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Inmunología

Esta colección cubre muchas técnicas básicas de los laboratorios de inmunología, incluyendo el etiquetado y clasificación de células inmunitarias. También demuestra métodos de proliferación para células inmunitarias y anticuerpos, así como ensayos comunes para la actividad inmune incluyendo ELISA. Por último, demuestra la tinción y la toma de imágenes de muestras de tejido sinmunitaria y células.

  • Immunology

    17:07
    Clasificación de células activadas por citometría de flujo y fluorescencia (FACS): Aislamiento de linfocitos B esplénicos

    Fuente: Perchet Thibaut1,2,3, Meunier Sylvain1,2,3, Sophie Novault4, Rachel Golub1,2,31 Unidad de Linfopoyesis, Departamento de Inmunología, Instituto Pasteur, París, Francia2 INSERM U1223, París, Francia3 Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, París, Francia4 Flow Cytometry Platfrom, Citometría y Biomarcadores UtechS, Centro deas Traslacionales, Instituto Pasteur, París, Francia La función general del sistema inmunológico es defender el cuerpo contra organismos infecciosos y otros invasores. Los glóbulos blancos, o leucocitos, son los actores clave del sistema inmunitario. Tras la infección, se activan e inician una respuesta inmunitaria. Los leucocitos se pueden dividir en varias subpoblaciones (por ejemplo, células mieloides, linfocitos, células dendríticas) basándose en diferentes parámetros que pueden ser biológicos, físicos y/o funcionales (por ejemplo, tamaño, granularidad y secreción). Una forma de caracterizar a los leucocitos es a través de sus proteínas superficiales, que son principalmente receptores. Cada población de leucocitos expresa una combinación específica de receptores (por ejemplo, citotóxicos, activadores, receptores de migración) que pueden definir subconjuntos entre las poblaciones. Como el sistema inmunitario abarca una amplia gama de poblaciones celulares, es esencial caracte

  • Immunology

    11:35
    Clasificación de células activadas magnéticas (MACS): Aislamiento de linfocitos T timáticos

    Fuente: Meunier Sylvain1,2,3, Perchet Thibaut1,2,3, Sophie Novault4, Rachel Golub1,2,31 Unidad de Linfopoyesis, Departamento de Inmunología, Instituto Pasteur, París, Francia2 INSERM U1223, París, Francia3 Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, París, Francia4 Flow Cytometry Platfrom, Citometría y Biomarcadores UtechS, Centro deas Traslacionales, Instituto Pasteur, París, Francia La defensa contra los patógenos depende de la vigilancia del sistema inmunitario. Este sistema es complejo y comprende muchos tipos de celdas, cada uno con funciones específicas. Esta compleja composición permite respuestas inmunitarias a una gran diversidad de patógenos y lesiones. La inmunidad adaptativa permite respuestas específicas contra patógenos específicos. La mayoría de las células responsables de este tipo de inmunidad son los linfocitos (células B y células T). Por lo general, las células B responden a infecciones extracelulares (como infecciones bacterianas) y las células T responden a infecciones intracelulares (como infecciones virales). Los diferentes tipos de células en las poblaciones de linfocitos se pueden caracterizar por la combinación de proteínas de superficie celular que expresan y/o por un panel de citoquinas secretadas. La clasificación magnética permite el enriquecimiento de las poblaciones c

  • Immunology

    14:21
    Ensayos elISA: Indirecto, Sandwich y Competitivo

    Fuente: Whitney Swanson1,2, Frances V. Sjaastad2,3y Thomas S. Griffith1,2,3,41 Departamento de Urología, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 554552 Centro de Inmunología, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 554553 Programa de Posgrado en Microbiología, Inmunología y Biología del Cáncer, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 554554 Centro De Cáncerco, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 55455 El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) se utiliza con frecuencia para medir la presencia y/o concentración de un antígeno, anticuerpo, péptido, proteína, hormona u otra biomolécula en una muestra biológica. Es extremadamente sensible, capaz de detectar bajas concentraciones de antígenos. La sensibilidad de ELISA se atribuye a su capacidad para detectar las interacciones entre un único complejo antígeno-anticuerpo (1). Además, la inclusión de un anticuerpo específico de antígeno conjugado en enzimas permite la conversión de un sustrato incoloro en un producto cromogénico o fluorescente que puede ser detectado y fácilmente cuantificado por un lector de placas. En comparación con los valores generados por cantidades valoradas de un antígeno de interés conocido, se puede determinar la concentración del mismo antígeno en las muestras experimentales. Se han adaptado diferentes protocolos ELISA para medir las concentracio

