無菌環境科学

Environmental Microbiology

Your institution must subscribe to JoVE's Environmental Sciences collection to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Overview

ソース: ドクターペッパー イアン博士チャールズ Gerba - アリゾナ大学所
示す著者: ルイーザ Ikner

無菌技術は、マインドフルネスと実験室の練習のバランスを必要とする環境の微生物学の分野で広く練習される基本スキルです。この手法の適切な使用は、試薬、培地、環境試料の細菌や真菌の汚染の可能性を低減します。無菌技術はまたデータの整合性を確保し、非常に稀で、文化の分離することは困難ので構成されるかもしれない文化ライブラリの純度を維持する重要です。試験所環境の汚染の源は浮遊微生物濃度 (これらのほこりや糸くず付着粒子を含む) を含みます、微生物提示実験室ベンチ ワークスペース、または無殺菌ガラスや機器、および微生物体と研究者の髪から転送。無菌技術の使用削減を研究している微生物の伝達のための潜在的な病原体を扱う場合特に重要です安全対策しています。

Cite this Video | Reprints and Permissions

JoVE Science Education Database. 環境微生物学の必需品. 無菌環境科学. JoVE, Cambridge, MA, (2019).

Principles

無菌技術を使用しての目標を作成および維持滅菌作業環境、機器、試薬、試料の汚染を最小限に抑えることです。これを行うには、作業スペースといくつかのツール 70% エタノールなどの薬品で消毒することができ、漂白剤を希釈します。また白衣、手袋などの個人保護用具 (PPE) のドンに研究者にとって重要だし、安全ゴーグルを着用します。

メディアと試薬は、細菌などほとんどの微生物を効果的に削除 0.22 μ m のフィルターを用いてフィルター滅菌器具を使用して滅菌することができます。また、多くの試薬や機器は、また高熱で滅菌することができます。たとえば、微生物やツール、ガラス製品、および液体媒体ですることができます熱殺された高圧、高温加圧蒸気への暴露を介して内容を殺菌室であります。さらに、いくつかのツールは、熱滅菌ブンゼン バーナーなどの炎のソースを使用することができます。

炎の源の使用はまた無菌作業環境を確立する最も一般的な方法の 1 つです。炎からの熱無菌実験作業を行うことで、バーナーの近くから離れて浮遊汚染物をリフトする上昇気流を生成し、「滅菌フィールド」を作成、空気の対流が発生します。

Procedure

1. 無菌作業のための準備

  1. 取得、次の PPE 項目適用: 白衣、(涙や穴から無料)、ラテックスまたはニトリル手袋、安全ゴーグル (図 1)。開いた炎を使用する場合安全のため、戻って長い髪を結ぶ。
    Figure 1
    図 1: PPE: 実験用の上着、ラテックス手袋、安全ゴーグル。
  2. 無菌技術の 2 つ目の重要な側面は、適切な滅菌とメディア ・研究室で使用する試薬の保管です。液体スープ媒体 (例えば、トリプシン醤油スープ)、寒天ベースのメディア (例えばR2A) を脱イオン水の適切な量を追加乾燥の原料粉末の適切な量を計量して準備します。
  3. スープ中の適用、低熱でホット プレート上の粉末を溶解するし、分配液体 100 mL の容積のいずれかガラスねじ上のフラスコ、または 10 mL の容積でガラスねじ上テスト チューブに。粉が完全に溶解するまで、ホット プレート攪拌に agarose 媒体をかき混ぜる電磁攪拌棒を使用して。
  4. オートクレーブ テープをコンテナー、および製造元の指示 (例えば、121 ° C で 20 分) によるとメディアのオートクレーブに適用 (図 2 および 3)。オートクレーブ テープにストライプの色は、白 (中古オートクレーブ) からブラック (後オートクレーブ) に変化する必要がありますに注意してください。色の変更は通常、滅菌が成功したことを示します、不妊は胞子ストリップ キットを使用しては、オートクレーブ処理を確認する行うことができるを確認します。
    Figure 2
    図 2: オートクレーブ テープ材料に適用されます。
    Figure 3
    図 3:ブラック (後オートクレーブ) 白 (中古オートクレーブ) からオートクレーブ テープにストライプの色の変化に注意してください
  5. 部屋の温度、液体の流体培養基をクールや常温で保存し、4 ° C で冷蔵
  6. クールな水お風呂にコンテナーを配置することによってアガロース媒体は、~ 50 ° c. の設定いったん冷却、メディアは、滅菌シャーレに注がれることができます。冷却し、固める、製造元によって指定された温度下でストレージの統合を許可します。
  7. 高温を低下させる重要な成分はオートクレーブできません文化メディアのいくつかの種類があります。適切な温度で保管後、0.22 μ m フィルターを用いた真空ろ過システムを用いたフィルター滅菌を必要とするこれらを殺菌します。
  8. ベンチトップ作業を実行する、前に (例えば、漂白剤 500 ppm) の適切なソリューションを使用して表面を消毒します。これは作業面から文化や生殖不能メディアに汚染物質を転送する危険を下げます。
  9. 滅菌フィールドを確立するには、ブンゼン バーナーをオンにします。ループを接種殺菌金属に最適な炎タイプは、中間 (図 4) で観測された決定的な青錐体との強烈な青い炎です。
    Figure 4
    図 4: 寒天成長媒体を含んでいる別の非接種ペトリ プレートに、培養細胞の成長を表示する 1 つのペトリ プレートからの細菌の転送を分離します。
  10. ゆっくりと炎 (青錐体の先端) の最も熱い部分を接種したループを渡します。ループは、殺菌を目的としてホット赤にする必要があります。

