Técnica aséptica en ciencias ambientales

Environmental Microbiology
 

Overview

Fuente: Laboratorios del Dr. Ian Pepper y el Dr. Charles Gerba - Universidad de Arizona
Demostrando autor: Luisa Ikner

Técnica aséptica es una habilidad fundamental ampliamente practicada en el campo de la Microbiología Ambiental que requiere un equilibrio de mindfulness y práctica en el laboratorio. Uso correcto de esta técnica reduce la probabilidad de contaminación bacteriana o micótica de reactivos, medios de cultivo y muestras ambientales. También es vital para garantizar la integridad de los datos y mantener la pureza de las bibliotecas de cultura que puede ser conformada por muy rara y difícil de cepas en condiciones asépticas. Fuentes de contaminación en el ambiente de laboratorio incluyen aire microorganismos (incluidos los adherirse al polvo y la pelusa partículas) microbios presentan en el espacio de trabajo de banco de laboratorio y cristalería no esterilizada o equipo y microbios transfieren desde el cuerpo y el cabello del investigador. El uso de la técnica aséptica es también una medida de seguridad que reduce el potencial para la transmisión de microorganismos a los investigadores, que es particularmente importante cuando se trabaja con agentes patógenos.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Fundamentos de la Microbiología Ambiental. Técnica aséptica en ciencias ambientales. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Principles

El objetivo de la utilización de técnicas asépticas es crear y mantener un ambiente estéril de trabajo, equipos y reactivos, con el fin de minimizar la contaminación de las muestras biológicas. Para ello, el espacio de trabajo y algunas herramientas se pueden desinfectar con productos químicos como el etanol al 70% y diluir blanqueador. También es importante para el investigador a equipo de protección personal (EPP) como una bata, guantes, y gafas de seguridad.

Medios y reactivos pueden esterilizarse mediante filtro aparatos de esterilización que emplean filtros de 0.22 μm, que quita con eficacia la mayoría de los microorganismos como las bacterias. Por otra parte, muchos reactivos y equipos también se pueden esterilizar en calor alto. Por ejemplo, microbios o en herramientas, cristalería y medios líquidos pueden ser muerto de calor en una autoclave, que es una cámara que esteriliza el contenido vía la exposición a alta temperatura de vapor a presión. Además, algunas herramientas pueden ser esterilizados de calor usando una fuente de llama, como un mechero de Bunsen.

El uso de una fuente de fuego es también una de las maneras más comunes para establecer un ambiente de trabajo aséptico. El calor de la llama provoca convección del aire, generando una corriente ascendente que eleva cualquier contaminantes en el aire de las proximidades del quemador y la creación de un "campo estéril" en el que llevar a cabo trabajo experimental aséptico.

