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微生物学

该集合展示了微生物调查的关键工具,包括适当的无菌技术和电镀,如何使用选择性培养基和丰富样品,以及混合或纯样品的培养方法。此外,它着眼于识别微生物分离物的常见方法,以及细菌基因操作的程序。

  • Microbiology

    08:07
    创建维诺格拉茨基柱:在沉积物样本中丰富微生物物种的方法

    资料来源:伊丽莎白·苏特1,克里斯托弗·科尔博1,乔纳森·布莱泽11大学生物科学系,瓦格纳学院,1 校园路,纽约州斯塔顿岛,10301

    维诺格拉茨基柱是一个微型的封闭生态系统,用于丰富沉积物微生物群落,特别是那些参与硫循环的微生物群落。该柱在19世纪80年代首次由谢尔盖·维诺格拉茨基使用,此后应用于生物地球化学中涉及的多种微生物的研究,如光合体、硫氧化剂、硫酸还原剂、甲烷原、铁氧化剂、氮循环器,以及更多 (1,2)。

    地球上的大多数微生物被认为是不可培养的,这意味着它们不能被隔离在试管或培养皿(3)。这是由于许多因素,包括微生物依赖于其他代谢产物。维诺格拉茨基柱中的条件与微生物的自然栖息地(包括它们与其他生物的相互作用)紧密地模仿,并允许它们在实验室中生长。因此,这项技术允许科学家研究这些生物体,并了解它们对地球生物地球化学循环的重要性,而不必孤立地气到底层的零氧。含氧层称为有氧层,无氧层称为厌氧层。 在厌氧层中,许多不同的微生物群落可以增殖,这取决于可用的基质的类型和数量、初始微生物的来源和沉积物的孔隙度。在柱的底部,厌氧分解有机物的生物体可以茁壮成长。微生物发酵产生有机酸从纤维素的分解。然后,硫酸盐还原剂可以使用这些有机酸,利用硫酸盐氧化这些有机物,并生产硫化物作为副产品。如果沉积物变黑,硫酸盐还原剂的活性表示,因为铁和硫化物会反应形成黑色硫化铁矿物(图2,表1)。硫化物也会向上扩散,从而产生另一个梯度,其中硫化物浓度高在柱的底部,低在柱的顶部(图1)。 在柱的中间附近,硫氧化剂利用从上面供应的氧气和下面的硫化物。光合硫氧化剂在适当的光量下可以开发在这些层中。这些生物体被称为绿色和紫色硫细菌,通常显示为绿色、紫色或紫红色细丝和斑点(图2,表1)。绿色硫磺细菌对硫化物的耐受性较高,通常发展在紫硫细菌正下方的层中。紫硫细菌以上,紫无硫菌也可能发展。这些有机体使用有机酸作为电子捐赠者而不是硫化物进行光合,通常表现为红色、紫色、橙色或棕色层。非光合硫氧化剂可以发展在紫色非硫细菌之上,这些通常表现为白色细丝(图2,表1)。此外,在维诺格拉茨基列中也可能形成气泡。有氧层中的气泡表示蓝藻产生的氧气。厌氧层中的气泡很可能是由于甲烷原的活性,这种生物体有氧分解有机物,形成甲烷作为副产品。 列中的位置 功能组 有机体示例 视觉指示器 返回页首 光合成器 蓝藻 绿色或红褐色图层。有时是氧气的气泡。 非光合硫氧化剂 比吉亚托亚, 蒂奥巴奇鲁斯 白色图层。 紫色无硫细菌 罗多微比姆, 罗多斯皮里卢姆, 罗多普苏德蒙纳斯 红色、紫色、橙色或棕色图层。 紫色硫磺细菌 铬 紫色或紫色-红色图层。 绿色硫磺细菌 氯比 绿色图层。 硫酸盐还原细菌 脱苏尔福维布里奥、脱硫素、脱硫杆菌、脱硫菌

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    10:53
    连续稀释和电镀:微生物枚举

    资料来源:乔纳森·布莱泽1号,伊丽莎白·苏特1号,克里斯托弗·科博1号1大学生物科学系,瓦格纳学院,1 校园路,纽约州斯塔顿岛,10301

    鉴于原核生物的丰度、指数增殖倾向、种群内的物种多样性以及特定的生理需求,对原核生物的定量评估可能十分繁重。使这一挑战更加复杂的是细菌复制的四相性质(滞后、原木、静止和死亡)。准确估计微生物浓度的能力对于成功识别、隔离、培养和表征(6)是必要的。因此,微生物学家在一个多世纪以来一直采用连续稀释和各种电镀技术,在临床、工业、制药和学术实验室环境中可靠地量化细菌和病毒载量(2,4,6)。1883年,德国科学家和医生罗伯特·科赫(Robert Koch)发表了他关于致病剂(2)的著作。科赫的引种技术通常被称为现代细菌学之父,已成为全世界可培养或其他微生物的祭标标准。