2. 細菌の転送: ペトリ プレートにペトリ プレートから

  1. 細菌の転送の 1 つのシナリオは、ペトリネット ワンプレート寒天成長媒体を含んでいる培養分離別、滅菌するペトリネット プレートの成長を表示するからです。
  2. まず、純粋な細菌培養を含むペトリネット プレートが少し開いたし、寒天表面に熱い、滅菌接種ループを軽きます。
  3. 冷却接種ループを用いた平板の表面から 1 つの隔離されたコロニーを取得し、ペトリネット プレートを閉じます。
  4. 少し半開きのふた付きの文化媒体を含む新鮮なペトリネット プレートを使用して分離するには、連勝を実行します。
  5. 分離連勝 (3 プレートごと合計) の各部分のためには、接種したループを使用する直前を炎-殺菌します。また、炎-滅菌ループを使用して可能性がありますまたは接種ループと接触したラボで他人への配慮とベンチ表面の汚染を防止するために最終的な連勝が実行された後にだけ。
  6. 一晩の成長のための定温器にすじ状のプレートを配置します。

3. 細菌の転送: ペトリ プレートにスープ文化から

  1. 細菌の転送の 2 番目のシナリオは、成長培地を含む滅菌ペトリ プレートに、濁度によって一般に観測された成長を展示スープ文化からです。
  2. 純粋な細菌培養を含むテスト チューブ (またはフラスコ) からキャップをはずし、炎のホットな部分を介して 2 〜 3 倍のコンテナー開口部を渡します。汚染を防ぐためには、設定しないでくださいキャップ ベンチトップに。
  3. 慎重にチューブ/フラスコに滅菌接種ループを下げるスープ文化への挿入直前に冷却するコンテナーの側に対してカチッと。
  4. スープ文化 (図 5) の 1 つの loopful を削除し、すぐにキャップを交換します。
    Figure 5
    図 5:スープ文化の 1 つの loopful.
  5. 少し半開きのふた付きの文化媒体を含む新鮮なペトリネット プレートを使用して分離するには、連勝を実行します。
  6. 連勝 (3 プレートごと合計) の各部分のためには、接種したループを使用する直前を炎-殺菌します。また、炎-滅菌ループ後接種ループを使用できるラボで他人への配慮とベンチ表面の汚染を防止するために最終的な連勝が実行された後にだけ。
  7. 一晩の成長のための定温器に分離の縞板を配置します。

4. 細菌の転送: ペトリ プレート滅菌液体培地への成長から

  1. 細菌の転送の 3 番目のシナリオは、無菌の液体の成長媒体を含んでいる管/フラスコに孤立した文化連勝を含むペトリネット プレートからです。
  2. 少し純粋な細菌培養を含むペトリネット プレートを開き、寒天培地の表面に軽くタップしてホット接種ループをクールします。
  3. 冷却接種ループを用いた平板の表面から 1 つの隔離されたコロニーを取得し、ペトリネット プレートを閉じます。
  4. テスト チューブ (またはフラスコ) 無菌の液体を含んでいる成長媒体からキャップをはずし、2 〜 3 回炎のホットな部分を使用してコンテナーのオープニングを渡します。汚染を防ぐためには、設定しないでくださいキャップ ベンチトップ.
  5. 慎重に、液体スープの中に抽出したコロニーを下げる, 細菌を解放するためにループを振といます。すぐにキャップを交換します。
  6. 炎 - 接種ループ使用後ラボで他人への配慮とベンチ表面の汚染防止のための滅菌接種ループ。
  7. 場所の成長のための定温器にフラスコの一夜します。
  8. 孵化翌日からフラスコを削除します。カルチャを列挙するために、希釈系列を実行します。
  9. アガロース文化メディアにシリーズから希釈液をプレートし、プレートを一晩インキュベートします。
  10. 次の日、プレートを削除し、任意の汚染を観察します。