Procedure

1. preparación para el trabajo aséptico

  1. Obtener y aplicar los siguientes elementos de la PPE: bata de laboratorio, guantes de látex o de nitrilo (sin desgarros o agujeros) y gafas de seguridad (figura 1). Para seguridad en caso de utilizar una llama abierta, atar el cabello largo.
    Figure 1
    Figura 1: PPE: una bata de laboratorio, guantes de látex y gafas de seguridad.
  2. Un segundo aspecto importante de la técnica aséptica es la correcta esterilización y almacenamiento de los medios de comunicación/reactivos a utilizarse en el laboratorio. Preparación de medio líquido caldo (p. ej., caldo de soja tríptica) y agar-medios de comunicación (p. ej., R2A) pesando la cantidad adecuada de polvo seco de la base, que se agrega a la cantidad apropiada de agua desionizada.
  3. Para el medio de caldo disolver el polvo en un plato caliente con poco calor aplicado y dispensar el líquido en volúmenes de 100 mL en frascos de vidrio tapa de rosca o en volúmenes de 10 mL en tubos de ensayo de vidrio tapa de rosca. Utilizando una barra de agitación magnética, agitar el medio de agarosa en el agitador de placa calefactora hasta que el polvo se haya disuelto completamente.
  4. Aplique cinta de autoclave a los envases y autoclave de los medios de comunicación según las instrucciones del fabricante (p. ej., 20 min a 121 ° C) (figuras 2 y 3). Tenga en cuenta que el color de las rayas en la cinta de autoclave debe cambiar de blanco (autoclave previo) a negro (post-autoclave). Aunque el cambio de color indica generalmente que la esterilización fue exitosa, esterilidad comprueba utilizando kits de la tira de esporas puede llevarse a cabo para verificar el proceso de esterilización en autoclave.
    Figure 2
    Figura 2: Cinta de Autoclave se aplica al material.
    Figure 3
    Figura 3: Tenga en cuenta el cambio de color de las rayas en la cinta de autoclave del blanco (autoclave previo) a negro (post-autoclave).
  5. Enfriar los caldos líquidos a temperatura ambiente y luego almacenar a temperatura ambiente o refrigerada a 4 ° C.
  6. Enfriar el medio de agarosa colocando el recipiente en un baño de agua a 50 ° C. Una vez fríos, los medios de comunicación se pueden verter en placas de Petri estériles. Permitir que el medio a enfriar y solidificar y consolidar almacenamiento bajo temperaturas especificadas por el fabricante.
  7. Hay varias variedades de medios de cultivo que no puede ser esterilizado como las altas temperaturas degradan ingredientes críticos. Esterilizar estos requieren filtro de esterilización mediante un sistema de filtración de vacío empleando un filtro de 0,22 μm, seguido de almacenamiento a la temperatura adecuada.
  8. Antes de realizar el trabajo en el Banco, desinfectar la superficie con una solución apropiada (p. ej., 500 ppm de cloro). Esto reduce el riesgo de transferencia de contaminantes de la superficie de trabajo para las culturas y medios estériles.
  9. Para establecer un campo estéril, encender un mechero de Bunsen. El tipo de llama más adecuado para metal esterilización inoculación bucles es una llama azul intenso, con un cono azul definitivo en el centro (figura 4).
    Figure 4
    Figura 4: Aislar a una transferencia de bacterias de una placa de Petri mostrando crecimiento de un cultivo a otro no inoculada placa de Petri conteniendo un medio de cultivo base de agar.
  10. Pase lentamente el asa de inoculación a través de la parte más caliente de la llama (punta del cono azul). El bucle debe virar a rojo caliente con el fin de esterilización.

2. traslados bacterianas: De placa de Petri para la placa de Petri

  1. Un escenario de la transferencia de bacterias es de una placa de Petri mostrando crecimiento de una placa de Petri aislante a otro, estéril cultivada que contiene un medio de cultivo base de agar.
  2. Para comenzar, abra ligeramente la placa de Petri que contiene el cultivo bacteriano puro y golpee suavemente el asa de inoculación esterilizada, caliente sobre la superficie del agar.
  3. Recuperar una colonia aislada de la superficie de la placa utilizando el asa de inoculación refrescado y cierre la placa de Petri.
  4. Realizar una racha de aislamiento utilizando una nueva placa de Petri que contenga medio de cultivo, con la tapa entreabierta.
  5. Para cada porción de la franja de aislamiento (3 total por placa), llama-esterilizar el asa de inoculación justo antes de usar. También, llama-esterilizar el asa justo después de la racha final se realiza con el fin de evitar la contaminación de la superficie del Banco y como una consideración a los demás en el laboratorio que más tarde puede utilizar o entrar en contacto con las asas de inoculación.
  6. Coloque las placas veteadas en una incubadora para el crecimiento durante la noche.

3. bacterianas transferencias: Del caldo de cultivo en placa de Petri

  1. Un segundo escenario de la transferencia de bacterias es de un cultivo en caldo exhibiendo crecimiento general observado por turbidez a una placa de Petri estéril con medio de cultivo.
  2. Retire la tapa del tubo (o frasco) conteniendo el cultivo bacteriano puro y pasar a la apertura del envase x 2-3 a través de la parte más caliente de la llama. Para evitar la contaminación, no ponga la tapa sobre la mesa.
  3. Baje con cuidado el asa de inoculación esterilizada en la cubeta de tubo y presione suavemente contra el costado del recipiente para enfriar justo antes de la inserción en el caldo de cultivo.
  4. Quitar un asa llena de caldo de cultivo (figura 5) y vuelva a colocar inmediatamente la tapa.
    Figure 5
    Figura 5: Un asa llena de caldo de cultivo.
  5. Realizar una racha de aislamiento utilizando una nueva placa de Petri que contenga medio de cultivo, con la tapa entreabierta.
  6. Para cada parte de la raya (3 total por placa), llama-esterilizar el asa de inoculación justo antes de usar. También, llama-esterilizar el lazo justo después de la racha final se realiza con el fin de evitar la contaminación de la superficie del Banco y como una consideración a los demás en el laboratorio que más tarde pueda utilizar las asas de inoculación.
  7. Coloque las placas de rayas para el aislamiento en una incubadora para el crecimiento durante la noche.