  • Immunology

    11:53
    Ensayo ELISPOT: Detección de esplenocitos secretos de IFN-O

    Fuente: Tonya J. Webb11 Departamento de Microbiología e Inmunología, Facultad de Medicina de la Universidad de Maryland y el Centro Integral del Cáncer Marlene y Stewart Greenebaum, Baltimore, Maryland 21201

    ELISPOT es un ensayo estandarizado y reproducible que se utiliza para detectar respuestas inmunitarias celulares. El ensayo utiliza un método basado en el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) paraectar respuestas inmunitarias de una sola célula que pueden ser visualizadas por manchas, de ahí el nombre ELISPOT. ELISPOT fue descrito por primera vez en 1983, por Czerkinsky, como un método para enumerar el número de hibridaomas de células B que producen inmunoglobulinas específicas de antígenos (1). El mismo grupo desarrolló el ensayo para medir la frecuencia de los linfocitos T productores de citoquinas. Ahora ELISPOT se ha convertido en un estándar de oro para medir la inmunidad de células T específicas de antígenos en ensayos clínicos y candidatos a vacunas. Por ejemplo, después de la vacunación o durante una infección, las células plasmáticas y las células B de memoria secretan anticuerpos que proporcionan protección. Por lo general, estas respuestas de células B se evalúan midiendo los valoradores séricos de anticuerpos específicos de antígenos. Sin embargo, este tipo de análisis, normalmente medido por ELISA, puede no incluir células de memoria B, que pueden estar presentes i

  • Immunology

    13:23
    Inmunohistoquímica e Inmunocitoquímica: Imágenes de tejidos a través de microscopía de luz

    Fuente: Michael S. Lee1 y Tonya J. Webb11 Departamento de Microbiología e Inmunología, Facultad de Medicina de la Universidad de Maryland y el Centro Integral del Cáncer Marlene y Stewart Greenebaum, Baltimore, Maryland 21201

    La inmunohistoquímica (IHC) y la inmunocitoquímica (ICC) son técnicas utilizadas para visualizar la expresión y localización de antígenos específicos utilizando anticuerpos. Elo publicado de IHC fue en 1941 cuando Albert Coons utilizó la técnica para visualizar la presencia de antígeno neumocócico en secciones de tejido de ratones infectados con Pneumococcus (1). El nombre, inmunohistoquímica, se deriva de las raíces "inmuno-", en referencia a los anticuerpos, y "histo-", en referencia a las secciones de tejido utilizadas en IHC. La raíz "cito-" en inmunocitoquímica destaca la diferencia clave entre ICC e IHC. Mientras que IHC utiliza secciones de tejido entero, ICC utiliza células que han sido aisladas de tejido o cultivadas en cultivo. La diferencia en las muestras utilizadas significa que la preparación de muestras difiere técnicamente entre iHC y la CPI, pero de lo contrario los protocolos para ICC e IHC son idénticos y uno encontrará que los términos se utilizan con frecuencia indistintamente. Tanto en IHC como en ICC, los anticuerpos con etiquetas químicas o fluorescentes, como la peroxidasa o la rodamina, respectivamente, se utilizan p

  • Immunology

    13:20
    Generación de anticuerpos: Producción de anticuerpos monoclonales mediante hibridatos

    Fuente: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3y Thomas S. Griffith1,2,3,41 Programa de Posgrado en Microbiología, Inmunología y Biología del Cáncer, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 554552 Centro de Inmunología, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 554553 Departamento de Urología, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 554554 Centro De Cáncerco, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 55455 Los anticuerpos policlonales se definen como una colección de anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes antigénicos de un antígeno o varios antígenos (1). Si bien los anticuerpos policlonales son herramientas poderosas para identificar moléculas biológicas, hay una limitación importante: son incapaces de distinguir entre antígenos que comparten determinantes antigénicos. Por ejemplo, cuando se utiliza albúmina sérica bovina para inmunizar a un animal, las células B con diferentes superficies Ig responderán a diferentes determinantes antigénicos en la albúmina sérica bovina. El resultado es una mezcla de anticuerpos en el antisuero. Debido a que la albúmina sérica bovina comparte algunos epítopos con albúmina sérica humana en regiones evolutivamente conservadas de la proteína, este antisuero de albúmina sérica antibovina también reaccionará con albúmina sérica humana. Por lo tanto, este antisuero no será útil para di