5. 細菌の転送: 滅菌液体培にスープ文化から

  1. 細菌の転送の 4 番目のシナリオは、無菌の液体の成長媒体を含んでいる管/フラスコに成長を展示スープ文化からです。
  2. 純粋な細菌培養を含むテスト チューブ (またはフラスコ) からキャップをはずし、炎のホットな部分を 2 回コンテナーのオープニングを渡します。汚染を防ぐためには、設定しないでくださいキャップ ベンチトップに。
  3. 慎重にチューブ/フラスコに接種したループを下げるスープ文化への挿入直前に冷却するコンテナーの側に対してカチッと。
  4. スープ文化の 1 つの loopful を削除し、すぐにキャップを交換します。
  5. テスト チューブ (またはフラスコ) 無菌の液体を含んでいる成長媒体からキャップをはずし、炎.のホットな部分を 2 回コンテナーのオープニングを渡す汚染を防ぐためには、設定しないでくださいキャップ ベンチトップに。
  6. 慎重に滅菌液体スープ中に抽出した loopful を下げ、細菌を解放するためにループを振といます。すぐにキャップを交換します。
  7. 炎 - 接種ループ使用後ラボで他人への配慮とベンチ表面の汚染防止のための滅菌接種ループ (図 6)。
    Figure 6
    図 6: 接種ループ回転赤ホットのブンゼン バーナーで滅菌されている中です。
  8. 場所の成長のための定温器にフラスコの一夜します。
  9. 孵化翌日からフラスコを削除します。カルチャを列挙するために、希釈系列を実行します。
  10. アガロース文化メディアにシリーズから希釈液をプレートし、プレートを一晩インキュベートします。
  11. 次の日、プレートを削除し、任意の汚染を観察します。

無菌は、微生物学では基本的な技術であり環境研究の重要なアプリケーションがあります。

場合微生物学的文化が汚染されて、時間、労働、「クリーンアップ」またはユニークな環境から分離された文化、特に珍しい置換するラボの必要とされる金融のコストが非常に高いと、法外な、いくつかサンプルは、交換できない場合があります。

無菌技術の適切な使用は、試薬、培地、環境試料の細菌や真菌の汚染の可能性を低減、またサンプル間の交差汚染を避けます。また、病原体を使用するとき特に重要である、実験者に微生物の伝播の可能性を減少させる安全対策です。

無菌の原則を紹介します滅菌試薬と文化を維持するためにいくつかの重要なテクニックそして最後に、いくつかの環境の科学の使用。

無菌技術を使用しての目標を作成および維持滅菌作業環境、機器、試薬、試料の汚染を最小限に抑えることです。汚染の一般的な原因は、空気中の微生物、微生物実験室ベンチや機材、髪、ボディ、および研究者の衣服からのそれらの提示します。

2 つのタイプのエージェントが削除または実験室での汚染を防ぐ中央: 消毒剤と熱。70% エタノールなど希釈の漂白剤の解決策は、無菌作業に従事する前に実験者の手袋、作業面、機器の消毒に使われます。

同時に微生物やツール、ガラス製品、および液体媒体ですることができます熱殺された高圧、高温加圧蒸気への暴露を介して内容を殺菌室であります。加えて、ガラス棒などのツール拡散めっきと金属接種ループは熱殺菌のブンゼン バーナーなどの炎のソースを使用することができます。

炎の源の使用はまた無菌作業環境を確立する最も一般的な方法の 1 つです。炎からの熱無菌実験作業を行うことで、バーナーの近くから離れて浮遊汚染物をリフトする上昇気流を生成し、「滅菌フィールド」を作成、空気の対流が発生します。

今では、無菌テクニックと彼らが重要な理由の背後にある原理を理解は、無菌の作業環境を作成する、滅菌成長媒体を作ると異なる培養条件の間の細菌を無菌転送するためのプロトコルを行ってみましょう。

無菌作業を開始する前に適切な保護具や PPE に実験者にとって重要です。これの目的は、サンプルと実験室文化の汚染から実験者を防ぐために両方と研究する可能性のある病原微生物の伝達を防ぐためにです。PPE の項目には、実験用の上着や手袋、安全ゴーグルが含まれます。

次の手順は、適切に消毒し微生物サンプルの培養に使用される成長媒体に格納です。まず、固体培地成分の適切な量を量りし、液体溶剤脱イオン水、オートクレーブ コンテナー追加電磁攪拌棒、ホット プレート攪拌にコンテナーを配置低熱で固体培地成分を溶解との製造元によって指定され、攪拌の適切なボリュームに追加。