    连续稀释是通过连续将初始溶液(溶液0)重新悬浮成液创建的解决方案1的 1 mL 等分,并将其添加到管 2 中。同位和再悬浮继续这种方式,直到达到最终管,稀释股票浓度每一步10倍。请点击此处查看此图的较大版本。 连续稀释是获得所需生物体的可管理浓度的最简单技术,辅以培养皿条纹和扩散,只是微生物学家使用的许多电镀技术中的两种。这种方法的好处是,实验者可以收获单个物种的纯菌株或与混合种群分离菌株(7)。条纹是通过将一个有机体引入固体介质(通常由甘蔗素组成)来完成的,如果适当的营养物质可用,它会生长在这种介质上。以刚性正弦模式轻轻扫过介质的无菌接种回路(使细微的条纹保持),将生物体与实验者波形的频率成比例分布。将培养皿分成三分之三或四分之一(象限条纹),并在进入菜的新区域时降低每个条纹的频率,将逐渐减少可以占据该区域的微生物数量,产生单一菌落,而不是不可量化的细菌草坪。铺板不额外稀释样品;无菌玻璃扩张器用于在整个培养皿中分配悬架介质的等分(图2)。生长在扩散板上的菌落来自单个细胞,盘上的每个菌落可以计算以估计给定悬浮液中每毫升(CFU)的菌落形成单位数,表示为CFU/mL (6) (图3)软琼脂和复制品电镀是上述技术的变化,允许分离噬菌体和突变筛选,分别(1,7)。 图2:用于细菌枚举和菌株分离的板条纹。用识别信息(细菌名称、日期、介质)标记培养皿的底部,然后分成三份。选择适当的稀释库存样品后,采取无菌(一次性或火焰)接种回路并将其浸入试管(此处,T3)。稍微提高一侧的培养皿盖,以便只有接种回路才能进入琼脂。以锯齿形的方式将接种回路滑过介质顶部,小心不要损害琼脂。将板旋转大约 1/3rd (±118°),并降低锯齿形运动的频率。旋转最后一次,并再次降低锯齿频率。请点击此处查看此图的较大版本。 图3:铺板。1克有氧区在T1中重新悬浮,然后连续稀释。无菌玻璃或塑料一次性摊杆用于在每个菜盘中分配接种液。这与1克的厌氧区重复。请点击此处查看此图的较大版本。 与连续稀释一样,使用对数尺度来表达有机体浓度。在标准培养皿中生长的菌落数量为100mm x15mm,可通过识别孤立的生长簇进行手动枚举(或借助计算处理实现自动化)。总数少于 30 或大于 300 的计数应分别定义为计数太少(TFTC) 或计数数量过多而无法计数 (TNTC)。在后

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    09:35
    富集培养:在选择性和微分介质上培养有氧和厌氧微生物

    资料来源:克里斯托弗·科博1,乔纳森·布莱泽1,伊丽莎白·苏特11大学生物科学系,瓦格纳学院,1 校园路,纽约州斯塔顿岛,10301

    原核细胞能够栖息在这个星球上的几乎每一个环境。作为一个王国,它们具有巨大的代谢多样性,允许它们使用各种各样的分子来产生能量(1)。因此,在实验室中培养这些生物体时,必须在生长培养中提供制造能量所需的所有特定分子。虽然有些生物在代谢上是多种多样的,但其他生物能够在极端环境中生存,如高温或低温、碱性和酸性pH值、减少或缺氧环境,或含有高盐的环境(2,3,4)。这些生物体被称为"嗜血杆菌",它们往往需要这些强烈的环境来增殖。当科学家寻找培育这些生物时,需要考虑到介质成分以及任何特定的环境条件,才能成功地培育出感兴趣的生物体。