  • Immunology

    09:55
    Microscopía de inmunofluorescencia: Tinción de inmunofluorescencia de secciones de tejido incrustado por parafina

    Fuente: Thomas Chaffee1, Thomas S. Griffith2,3,4y Kathryn L. Schwertfeger1,3,41 Departamento de Medicina y Patología de Laboratorio, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 554552 Departamento de Urología, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 554553 Centro De Cáncer Masónico, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 554554 Centro de Inmunología, Universidadinnesota, Minneapolis, MN 55455 Los análisis patológicos de las secciones tisulares se pueden utilizar para obtener una mejor comprensión de la estructura normal del tejido y contribuir a nuestra comprensión de los mecanismos de la enfermedad. Las biopsias de tejido, ya sea de pacientes o de modelos experimentales in vivo, a menudo se conservan fijando en formalina o paraformaldehida e incrustando en cera de parafina. Esto permite el almacenamiento a largo plazo y la sección de los tejidos. Los tejidos se cortan en secciones delgadas (5 m) utilizando un microtome y las secciones se adhieren a los portaobjetos de vidrio. Las secciones de los tejidos se pueden teñir con anticuerpos, que permiten la detección de proteínas específicas dentro de las secciones de tejido. La tinción con anticuerpos conjugados con fluoróforos (también conocidos como fluorocromos) - compuestos que emiten luz a longitudes de onda específicas cuando excitan por un láser - se conoce como inmunofluo

  • Immunology

    13:13
    Microscopía de Fluorescencia Confocal: Una Técnica para Determinar la Localización de Proteínas en Fibroblastos de Ratón

    Fuente: Dominique R. Bollino1, Eric A. Legenzov2, Tonya J. Webb11 Departamento de Microbiología e Inmunología, Facultad de Medicina de la Universidad de Maryland y el Centro Integral del Cáncer Marlene y Stewart Greenebaum, Baltimore, Maryland 212012 Centro de Ingeniería y Tecnología Biomédica, Facultad de Medicina de la Universidad de Maryland, Baltimore, Maryland 21201

    Lascopía de fluorescencia confocal es una técnica de imagen que permite una mayor resolución óptica en comparación con la microscopía de epifluorescencia convencional de "campo ancho". Los microscopios confocales son capaces de lograr una resolución óptica x-y mejorada a través del "escaneo láser", normalmente un conjunto de espejos controlados por voltaje (galvanómetro o espejos "galvo") que dirigen la iluminación láser a cada píxel de la muestra a la vez. Lo que es más importante, los microscopios confocales logran una resolución z-axial superior mediante el uso de un agujero para eliminar la luz de foco procedente de lugares que no están en el plano z que se está escaneando, lo que permite al detector recopilar datos de un plano z especificado. Debido a la alta resolución z alcanzable en la microscopía confocal, es posible recopilar imágenes de una serie de planos z (también llamados z-stack) y construir una imagen 3D a través de software. Antes de discutir el mecanismo de un m

  • Immunology

    13:46
    Técnicas basadas en inmunoprecipitación: purificación de proteínas endógenas mediante cuentas de agarosa

    Fuente: Susannah C. Shissler1, Tonya J. Webb11 Departamento de Microbiología e Inmunología, Universidad de Maryland, Baltimore, MD 21201

    La inmunoprecipitación (IP, también conocida como ensayo "pull-down") es una técnica ampliamente utilizada que tiene aplicaciones en una variedad de campos. Concebido por primera vez en 1984, fue refinado en 1988 (1, 2). El objetivo fundamental de la P.I. es laficación y el aislamiento de una proteína específica utilizando un anticuerpo contra esa proteína. La palabra "inmuno" se refiere al uso de un anticuerpo, mientras que la palabra "precipitación" se refiere a extraer una sustancia específica de una solución. La proteína diana puede ser endógena o recombinante. La mayoría de las proteínas recombinantes tienen una etiqueta de epítopo (es decir, mico o bandera) unida a ellas para simplificar la purificación posterior. Típicamente, es más fácil optimizar la proteína recombinante IP porque los anticuerpos contra las etiquetas de epítopos recombinantes son muy fuertes y eficaces. Los anticuerpos contra las proteínas endógenas tienen una eficacia extremadamente variable, lo que hace mucho más difícil optimizar estas IP. Un paso necesario después de la inmunoprecipitación es la verificación de la purificación. La proteína aislada se resuelve utilizando SDS-PAGE y posteriormente sondeada para la pureza por manchas occidentales (Figura 1). Un con