中のコンテナーを閉じます。ガラス容器を使用すると、キャップのネジと、ない血管内部の空気オートクレーブ滅菌中に加熱による展開が、エスケープする必要があります、完全にキャップを締めてさい。脱出せずガスに容器破裂する可能性があります。器、オートクレーブ 121 ° c 20 分などの製造元の指示に従ってメディアをオートクレーブ テープの一部を入れてください。オートクレーブ後、オートクレーブ テープのストライプが黒、適切な温度に達したを示すになってことを確認します。

液体の成長媒体のため、室温まで冷ます、室温でまたは適切な冷凍保存します。寒天ベース固体成長媒体、それらを冷ます約 50 ° C にし、滅菌シャーレに注ぐ。冷却し、適切な温度で保存する前に固める寒天を許可します。

熱に敏感な部品が存在するためオートクレーブすることはできませんメディア、フィルターは、0.22 μ m フィルターを使用して滅菌します。

微生物学的仕事のコア技術は、無菌固体と液体の両方の異なる成長媒体間細菌文化を転送することです。開始、する前に消毒剤でラボ ベンチ表面をきれいにします。これは文化か生殖不能媒体の汚染リスクを低減します。

細菌文化を転送する接種ループ、炎で加熱により使用前に消毒をする必要があると呼ばれるツールを使用よく。

炎のソースを入れます。ゆっくりと炎の先端を接種したループを渡します。ループはホット赤になります。固形寒天から細菌のコロニーを転送するには、ペトリネット プレートを少し開いて、軽く熱を殺す細菌を避けるために寒天表面の空の部分に熱い接種ループ。接種ループ単一コロニーをこすり、プレートを閉じます。

液体の成長媒体から細菌を転送するには、文化容器からキャップを取り外します。汚染を防ぐために回避ベンチの上にキャップを設定します。2-3 回炎のホットな部分を通って容器の口を渡します。その後、慎重にコンテナーの内側に熱い、滅菌接種ループに触れるし、スープ文化にそれを挿入する前に、涼しくてみましょう。文化の 1 つの loopful を削除し、すぐにキャップを閉じます。

得られた細菌を滅菌培に転送するため滅菌のスープとコンテナーからキャップをはずし、容器の口炎 2-3 回を渡します。その後、慎重に、培地へ接種ループを下げる、優しく細菌を解放する揺り動かしなさい。すぐにキャップを閉めてください。使用後接種ループを滅菌します。

滅菌寒天プレート上に細菌を転送する場合は、接種寒天と新鮮なペトリネット プレートのカバーを開きます。ストリーク バック前後寒天の 1 つのセクター間での細菌培養の接種ループ。ループを殺菌し、クールな寒天の空の部分に触れることによってそれ、寒天の別の縞鈍い角度で最初の 1-2 ストロークの最初の連勝を越えるが、ストロークの最初の連勝に触れないように必ず最初の連勝します。殺菌とストリー キング 2 回以上繰り返します。ペトリ プレートを閉じ、接種ループを消毒します。

一度接種すると, スープや寒天プレート、実行可能なカルチャを取得する特定の微生物の最適成長温度で培養する必要があります。固体媒体の芝生や細菌の連続ストランドが寒天の最初の 2 つの縞で覆われて表示されますが、最終的なストリークの個々 のコロニーを取得必要があります。貧しい人々 の無菌技術は、金型やプレートの他の汚染物質の成長になります。

無菌技術は環境から微生物サンプルを含む多くの実験で重要です。この研究では、研究者は隔離バクテリオファージが細菌感染ウイルスは、一般的な土壌細菌アースロバクターから。アースロバクター文化はまず無菌条件下で栽培しました。土壌サンプルされた洗浄バクテリオファージ バッファーでフィルタ リングし、バクテリオファージ溶液細菌文化と混合し、寒天プレートの上にメッキします。細菌の芝生とプレートになるが、開拓、またはウイルスが感染していたし、細菌を殺されたスポットで「プラーク」があるでしょう。ファージは、さらなる研究のためのこれらのプラクから精製できます。

ブンゼン バーナーを使用する以外は、使用する監督気流および無菌性を維持するためのフィルター、層流フードとして知られている専門のワークステーションで無菌作業環境を維持できます。ここでは、科学者は、潜在的な病原細菌および水試料からのウイルス分離する流フードで働いていた。これらの菌株は、アメーバとともに培養しました。アメーバは、通常食べるか""細菌を貪食、ため amoebal 消化に抵抗する、これらの有機体に残ることができたすべての細菌はまた、潜在的ひと細胞の存続し、病気を引き起こすできます。

最後に、滅菌条件は、マメ科植物の根粒形成植物 - 成長の植物によって使用されるアンモニアを大気中の窒素を「修正」細菌いっぱいの臓器など生態学的メカニズムの詳細な研究を許可します。ここで作成した研究者「小宇宙」植物培地で切欠きを有するペトリネット プレートを用いた根粒形成過程研究のための苗を入れるし、接種根粒菌の根粒形成と苗。流フードの無菌の環境は、他の細菌やカビの文化の汚染を防ぎます。

ゼウスの無菌環境科学技術関連のビデオを見てきただけ。今、無菌の労働条件が重要である理由を理解しておくべき無菌微生物実験; を実行する方法無菌技術の環境研究への応用。いつも見てくれてありがとう!

