含有目的片段。

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