    科学家能够在实验室中培育出可培养的生物体,因为他们了解这些物种生长所需的具体要求。然而,可养殖生物在估计地球上的物种中使媒体有选择性。选择性剂会阻止某些物种生长,同时不抑制甚至经常促进其他物种的生长(12)。介质成分的第二个功能可能是作为差分剂工作。这种制剂可以识别一个孤立的生物体的一个特定的生化特征。通过将几种不同的选择性和差别介质与适当的生长条件配对,科学家和诊断学家能够从特定分离物中识别特定细菌物种的存在。 选择性和差别化介质有助于鉴定的一个例子是临床上重要的有机体金黄色葡萄球菌。这种有机体通常是在曼尼托盐琼脂培养的。这种介质不仅只选择生活在高盐环境中的生物体,其中包括一些克阳性物,如金黄色葡萄球菌,而且还抑制任何对盐敏感的生物体。甘醇糖是这种介质的差分成分。在所有临床上重要的金黄色葡萄球菌物种中,只有S.金黄色葡萄球菌能够发酵曼尼托。这种发酵反应产生酸作为副产品,导致介质中的红色甲基红色指示灯变黄。其他葡萄球菌物种(如金黄色葡萄球菌表皮)虽然能够生长,但会使介质呈红色。 本实验练习演示了适当的无菌技术,以及从肉汤中正确接种生长介质。它还介绍了浓缩介质上常见污染物生物的生长情况,使用气体包厌氧培养系统进行厌氧细菌,以及使用不同的选择性和差分介质对克进行推定鉴定阳性和克阴性细菌。

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    09:03
    纯培养和条纹电镀:从混合样品中分离单一细菌菌落

    资料来源:蒂尔德·安徒森1号,罗尔夫·卢德11临床科学隆德系,感染医学系,生物医学中心,隆德大学,221 00 隆德,瑞典

    似乎无法确定,微生物生物多样性确实令人震惊,估计有一万亿种物种并存(1,2)。虽然气候特别恶劣,如人类胃的酸性环境(3)或南极洲的冰下湖泊(4),可能由特定物种主导,但细菌通常存在于混合培养物中。由于每种菌株都可能影响另一种(5)的生长,分离和培养"纯"(仅包含一种类型)菌落的能力在临床和学术环境中都变得至关重要。纯培养能进一步进行遗传(6)和蛋白细胞学检查(7),分析样品纯度,也许更值得注意的是,从临床样本中鉴定和鉴定传染性病原体。

    细菌具有广泛的生长要求,有许多类型的营养介质,旨在维持不苛求和挑剔的物种。为了尽量减少这些风险,所有介质、塑料、金属和玻璃器皿通常在使用前后通过高压灭菌进行灭菌,使其在 121°C 左右受到高压饱和蒸汽的影响,从而有效清除任何残留的细胞。工作空间通常在使用之前和之后使用乙醇进行消毒。在与传染性病原体一起工作时,始终佩戴实验室外套和手套。

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    10:56
    16S rRNA测序:基于PCR的技术,用于识别细菌物种

    资料来源:埃瓦·布科夫斯卡-法尼班德1号,蒂尔德·安德斯森1号,罗尔夫·卢德11临床科学隆德系,感染医学系,生物医学中心,隆德大学,221 00 隆德,瑞典

    地球是数百万种细菌的栖息地,每种细菌物种都有其特殊特征。细菌物种的鉴定在微生物生态学中广泛用于确定环境样本的生物多样性和医学微生物学,以诊断受感染的患者。细菌可以使用传统的微生物学方法进行分类,如显微镜、特定介质的生长、生化和血清学测试以及抗生素敏感性检测。近几十年来,分子微生物学方法彻底改变了细菌鉴定。一个流行的方法是16S核糖体RNA(rRNA)基因测序。该方法不仅比传统方法更快、更准确,而且能够识别在实验室条件下难以生长的菌株。此外,在分子水平上对菌株进行分化,使表性相同的细菌(1-4)之间具有鉴别力。