4. bacterianas transferencias: De la placa de Petri con el crecimiento en medio líquido estéril de

  1. Un tercer escenario de la transferencia de bacterias es de una placa de Petri que contienen una racha aislada cultura a un tubo/frasco que contenga medio de cultivo líquido estéril.
  2. Un poco abrir la placa de Petri que contiene el cultivo bacteriano puro y enfriar el asa de inoculación caliente golpeando suavemente sobre la superficie del agar.
  3. Recuperar una colonia aislada de la superficie de la placa utilizando el asa de inoculación refrescado y cierre la placa de Petri.
  4. Quite la tapa del tubo de ensayo (o frasco) que contiene el líquido estéril medio de crecimiento y pasar la apertura del envase 2 a 3 veces a través de la parte más caliente de la llama. Para evitar la contaminación, no ponga la tapa en la mesa.
  5. Baje con cuidado la Colonia extraída en el medio líquido caldo y frote suavemente el bucle para liberar las bacterias. Inmediatamente vuelva a colocar la tapa.
  6. Llama-esterilizar el asa de inoculación para prevenir la contaminación de la superficie del Banco y como una consideración a los demás en el laboratorio que más tarde pueda utilizar las asas de inoculación.
  7. Lugar el frasco en una incubadora para el crecimiento durante la noche.
  8. Retire el frasco de incubación el día siguiente. Realizar una serie de diluciones para enumerar la cultura.
  9. Las diluciones de la serie sobre los medios de cultivo de la agarosa de la placa e incubar las placas durante la noche.
  10. Retire las placas al día siguiente y observar para cualquier tipo de contaminación.

5. transferencias bacterianas: De caldo de cultivo al medio de cultivo líquido estéril

  1. Un cuarto escenario de la transferencia de bacterias es de un cultivo en caldo exhibiendo crecimiento a un tubo/frasco que contenga medio de cultivo líquido estéril.
  2. Retire la tapa del tubo (o frasco) conteniendo el cultivo bacteriano puro y pasar la apertura del envase dos veces a través de la parte más caliente de la llama. Para evitar la contaminación, no ponga la tapa sobre la mesa.
  3. Cuidadosamente baje el asa de inoculación en el frasco de tubo y presione suavemente contra el costado del recipiente para enfriar justo antes de la inserción en el caldo de cultivo.
  4. Quitar un asa llena de caldo de cultivo y vuelva a colocar inmediatamente la tapa.
  5. Quite la tapa del tubo de ensayo (o frasco) que contiene el líquido estéril medio de crecimiento y pasar la apertura del envase dos veces a través de la parte más caliente de la llama. Para evitar la contaminación, no ponga la tapa sobre la mesa.
  6. Cuidadosamente baje el asa llena extraído en el medio caldo líquido estéril y frote suavemente el bucle para liberar las bacterias. Inmediatamente vuelva a colocar la tapa.
  7. Llama-esterilizar el asa de inoculación (figura 6) con el fin de evitar la contaminación de la superficie del Banco y como una consideración a los demás en el laboratorio que más tarde pueda utilizar las asas de inoculación.
    Figure 6
    Figura 6: Inocular lazo rojo que da vuelta caliente mientras se esterilizan con un mechero de Bunsen.
  8. Lugar el frasco en una incubadora para el crecimiento durante la noche.
  9. Retire el frasco de incubación el día siguiente. Realizar una serie de diluciones para enumerar la cultura.
  10. Las diluciones de la serie sobre los medios de cultivo de la agarosa de la placa e incubar las placas durante la noche.
  11. Retire las placas al día siguiente y observar para cualquier tipo de contaminación.

Técnica aséptica es una habilidad fundamental en Microbiología y tiene aplicaciones cruciales en la investigación ambiental.

Si las culturas microbiológicas están contaminadas, el tiempo, el trabajo y el costo financiero que se requiere de un laboratorio de "limpiar" o reemplazar las culturas, particularmente raras aislados de ambientes únicos, podría ser muy elevado y prohibitivo, y algunas muestras pueden ser insustituibles.