Results

適切な無菌法と貧しい無菌処置の結果を示しています。図 7は、アガロース プレートを注ぐとき、貧しい無菌技術から生じる汚染を示しています (トップ プレート: 生殖不能媒体; 底板: メディアを汚染された)。

Figure 7
図 7: agarose プレートを注ぐとき、貧しい無菌技術から生じる汚染します。トップ プレート: 生殖不能媒体;底板: メディアを汚染します。

Applications and Summary

ブンゼン バーナーを使用する以外は、使用する監督気流および無菌性を維持するためのフィルター、層流フードとして知られている専門のワークステーションで無菌作業環境を維持できます。

無菌技術の適切な使用環境微生物学者にとって重要なメディア、試薬を使用する場合、フィールドと実験室をサンプリングするときは、菌株を培養しました。 フィールドで貧しいの無菌技術は、技術者が重要な環境試料から微生物の転送だけでなく、別の 1 つのサンプルから微生物のクロス汚染起因します。たとえば、重要性のようなイベントは、微生物生態研究を識別し、特定の生物群系に存在する細菌や真菌の集団を比較ましょう。このような試料の汚染は、データ整合性の損失につながります。無菌技術も研究室文化分離されたフィールド サンプリングや老舗の微生物と細胞文化のリポジトリからの維持のため重要です。時間、労働、「クリーンアップ」または汚染された文化、特に珍しいを交換するためにラボの必要となる費用は、ユニークな環境から分離されたことができる非常に高いと、いくつかの株に交換できない場合があります。

1. 無菌作業のための準備

  1. 取得、次の PPE 項目適用: 白衣、(涙や穴から無料)、ラテックスまたはニトリル手袋、安全ゴーグル (図 1)。開いた炎を使用する場合安全のため、戻って長い髪を結ぶ。
    Figure 1
    図 1: PPE: 実験用の上着、ラテックス手袋、安全ゴーグル。
  2. 無菌技術の 2 つ目の重要な側面は、適切な滅菌とメディア ・研究室で使用する試薬の保管です。液体スープ媒体 (例えば、トリプシン醤油スープ)、寒天ベースのメディア (例えばR2A) を脱イオン水の適切な量を追加乾燥の原料粉末の適切な量を計量して準備します。
  3. スープ中の適用、低熱でホット プレート上の粉末を溶解するし、分配液体 100 mL の容積のいずれかガラスねじ上のフラスコ、または 10 mL の容積でガラスねじ上テスト チューブに。粉が完全に溶解するまで、ホット プレート攪拌に agarose 媒体をかき混ぜる電磁攪拌棒を使用して。
  4. オートクレーブ テープをコンテナー、および製造元の指示 (例えば、121 ° C で 20 分) によるとメディアのオートクレーブに適用 (図 2 および 3)。オートクレーブ テープにストライプの色は、白 (中古オートクレーブ) からブラック (後オートクレーブ) に変化する必要がありますに注意してください。色の変更は通常、滅菌が成功したことを示します、不妊は胞子ストリップ キットを使用しては、オートクレーブ処理を確認する行うことができるを確認します。
    Figure 2
    図 2: オートクレーブ テープ材料に適用されます。
    Figure 3
    図 3:ブラック (後オートクレーブ) 白 (中古オートクレーブ) からオートクレーブ テープにストライプの色の変化に注意してください
  5. 部屋の温度、液体の流体培養基をクールや常温で保存し、4 ° C で冷蔵
  6. クールな水お風呂にコンテナーを配置することによってアガロース媒体は、~ 50 ° c. の設定いったん冷却、メディアは、滅菌シャーレに注がれることができます。冷却し、固める、製造元によって指定された温度下でストレージの統合を許可します。
  7. 高温を低下させる重要な成分はオートクレーブできません文化メディアのいくつかの種類があります。適切な温度で保管後、0.22 μ m フィルターを用いた真空ろ過システムを用いたフィルター滅菌を必要とするこれらを殺菌します。
  8. ベンチトップ作業を実行する、前に (例えば、漂白剤 500 ppm) の適切なソリューションを使用して表面を消毒します。これは作業面から文化や生殖不能メディアに汚染物質を転送する危険を下げます。
  9. 滅菌フィールドを確立するには、ブンゼン バーナーをオンにします。ループを接種殺菌金属に最適な炎タイプは、中間 (図 4) で観測された決定的な青錐体との強烈な青い炎です。
    Figure 4
    図 4: 寒天成長媒体を含んでいる別の非接種ペトリ プレートに、培養細胞の成長を表示する 1 つのペトリ プレートからの細菌の転送を分離します。
  10. ゆっくりと炎 (青錐体の先端) の最も熱い部分を接種したループを渡します。ループは、殺菌を目的としてホット赤にする必要があります。