    16S rRNA 与 19 种蛋白质的复合物结合,形成细菌核糖体 (5) 的 30S向前 -1 27F 阿加加特·加·加金茨格格格股份公司 向前 -10 515F 格格格格·CMGCCGGGTA 向前 -11 911R 海合会加特克特科特加特加 反向 -12 1391R GACGGGGTGTGTRCA 反向 -11 1492R GGTTACCTGTTT 反向 -11 表 1:用于扩增16S rRNA基因a)的标准寡核苷酸的例子。a)通过计算正向和反向底漆的装订位点之间的距离(见图2),可以估计使用不同引漆组合生成的PCR产品的预期长度,例如PCR的大小使用底漆对 8F-1492R 的产品为 ±1500 bp,对于底漆对 27F-911R =900 bp。b)也称为 fD1 图 2:16S rRNA序列和引结位点的代表性图。保留区域为灰色,可变区域用对角线填充。为了达到最高分辨率,引基8F和1492R(基于rRNA序列位置的名称)用于放大整个序列,从而允许对基因的几个可变区域进行测序。请点击此处查看此图的较大版本。 PCR 的循环条件(即脱氧核糖核酸变性、引物退火和合成所需的温度和时间)取决于所使用的聚合酶类型和引物的特性。建议遵循制造商针对特定聚合酶的指南。 PCR程序完成后,通过胶质电泳对产品进行分析。成功的 PCR 产生一个预期大小的单个波段。在测序之前,必须对产品进行纯化,以去除PCR反应中存在的残留底漆、脱氧核苷酸、聚合酶和缓冲液。纯化的DNA片段通常被发送到商业测序服务;然而,一些机构在他们自己的核心设施进行DNA测序。 DNA 序列由计算机从 DNA 色谱图自动生成,必须仔细检查质量,因为有时需要手动编辑。按照此步骤,将基因序列与沉积在16S rRNA数据库中的序列进行比较。识别相似区域,并传递最相似的序列。

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    12:14
    生长曲线:使用菌落成形单位和光学密度测量生成生长曲线

    资料来源:安德鲁·范阿尔斯特1,瑞安农M.勒维克1,纳塔利娅·马丁1,维克多·迪丽塔11密歇根州立大学微生物学和分子遗传学系,美国密歇根州东兰辛分校

    生长曲线提供了有关细菌生长动力学和细胞生理学的宝贵信息。它们使我们能够确定细菌在可变生长条件下的反应,并为给定细菌定义最佳生长参数。原型增长曲线通过四个增长阶段前进:滞后、指数、静止和死亡 (1)。

    图1:细菌生长曲线。在批量培养中生长的细菌通过四个生长阶段:滞后、指数、静止和死亡。滞后期是细菌达到能够快速细胞生长和分裂的生理状态的时间段。指数阶段是细胞生长和分裂速度最快的阶段,在此期间,DNA复制、RNA转录和蛋白质生产均以恒定、快速的速度发生。固定阶段的特点是由于营养限制和/或有毒中间积累,细菌生长减慢和停滞。死亡期是细胞溶

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    13:38
    抗生素敏感性测试:Epsilo计测试,以确定两种抗生素的MIC值,并评估抗生素协同效应

    资料来源:安娜·布吕克伯格1, 罗尔夫·卢德11临床科学系 隆德,感染医学系,生物医学中心,隆德大学,221 00 隆德瑞典

    了解抗生素和细菌之间的相互作用对于了解微生物如何进化抗生素耐药性非常重要。1928年,亚历山大·弗莱明发现了青霉素,一种通过干扰细胞壁再生来发挥抗菌作用的抗生素(1)。随后发现了其他具有不同作用机制的抗生素,包括抑制细菌DNA复制和蛋白质转化的药物;然而,近年来没有开发任何新的抗生素。对现行抗生素的耐药性一直在增加,导致无法有效治疗的严重传染病(2)。在这里,我们描述了几种评估细菌群抗生素耐药性的方法。这些方法中的每一个都有效,无论所使用的抗生素的作用机制如何,因为细菌死亡是测量的结果。抗生素耐药性不仅通过医院环境迅速传播,而且在全社会迅速传播。为了研究这种抗性手段,已经开发出了不同的方法,包括Epsilo计测试(E测试)和肉汤稀释试验(3)。