Uso adecuado de técnicas asépticas reduce la posibilidad de contaminación bacteriana y fúngica de reactivos, medios de cultivo y muestras ambientales y también evita la contaminación cruzada entre muestras. También es una medida de seguridad que disminuye la potencial transmisión de los microbios al experimentador, que es especialmente importante cuando se trabaja con agentes patógenos.

Este video presenta los principios de asepsia; varias técnicas importantes para mantener los reactivos estériles y las culturas; y por último, algunos de sus usos en ciencias ambientales.

El objetivo de la utilización de técnicas asépticas es crear y mantener un ambiente estéril de trabajo, equipos y reactivos, con el fin de minimizar la contaminación de las muestras biológicas. Fuentes comunes de contaminación son los microorganismos aerotransportados, microbios presentan en el Banco del laboratorio o equipo y las del pelo, el cuerpo y la ropa del investigador.

Dos tipos de agentes son fundamentales para eliminar o prevenir la contaminación en el laboratorio: desinfectantes químicos y calor. Soluciones como el 70% de etanol y diluir blanqueador se utilizan para la desinfección de equipos, superficies de trabajo y guantes de experimentadores antes de participar en trabajo aséptico.

Al mismo tiempo, microbios o en herramientas, cristalería y medios líquidos pueden ser muerto de calor en una autoclave, que es una cámara que esteriliza el contenido vía la exposición a alta temperatura de vapor a presión. Además, herramientas tales como barras de cristal utilizadas para difundir la galjanoplastia y loops de inoculación metal pueden ser esterilizado de calor usando una fuente de llama, como un mechero de Bunsen.

El uso de una fuente de fuego es también una de las maneras más comunes para establecer un ambiente de trabajo aséptico. El calor de la llama provoca convección del aire, generando una corriente ascendente que eleva cualquier contaminantes en el aire de las proximidades del quemador y la creación de un "campo estéril" en el que llevar a cabo trabajo experimental aséptico.

Ahora que usted entiende los principios de técnicas asépticas y por qué son importantes, vamos a ir a través de un protocolo para crear un ambiente de trabajo aséptico, confección de medios de cultivo estéril y asépticamente transferir bacterias entre diversas condiciones de cultivo.

Antes de comenzar el trabajo aséptico, es importante para el experimentador a don apropiado equipo de protección personal o EPP. El propósito de esto es tanto para evitar que al experimentador contaminen las muestras y los cultivos de laboratorio y también para evitar a la transferencia de microbios potencialmente patógenos para el investigador. Artículos PPE incluyen una bata de laboratorio, guantes y gafas de seguridad.

El siguiente paso es esterilizar y almacenar los medios de crecimiento para cultivo las muestras microbianas. En primer lugar, pesar la cantidad apropiada de componentes sólidos del medio y añadir el volumen adecuado de líquido disolvente especificado por el fabricante, tales como agua desionizada, en un recipiente apto para el autoclave agregar una barra de agitación magnética, coloque el recipiente sobre un agitador de placa caliente y disolver los componentes medio sólidos con baja temperatura y revolviendo.

Cerrar los envases medianos. Si utiliza un recipiente de vidrio con tapa de rosca, asegúrese de no apriete la tapa totalmente, el aire dentro de los vasos aumentará debido al calentamiento en autoclave y escapar. Sin escape, el gas puede causar la nave a la ruptura. Poner un trozo de cinta de autoclave en los vasos y autoclave de los medios de comunicación según las instrucciones del fabricante, como 20 min a 121 ° C. Después de la esterilización en autoclave, asegúrese de que las rayas de las cintas autoclave activado negras, indicando que se alcanzó la temperatura adecuada.

Para medios de cultivo líquido, dejan enfriar a temperatura ambiente y guárdelos a temperatura ambiente o con refrigeración según sea el caso. Para los medios de agar sólido crecimiento, dejan enfriar a aproximadamente 50 ° C y, a continuación, verter en placas de Petri estériles. Permitir que el agar se enfríe y solidifique antes de almacenar a la temperatura adecuada.

Para los medios de comunicación que no pueden ser esterilizado debido a la presencia de componentes sensibles al calor, filtro esterilice usando un filtro de 0,22 μm.