2. 細菌の転送: ペトリ プレートにペトリ プレートから

  1. 細菌の転送の 1 つのシナリオは、ペトリネット ワンプレート寒天成長媒体を含んでいる培養分離別、滅菌するペトリネット プレートの成長を表示するからです。
  2. まず、純粋な細菌培養を含むペトリネット プレートが少し開いたし、寒天表面に熱い、滅菌接種ループを軽きます。
  3. 冷却接種ループを用いた平板の表面から 1 つの隔離されたコロニーを取得し、ペトリネット プレートを閉じます。
  4. 少し半開きのふた付きの文化媒体を含む新鮮なペトリネット プレートを使用して分離するには、連勝を実行します。
  5. 分離連勝 (3 プレートごと合計) の各部分のためには、接種したループを使用する直前を炎-殺菌します。また、炎-滅菌ループを使用して可能性がありますまたは接種ループと接触したラボで他人への配慮とベンチ表面の汚染を防止するために最終的な連勝が実行された後にだけ。
  6. 一晩の成長のための定温器にすじ状のプレートを配置します。

3. 細菌の転送: ペトリ プレートにスープ文化から

  1. 細菌の転送の 2 番目のシナリオは、成長培地を含む滅菌ペトリ プレートに、濁度によって一般に観測された成長を展示スープ文化からです。
  2. 純粋な細菌培養を含むテスト チューブ (またはフラスコ) からキャップをはずし、炎のホットな部分を介して 2 〜 3 倍のコンテナー開口部を渡します。汚染を防ぐためには、設定しないでくださいキャップ ベンチトップに。
  3. 慎重にチューブ/フラスコに滅菌接種ループを下げるスープ文化への挿入直前に冷却するコンテナーの側に対してカチッと。
  4. スープ文化 (図 5) の 1 つの loopful を削除し、すぐにキャップを交換します。
    Figure 5
    図 5:スープ文化の 1 つの loopful.
  5. 少し半開きのふた付きの文化媒体を含む新鮮なペトリネット プレートを使用して分離するには、連勝を実行します。
  6. 連勝 (3 プレートごと合計) の各部分のためには、接種したループを使用する直前を炎-殺菌します。また、炎-滅菌ループ後接種ループを使用できるラボで他人への配慮とベンチ表面の汚染を防止するために最終的な連勝が実行された後にだけ。
  7. 一晩の成長のための定温器に分離の縞板を配置します。

4. 細菌の転送: ペトリ プレート滅菌液体培地への成長から

  1. 細菌の転送の 3 番目のシナリオは、無菌の液体の成長媒体を含んでいる管/フラスコに孤立した文化連勝を含むペトリネット プレートからです。
  2. 少し純粋な細菌培養を含むペトリネット プレートを開き、寒天培地の表面に軽くタップしてホット接種ループをクールします。
  3. 冷却接種ループを用いた平板の表面から 1 つの隔離されたコロニーを取得し、ペトリネット プレートを閉じます。
  4. テスト チューブ (またはフラスコ) 無菌の液体を含んでいる成長媒体からキャップをはずし、2 〜 3 回炎のホットな部分を使用してコンテナーのオープニングを渡します。汚染を防ぐためには、設定しないでくださいキャップ ベンチトップ.
  5. 慎重に、液体スープの中に抽出したコロニーを下げる, 細菌を解放するためにループを振といます。すぐにキャップを交換します。
  6. 炎 - 接種ループ使用後ラボで他人への配慮とベンチ表面の汚染防止のための滅菌接種ループ。
  7. 場所の成長のための定温器にフラスコの一夜します。
  8. 孵化翌日からフラスコを削除します。カルチャを列挙するために、希釈系列を実行します。
  9. アガロース文化メディアにシリーズから希釈液をプレートし、プレートを一晩インキュベートします。
  10. 次の日、プレートを削除し、任意の汚染を観察します。