    电子测试是一种公认的抗生素的可能协同和对抗机制对于临床疗效和对抗多药耐药性非常重要。 使用电子测试确定协同效应可以分为两大类:交叉测试和非交叉测试。虽然这两种协同测试都依赖于以前对各个 MIC 值的了解,但两种方法在方法和概念方法上略有不同。在非交叉协同测试中,被测试的对中的第一个抗生素被放置在接种细菌的琼脂板上。允许从第一条中注入板中的抗生素(例如,在 1 小时后),去除该条,并将包含第二种抗生素的新条放在与第一个抗生素完全相同的位置,确保将两个单独的 MIC 值放在每个 ot 的顶部她。然后,可以按上述方式分析产生的抑制区,并根据公式 1 计算协同效应。 公式 1 - 分数抑制浓度 (FIC) 值 >0.5 显示了协同效应。 虽然用易于分析的板来奖励考官,但由于条带的变化,以及每个实验需要使用两个板,这种方法有些费力和费时。相反,通常采用交叉测试。而不是添加两个不同的电子测试条随后彼此的顶部(删除第一个后),两者同时放置,但以十字(90°角)的形式,与两个先前确定的MIC值形成90°角。通过这种方法,每个协同测试只需要一个板,而且工作更少,尽管分析起来稍微困难一些,但还是成为首选。组合抗生素方法中新的MIC值可以可视化为经过修饰的抑制区,之后可以通过公式1确定协同效应。 微broth方法通常具有更高的灵活性(例如,在电子测试条限制之外选择特定浓度的抗生素的能力),而不是使用琼脂板方法,通常可以优先使用。此外,微broth测试建议更敏感,因为它们在液体溶液中均匀分布抗生素,而不是取决于固体相(琼脂板)内的解散。96孔微孔中的孔将接种一组细菌(106 cfu/mL:细菌浓度可通过OD600 nm测量、浊度标准或从10倍细菌系列稀释中传播电镀样品来估计),以及不同稀释液中的抗生素将被添加到井中。同样,对于电子测试条,MIC被确定为与抗生素浓度最低抑制细菌可见生长的交叉点(井/点)。 实验目标 以下项目描述了通过两种不同的方法确定青霉素G和链球菌组G的基母菌素的MIC值的策略,即电子测试和微溴稀释。在电子测试中,用G链球菌组接种的Mueller-Hinton琼脂板与青霉素G和/或文母素的梯度条结合使用;而MH-broth与50

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    11:18
    显微镜和染色:革兰克、胶囊和内孔染色

    资料来源:Rhiannon M. LeVeque1, 纳塔利娅·马丁1,安德鲁·范阿尔斯特1,和维克托·迪丽塔11密歇根州立大学微生物学和分子遗传学系,美国密歇根州东兰辛分校

    细菌是地球上几乎随处可见的各种微生物。许多特性有助于区分它们彼此,包括但不限于革兰染色类型、形状和排列、胶囊的产生和孢子的形成。为了观察这些特性,可以使用光显微镜;然而,一些细菌特性(例如尺寸、缺乏着色和折射特性)使得仅用光学显微镜(1,2)很难区分细菌。使用光显微镜区分细菌类型时,必须染色细菌。光学显微镜的两种主要类型是简单和复合的。它们之间的主要区别是用于放大物体的透镜数量。简单的显微镜(例如放大镜)只有一个镜头来放大物体,而复合显微镜有几个透镜来增强放大倍率(图1)。复合显微镜有一个接近物体的物镜,它收集光来创建物体的图像。然后,通过放大图像的目镜(目镜)放大。与单独使用单个镜头相外粘性外层,称为胶囊(3,5)。胶囊是具有各种功能的保护结构,包括但不限于粘附表面和其他细菌、防止干燥和防止噬菌体。胶囊通常由含有95%以上水的多糖组成,但有些可能含有多醇和多胺(5)。由于其大多非离子成分和排斥污渍的倾向,简单的染色方法不适用于胶囊;相反,胶囊染色使用负染色技术,污渍细胞和背景,留下胶囊作为一个明确的光环周围的细胞(1,3)(图4)。胶囊染色涉及将细菌样品涂抹在显微镜幻灯片上的酸性污渍中。与革兰染色不同,细菌污迹在胶囊染色期间不热固定。热固定可以破坏或脱水胶囊,导致假底片 (5)。此外,热固定可以收缩细胞,导致细胞周围的清除,可以误认为胶囊,导致误报(3)。酸性污渍使滑动背景变色;而跟进一个基本的染色,水晶紫罗兰,颜色的细菌细胞本身,离开胶囊不染色,并显示为细胞和滑动背景之间的一个明确的光环(图5)。传统上,印度墨水被用作酸性污渍,因为这些颗粒不能穿透胶囊。因此,胶囊和细胞都没有被印度墨水弄脏;相反,背景被染色。刚果红,尼格罗辛,或Eosin可用于代替印度墨水。胶囊染色可以帮助医生诊断细菌感染时,从患者样本看培养物,并指导适当的患者治疗。由封装细菌引起的常见疾病包括肺炎、脑膜炎和沙门氏菌病。 图4:胶囊染色协议原理图。顶部面板显示任何污渍应用前的幻灯片涂抹。中间面板显示幻灯片和细菌如何照顾主要污渍,刚果红。最后一个面板显示幻灯片和细菌如何照顾反污渍,水晶紫罗兰。 图5:胶囊染色结果。胶囊染色的封装的阿辛托细菌鲍曼尼(用黑色箭头表示)和非封装大肠杆菌(用白色箭头表示)。请注意,背景是黑暗的,A.鲍曼尼细胞是彩色紫色的。A. baumanni细胞周围的胶囊明显是光晕,而大肠杆菌没有光晕。 在不利条件下(例如营养限制、极端温度或脱水),一些细菌产生内孢子,代谢不活性结构,对物理和化学损伤具有抵抗力(1、2、8、9)。内孢子通过保护细胞的遗传物质,使细菌在恶劣的条件下存活;一旦条件有利于生长,孢子发芽,细菌生长继续。内孢子很难用标准染色技术染色,因为它们对通常用于染色的染料是不可渗透的(1,9)。通常用来染色内皮孢子的技术是舍弗-富尔顿法(图6),它使用主要染色马拉奇特绿,水溶性污渍,结合相对较