  • Immunology

    10:56
    Análisis del ciclo celular: Evaluación de la proliferación de células T CD4 y CD8 después de la estimulación mediante la tinción CFSE y la citometría de flujo

    Fuente: Perchet Thibaut1,2,3, Meunier Sylvain1,2,3, Sophie Novault4, Rachel Golub1,2,31 Unidad de Linfinfoesis, Departamento de Inmunología, Instituto Pasteur, París, Francia2 INSERM U1223, París, Francia3 Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, París, Francia4 Flow Cytometry Platfrom, Citometría y Biomarcadores UtechS, Centro deas Traslacionales, Instituto Pasteur, París, Francia El ciclo celular es un proceso universal de vida. Durante el ciclo celular, una célula sufre varias modificaciones para dividir en dos células hijas. Este mecanismo se produce a lo largo de la vida de un organismo en respuesta a sus necesidades. Las divisiones celulares y el desarrollo embrionario producen un organismo completo a partir de un cigoto unicelular. Durante la edad adulta, el ciclo celular es fundamental para muchos procesos biológicos críticos, como reparaciones de tejidos. Los mecanismos de división celular son eventos estrechamente controlados donde la célula sufre modificaciones escalonadas antes de la división final. Las celdas que aún no están en el ciclo se describen como en la fase de brecha 0 (G0). Durante esta etapa la célula se considera en reposo. Cuando la célula comienza a ciclo, se reconocen cuatro fases distintas: Brecha 1 (G1), Síntesis (S), Brecha 2 (G2)y Mi

  • Immunology

    11:03
    Transferencia celular adoptiva: Introducción de los cenocitos del ratón del donante a un ratón anfitrión y evaluación del éxito a través de FACS

    Fuente: Meunier Sylvain1,2,3, Perchet Thibaut1,2,3, Sophie Novault4, Rachel Golub1,2,31 Unidad de Linfopoyesis, Departamento de Inmunología, Instituto Pasteur, París, Francia2 INSERM U1223, París, Francia3 Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, París, Francia4 Flow Cytometry Platfrom, Citometría y Biomarcadores UtechS, Centro deas Traslacionales, Instituto Pasteur, París, Francia La transferencia de células adoptivas es un método para introducir células en un paciente u organismo de estudio con el fin de tratar una enfermedad o estudiar un proceso biológico, como la hematopoyesis. Los objetivos de la transferencia adoptiva son varios; se puede utilizar en biología fundamental, así como en ciencias médicas (1, 2). En los modelos de ratón, la migración y distribución de las celdas transferidas se puede estudiar y seguir un sistema de seguimiento (marcador de superficie celular, tinción por CFSE, etc.). En estudios de cáncer en modelos de ratón, la transferencia de poblaciones celulares específicas se puede utilizar como tratamiento experimental contra tumores. Otro ejemplo de esta técnica es la creación de ratones quiméricos mediante la transferencia de células de médula ósea a ratones irradiados o ratones con un fenotipo de inmunodeficiencia grave. Este modelo de ratón se puede utilizar para evaluar el

  • Immunology

    11:47
    Ensayo para la muerte celular: Ensayo de liberación de cromo de la capacidad citotóxica

    Fuente: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3y Thomas S. Griffith1,2,3,41 Programa de Posgrado en Microbiología, Inmunología y Biología del Cáncer, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 554552 Centro de Inmunología, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 554553 Departamento de Urología, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 554554 Centro De Cáncerco, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 55455 Una de las principales funciones de las células del sistema inmunitario es eliminar las células diana que han sido infectadas con virus o han sufrido transformación en una célula tumoral. Los ensayos in vitro para medir la capacidad citotóxica de las células inmunitarias han sido un elemento básico en los laboratorios durante muchos años. Estos ensayos se han utilizado para determinar la capacidad de las células T, células NK, o cualquier otra célula inmune para matar las células diana de una manera específica de antígeno o -no específico. Los ligandos de la muerte (por ejemplo, Fas ligando o TRAIL), las citoquinas (por ejemplo, IFNg o TNF) o gránulos citotóxicos (es decir, perforin/granzyme B) expresados por las células efectoras son algunas formas en que se puede inducir la muerte celular diana. Con la explosión en la investigación de inmunoterapia tumoral en los últimos años, hay un creciente interés en encontrar ag

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