5. 細菌の転送: 滅菌液体培にスープ文化から

  1. 細菌の転送の 4 番目のシナリオは、無菌の液体の成長媒体を含んでいる管/フラスコに成長を展示スープ文化からです。
  2. 純粋な細菌培養を含むテスト チューブ (またはフラスコ) からキャップをはずし、炎のホットな部分を 2 回コンテナーのオープニングを渡します。汚染を防ぐためには、設定しないでくださいキャップ ベンチトップに。
  3. 慎重にチューブ/フラスコに接種したループを下げるスープ文化への挿入直前に冷却するコンテナーの側に対してカチッと。
  4. スープ文化の 1 つの loopful を削除し、すぐにキャップを交換します。
  5. テスト チューブ (またはフラスコ) 無菌の液体を含んでいる成長媒体からキャップをはずし、炎.のホットな部分を 2 回コンテナーのオープニングを渡す汚染を防ぐためには、設定しないでくださいキャップ ベンチトップに。
  6. 慎重に滅菌液体スープ中に抽出した loopful を下げ、細菌を解放するためにループを振といます。すぐにキャップを交換します。
  7. 炎 - 接種ループ使用後ラボで他人への配慮とベンチ表面の汚染防止のための滅菌接種ループ (図 6)。
    Figure 6
    図 6: 接種ループ回転赤ホットのブンゼン バーナーで滅菌されている中です。
  8. 場所の成長のための定温器にフラスコの一夜します。
  9. 孵化翌日からフラスコを削除します。カルチャを列挙するために、希釈系列を実行します。
  10. アガロース文化メディアにシリーズから希釈液をプレートし、プレートを一晩インキュベートします。
  11. 次の日、プレートを削除し、任意の汚染を観察します。

無菌は、微生物学では基本的な技術であり環境研究の重要なアプリケーションがあります。

場合微生物学的文化が汚染されて、時間、労働、「クリーンアップ」またはユニークな環境から分離された文化、特に珍しい置換するラボの必要とされる金融のコストが非常に高いと、法外な、いくつかサンプルは、交換できない場合があります。

無菌技術の適切な使用は、試薬、培地、環境試料の細菌や真菌の汚染の可能性を低減、またサンプル間の交差汚染を避けます。また、病原体を使用するとき特に重要である、実験者に微生物の伝播の可能性を減少させる安全対策です。

無菌の原則を紹介します滅菌試薬と文化を維持するためにいくつかの重要なテクニックそして最後に、いくつかの環境の科学の使用。

無菌技術を使用しての目標を作成および維持滅菌作業環境、機器、試薬、試料の汚染を最小限に抑えることです。汚染の一般的な原因は、空気中の微生物、微生物実験室ベンチや機材、髪、ボディ、および研究者の衣服からのそれらの提示します。

2 つのタイプのエージェントが削除または実験室での汚染を防ぐ中央: 消毒剤と熱。70% エタノールなど希釈の漂白剤の解決策は、無菌作業に従事する前に実験者の手袋、作業面、機器の消毒に使われます。

同時に微生物やツール、ガラス製品、および液体媒体ですることができます熱殺された高圧、高温加圧蒸気への暴露を介して内容を殺菌室であります。加えて、ガラス棒などのツール拡散めっきと金属接種ループは熱殺菌のブンゼン バーナーなどの炎のソースを使用することができます。

炎の源の使用はまた無菌作業環境を確立する最も一般的な方法の 1 つです。炎からの熱無菌実験作業を行うことで、バーナーの近くから離れて浮遊汚染物をリフトする上昇気流を生成し、「滅菌フィールド」を作成、空気の対流が発生します。

今では、無菌テクニックと彼らが重要な理由の背後にある原理を理解は、無菌の作業環境を作成する、滅菌成長媒体を作ると異なる培養条件の間の細菌を無菌転送するためのプロトコルを行ってみましょう。

無菌作業を開始する前に適切な保護具や PPE に実験者にとって重要です。これの目的は、サンプルと実験室文化の汚染から実験者を防ぐために両方と研究する可能性のある病原微生物の伝達を防ぐためにです。PPE の項目には、実験用の上着や手袋、安全ゴーグルが含まれます。

次の手順は、適切に消毒し微生物サンプルの培養に使用される成長媒体に格納です。まず、固体培地成分の適切な量を量りし、液体溶剤脱イオン水、オートクレーブ コンテナー追加電磁攪拌棒、ホット プレート攪拌にコンテナーを配置低熱で固体培地成分を溶解との製造元によって指定され、攪拌の適切なボリュームに追加。

中のコンテナーを閉じます。ガラス容器を使用すると、キャップのネジと、ない血管内部の空気オートクレーブ滅菌中に加熱による展開が、エスケープする必要があります、完全にキャップを締めてさい。脱出せずガスに容器破裂する可能性があります。器、オートクレーブ 121 ° c 20 分などの製造元の指示に従ってメディアをオートクレーブ テープの一部を入れてください。オートクレーブ後、オートクレーブ テープのストライプが黒、適切な温度に達したを示すになってことを確認します。

液体の成長媒体のため、室温まで冷ます、室温でまたは適切な冷凍保存します。寒天ベース固体成長媒体、それらを冷ます約 50 ° C にし、滅菌シャーレに注ぐ。冷却し、適切な温度で保存する前に固める寒天を許可します。