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    13:00
    斑块测定:确定病毒性皮石为斑块形成单位(PFU)的方法

    资料来源:蒂尔德·安徒森1号,罗尔夫·卢德11临床科学隆德系,感染医学系,生物医学中心,隆德大学,221 00 隆德,瑞典

    感染原核生物的病毒,称为噬菌体或简称噬菌体,在20世纪初由Twort(1)和d'Hérelle(2)独立发现。自那时以来,噬菌体因其治疗价值(3)及其对人类(4)以及全球生态系统(5)的影响而得到广泛认可。目前的关切促使人们重新关注使用噬菌体作为现代抗生素替代治疗传染病的方法(6)。基本上,所有的噬菌体研究都依赖于纯化和量化病毒的能力,也称为病毒性小子。最初描述在1952年,这是斑块测定的目的(7)。几十年后,多项技术进步,斑块测定仍然是确定病毒性牙点(8)的最可靠的方法之一。

    噬菌体通过将遗传物质注入宿主细胞,劫持机器来生产新的噬菌体颗粒,并最终导致宿主通过细胞解释释放许多后代病毒。由于其微小的大小,噬菌体不能只用光显微镜观察;因此,扫描电子显地合体中,病毒通过将其遗传物质纳入宿主细胞(9)的基因组而假定为潜伏状态,这通常对进一步的噬菌体感染具有抵抗力。这有时通过斑块的轻微云彩(图3B)来揭示。然而,值得注意的是,斑块也可能显得模糊,由于细菌的再生长,已经进化了抵抗噬菌体,独立于以前的噬菌体感染。 病毒可以附着或吸附,只有有限的宿主细菌(10)。宿主范围受到细胞内抗病毒策略(如CRISPR-Cas系统(11)的进一步限制。细菌亚群对特定噬菌体表现出的抗药性/敏感性历来被用来将细菌菌株分类为不同的噬菌体类型(图4)。虽然这种方法的有效性现已被新的测序技术所超越,但噬菌体类型仍然可以提供有关细菌-噬菌体相互作用的宝贵信息,例如,促进为临床使用设计噬菌体鸡尾酒. 图4:不同细菌菌株的噬菌体敏感性。软琼脂板与可爱痤疮菌株(A)AD27和(B)AD35,被发现与21种不同的C.痤疮噬菌体。只有噬菌体11能够感染和杀死AD27,而AD35菌株对所有噬菌体表现出敏感性。这种技术,称为噬菌体类型,可用于根据噬菌体易感性将细菌种类和菌株分成不同的亚群。

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    10:54
    使用自适应氯化钙程序对大肠杆菌细胞的转化

    资料来源:纳塔利娅·马丁1号,安德鲁·范·阿尔斯特1号,瑞安农·勒维克1号,维克多·迪丽塔1号1 密歇根州立大学微生物学和分子遗传学系

    细菌有能力在称为水平基因转移的过程中交换遗传物质(脱氧核糖核酸,DNA)。结合外源性DNA提供了一种机制,细菌可以通过它获得新的遗传特性,使他们能够适应不断变化的环境条件,如抗生素或抗体的存在(1)或分子在自然栖息地发现(2) 水平基因转移有三种机制:转化、转导和共聚(3)。在这里,我们将专注于转化,细菌从环境中获取自由DNA的能力。在实验室中,转化过程有四个一般步骤:1) 制备合格细胞,2) 用DNA孵育合格细胞,3) 细胞恢复,4) 细胞的电镀,用于转化剂的生长(图1)。

    图 1:转换过程的一般步骤。转化过程有四个一般步骤:1) 制备合格细胞,2) 用DNA孵育,3) 细胞的恢复和 4)C)下进行孵育,进行热冲击。这种温度不平衡进一步有利于DNA的摄取。细菌细胞需要在中指数生长阶段,以承受热冲击处理;在其他生长阶段,细菌细胞对热量过于敏感,导致生存能力丧失,从而大大降低转化效率。 不同的DNA来源可用于转化。通常,在大肠杆菌的大多数实验室程序中,质粒、小圆形、双链DNA分子用于转化。要在转化后在细菌细胞中维持质粒,它们需要包含复制的来源。这使得它们可以在细菌细胞中独立于细菌染色体复制。并非所有的细菌细胞在转化过程中都得到转化。因此,转化产生转化细胞和非转化细胞的混合物。为了区分这两个群体,使用一种选择方法来识别获得质粒的细胞。疟原虫通常含有可选择的标记物,这些标记是编码一种具有生长优势的特征的基因(即对抗生素或化学物的抗药性或从生长辅助体中拯救)。转化后,细菌细胞被镀在选择性培养物上,这只允许转化细胞的生长。如果细胞转化,质粒对给定抗生素具有抗药性,选择性培养基将是含有该抗生素的生长介质。有几种不同的方法可以用来确认在选择性培养基中生长的菌落是转化剂(即已经合并了质粒)。例如,质粒可以使用质粒制备方法(10)从这些细胞中恢复,并消化以确认质粒大小。或者,菌落PCR可用于确认存在感兴趣的质粒(11)。 本实验的目的是利用氯化钙程序(12)的适应,制备大肠杆菌DH5+化学能力细胞,并用质粒pUC19对其进行转化,以确定转化效率。大肠杆菌菌株DH5+是分子生物学应用中常用的菌株。由于其基因型,特别是recA1和endA1,这种菌株可以提高插入稳定性,并在随后的制剂中提高质粒DNA的质量。由于转化效率随着DNA尺寸的增加而降低,因此,由于质粒pUC19体积小(2686 bp),因此在本协议中使用了质粒pUC19(参见https://www.mobitec.com/cms/products/bio/04_vector_sys/standard_cloning_vectors.html矢量映射)。pUC19对青霉素具有抗药性,因此,这是用于选择的抗生素。

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    12:52
    结合:将阿霉素耐药性从捐赠者转移到受体大肠杆菌的方法

    资料来源:亚历山大·金1,托尼娅·科尔皮茨11波士顿大学医学院微生物学系,国家新兴感染疾病实验室,波士顿,马萨诸塞州

    1946年,莱德伯格和塔图姆首次发现,结合是细菌之间的一种水平基因转移形式,依赖于两个细菌细胞之间的直接物理接触(1)。与其他形式的基因转移(如转化或转导)不同,结合是一个自然发生的过程,DNA以单向的方式从供体细胞分泌到受体细胞。这种方向性和这一过程增加细菌遗传多样性的能力,使结合作为细菌"交配"的一种形式的声誉,这被认为极大地促进了最近抗生素耐药性的上升细菌(2,3)。通过使用选择性压力,例如使用抗生素,结合纵用于实验室设置,使其成为细菌之间水平基因转移的有力工具,在某些情况下,从细菌到酵母、植物和动物单元格 (4)。除了在实验室中的应用,通过结合转移真核酸细菌基因是DNA转移的一个令人兴奋的途径,具有多种可能的生物技术应用和自然发生的影响(5)。