熱に敏感な部品が存在するためオートクレーブすることはできませんメディア、フィルターは、0.22 μ m フィルターを使用して滅菌します。

微生物学的仕事のコア技術は、無菌固体と液体の両方の異なる成長媒体間細菌文化を転送することです。開始、する前に消毒剤でラボ ベンチ表面をきれいにします。これは文化か生殖不能媒体の汚染リスクを低減します。

細菌文化を転送する接種ループ、炎で加熱により使用前に消毒をする必要があると呼ばれるツールを使用よく。

炎のソースを入れます。ゆっくりと炎の先端を接種したループを渡します。ループはホット赤になります。固形寒天から細菌のコロニーを転送するには、ペトリネット プレートを少し開いて、軽く熱を殺す細菌を避けるために寒天表面の空の部分に熱い接種ループ。接種ループ単一コロニーをこすり、プレートを閉じます。

液体の成長媒体から細菌を転送するには、文化容器からキャップを取り外します。汚染を防ぐために回避ベンチの上にキャップを設定します。2-3 回炎のホットな部分を通って容器の口を渡します。その後、慎重にコンテナーの内側に熱い、滅菌接種ループに触れるし、スープ文化にそれを挿入する前に、涼しくてみましょう。文化の 1 つの loopful を削除し、すぐにキャップを閉じます。

得られた細菌を滅菌培に転送するため滅菌のスープとコンテナーからキャップをはずし、容器の口炎 2-3 回を渡します。その後、慎重に、培地へ接種ループを下げる、優しく細菌を解放する揺り動かしなさい。すぐにキャップを閉めてください。使用後接種ループを滅菌します。

滅菌寒天プレート上に細菌を転送する場合は、接種寒天と新鮮なペトリネット プレートのカバーを開きます。ストリーク バック前後寒天の 1 つのセクター間での細菌培養の接種ループ。ループを殺菌し、クールな寒天の空の部分に触れることによってそれ、寒天の別の縞鈍い角度で最初の 1-2 ストロークの最初の連勝を越えるが、ストロークの最初の連勝に触れないように必ず最初の連勝します。殺菌とストリー キング 2 回以上繰り返します。ペトリ プレートを閉じ、接種ループを消毒します。

一度接種すると, スープや寒天プレート、実行可能なカルチャを取得する特定の微生物の最適成長温度で培養する必要があります。固体媒体の芝生や細菌の連続ストランドが寒天の最初の 2 つの縞で覆われて表示されますが、最終的なストリークの個々 のコロニーを取得必要があります。貧しい人々 の無菌技術は、金型やプレートの他の汚染物質の成長になります。

無菌技術は環境から微生物サンプルを含む多くの実験で重要です。この研究では、研究者は隔離バクテリオファージが細菌感染ウイルスは、一般的な土壌細菌アースロバクターから。アースロバクター文化はまず無菌条件下で栽培しました。土壌サンプルされた洗浄バクテリオファージ バッファーでフィルタ リングし、バクテリオファージ溶液細菌文化と混合し、寒天プレートの上にメッキします。細菌の芝生とプレートになるが、開拓、またはウイルスが感染していたし、細菌を殺されたスポットで「プラーク」があるでしょう。ファージは、さらなる研究のためのこれらのプラクから精製できます。

ブンゼン バーナーを使用する以外は、使用する監督気流および無菌性を維持するためのフィルター、層流フードとして知られている専門のワークステーションで無菌作業環境を維持できます。ここでは、科学者は、潜在的な病原細菌および水試料からのウイルス分離する流フードで働いていた。これらの菌株は、アメーバとともに培養しました。アメーバは、通常食べるか""細菌を貪食、ため amoebal 消化に抵抗する、これらの有機体に残ることができたすべての細菌はまた、潜在的ひと細胞の存続し、病気を引き起こすできます。

最後に、滅菌条件は、マメ科植物の根粒形成植物 - 成長の植物によって使用されるアンモニアを大気中の窒素を「修正」細菌いっぱいの臓器など生態学的メカニズムの詳細な研究を許可します。ここで作成した研究者「小宇宙」植物培地で切欠きを有するペトリネット プレートを用いた根粒形成過程研究のための苗を入れるし、接種根粒菌の根粒形成と苗。流フードの無菌の環境は、他の細菌やカビの文化の汚染を防ぎます。

ゼウスの無菌環境科学技術関連のビデオを見てきただけ。今、無菌の労働条件が重要である理由を理解しておくべき無菌微生物実験; を実行する方法無菌技術の環境研究への応用。いつも見てくれてありがとう!

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

To watch full video, login or sign up!
If your institution is subscribed to the
Environmental Microbiology
section, you can access that content off-site by login or signing up with your institutional email.
Sign In with Shibboleth

or

We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

RECOMMEND JoVE