    结合被认为是通过"两偶联供体菌株大肠杆菌WM3064将对受体大肠杆菌J53的抗中青霉素的基因编码转移。 虽然革兰氏阴性细菌的两种菌株对四环素具有抗药性,但只有供体菌株WM3064具有氨基青霉素抗性基因,编码为pWD2-oriT穿梭载体中,对二氨基甲酸(DAP)(DAP)具有辅助营养性。该实验包括两个主要步骤,一是制备供体和受体菌株,然后是通过结合将安培林抗性基因从供体转移到受体(图1)。 图1:共通示意图。此原理图显示了质粒(仅可转位DNA元素的一个示例)从供体细胞使用结合从受体细胞成功转移。当供体细胞通过性皮鲁斯与受体细胞接触时,质粒通过滚动循环复制复制,通过连接两个细胞的多蛋白复合体移动,并在受体细胞中形成新的全长质粒。 通过孵育供体和受体细胞的混合物,然后在四环素和DAP的存在下连续电镀这些细胞,从而成功转移了阿霉素抗性基因。在四环素和安平存在的情况下,从这种混合物中生长的连续电镀细胞,由于缺少DAP和可能尚未获得环青素抗基因的任何受体细胞,去除了所有供体细胞,产生严格受体J53菌株获得对青霉素的细菌(图2)。一旦进行,通过PCR证实了青霉素抗性基因的成功转移。由于结合成功,大肠杆菌的J53菌株含有pWD2-oriT,对阿霉素具有抗药性,PCR可检测到这种抗性的基因编码。然而,如果不成功,将没有检测到阿霉素耐药性基因,而阿霉素仍将作为对抗J53菌株的有效抗生素。 图2:协议示意图。此原理图显示了所呈现协议的概述。 图3A:PCR成功结合的确认。A) 在琼脂板上条纹的偶联和阴性对照样本的冷冻库,并选择一个菌群(红色)进行DNA分离。

  • Microbiology

    11:21
    噬菌体转导:将氨基青霉素耐药性从捐赠者转移到受体大肠杆菌的方法

    资料来源:亚历山大·金1,托尼娅·科尔皮茨11波士顿大学医学院微生物学系,国家新兴感染疾病实验室,波士顿,马萨诸塞州

    转导是细菌之间的一种基因交换形式,它利用噬菌体或噬菌体,一种完全感染原核生物的病毒。这种形式的DNA转移,从一种细菌到另一种细菌通过噬菌体的方式,发现于1951年由诺顿·津德和约书亚·莱德勒格,谁称这个过程"转导"(1)。1915年,英国细菌学家弗雷德里克·特奥尔首次发现噬菌体,1917年由法裔加拿大微生物学家费利克斯·德赫勒(Felix程,但利用现代技术,它纵在实验室环境中将基因转移到细菌中。通过将感兴趣的基因插入基源噬菌体的基因组(如噬菌体)中,能够将这些基因转移到细菌的基因组中,从而在这些细胞中表达这些基因。虽然其他基因转移方法,如转化,使用质粒进行基因转移和表达,但将噬菌体基因组插入受体细菌中不仅有可能赋予这种细菌新的特性,而且还允许自然发生的突变和细胞环境的其他因素,以改变转移基因的功能。 与其他水平基因转移方法(如共偶)相比,转导在供体和受体细胞所需的标准上相当灵活。任何可以适应所使用噬菌体基因组的遗传元素都可以从任何供体细菌菌株转移到任何受体细菌菌株,只要两者都允许噬菌体,需要表达必要的噬菌体受体。细胞表面。一旦这个基因从供体基因组中移出并打包到噬菌体中,就可以转移到受体。转导后,有必要为含有感兴趣的基因的受体细菌选择。这可以通过使用基因标记,如FLAG标记或多血氨酸标记,来标记感兴趣的基因,或基因的内在功能,在编码抗生素耐药性的基因的情况下。此外,PCR还可用于进一步确认成功的转导。通过使用感兴趣的基因中的一个区域的引体并将信号与阳性对照、具有感兴趣基因的细菌和阴性对照的细菌进行比较,细菌经历了与无噬菌体的转导反应相同的步骤。虽然细菌转导是分子生物学的有用工具,但它在细菌的进化中已经并将继续发挥重要作用,特别是在最近抗生素耐药性的上升方面。 在本实验中,细菌转导用于通过P1噬菌体(5)将抗生素氨基青霉素的抗药性基因编码从大肠杆菌的W3110菌株转移到J53菌株。这个实验包括两个主要步骤。首先,从供体菌株制备含有甲异素抗性基因的P1噬菌体。第二,通过P1噬菌体转导将该基因转移到受体菌株(图1)。一旦进行,环青素抗性基因的成功转移可以通过qPCR确定(图2)。如果转导成功,大肠杆菌的J53菌株对氨基青霉素具有抗药性,而该基因可由qPCR检测出这种抗性。如果不成功,将不会检测到阿霉素耐药性基因,而阿霉素仍将作为对抗J53菌株的有效抗生素。 图2:qPCR成功转导的确认。通过比较从转导反应和阴性对照反应中检测到的感兴趣的基因的Cq值,并将这些值与内务管理基因规范化,从而证实细菌转导是成功的。

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