Una técnica de base en el trabajo microbiológico debe transferir asépticamente las culturas bacterianas entre los medios de crecimiento, sólidos y líquidos. Antes del principio, limpie la superficie del Banco de laboratorio con un desinfectante. Esto reduce el riesgo de contaminación de cultivos o medios estériles.

Transferencia de cultivos bacterianos comúnmente hace uso de una herramienta llamada un asa de inoculación, que debe ser esterilizados antes del uso por la calefacción en una llama.

Encender una fuente de la llama. Pase lentamente el asa de inoculación a través de la punta de la llama. El lazo se vuelve rojo caliente. Para transferir una colonia de bacterias de una placa de agar sólido, abrir un poco la placa de Petri y golpee suavemente el asa de inoculación caliente sobre una zona vacía de la superficie del agar para evitar el calor mata las bacterias. Raspar una sola Colonia con el asa de inoculación y cerrar la placa.

Para transferir bacterias de un medio de crecimiento líquido, retire la tapa del recipiente de cultivo. Para ayudar a prevenir la contaminación, evitando bajar la tapa en el Banco. Pasar la boca del envase 2 - 3 veces a través de la parte más caliente de la llama. Luego, con cuidado toque el asa de inoculación esterilizada, caliente en el interior del recipiente y déjela enfriar antes de introducirlo en el caldo de cultivo. Quitar un asa llena de la cultura y cerrar inmediatamente la tapa.

Para transferir las bacterias obtenidas a un medio de cultivo estéril, retire la tapa de un recipiente con el caldo estéril y pasar el contenedor de apertura a través de la llama 2 - 3 veces. Luego, cuidadosamente baje el asa de inoculación en el medio y agite suavemente para liberar las bacterias. Inmediatamente cierre la tapa. Esterilizar el asa de inoculación después de su uso.

Si la transferencia de bacterias en una placa de agar estéril, abra la tapa de un fresco plato de Petri con agar no inoculado. Raya el asa de inoculación con el cultivo bacteriano y atrás a través de un sector del agar. Esterilice el asa y fresco que al tocar una zona vacía del agar, luego realizar otra raya en el agar en un ángulo obtuso en la primera racha, asegurándose de que al cruzar la primera raya a los primeros trazos 1-2 pero evite tocar la primera racha en movimientos posteriores. Repita la esterilización y rayas 2 veces más. Cierre la placa de Petri y esterilizar el asa de inoculación.

Una vez inoculado, el caldo o agar de la placa entonces debe incubarse a la temperatura ideal de crecimiento para el microorganismo determinado obtener cultura viable. En medio sólido, un césped o un filamento continuo de bacterias sería visible en agar cubierto por las dos primeras vetas, pero colonias individuales deben obtenerse en la racha final. Técnicas asépticas pobres resultaría en el crecimiento de moho y otros contaminantes en la placa.

Técnicas asépticas son importantes en muchos experimentos con muestras de microbios del ambiente. En este estudio, los investigadores aislaron bacteriófagos, que son bacterias que infectan los virus, de la bacteria común del suelo Arthrobacter. Arthrobacter culturas primero fueron cultivadas bajo condiciones asépticas. Muestras de suelo fueron lavadas y filtradas en tampón de fago, y la solución de phage era mezclada con la cultura bacteriana y revestida en placas de agar. Forma un césped bacteriano en la placa, pero habría claros o "placas", en lugares donde el virus había infectado y matado la bacteria. Phage entonces podría ser purificada de estas placas para el estudio adicional.

Que no mecheros Bunsen, entornos de trabajo aséptico se pueden mantener también en estaciones de trabajo especializadas conocidas como campanas de flujo laminar, que el uso dirigido de flujo de aire y filtros para mantener la esterilidad. Aquí, los científicos trabajaron en una campana de flujo para aislar posibles bacterias patógenas y los virus de las muestras de agua. Estos aislamientos fueron entonces cultivados junto con amebas. Porque las amebas normalmente comerán o "fagocitar" a las bacterias, las bacterias que eran capaces de resistir la digestión amoebal y permanecen en estos organismos también pueden permanecer viables en las células humanas y causan enfermedades.

Finalmente, las condiciones de esterilidad permiten estudio detallado de los mecanismos ecológicos tales como la formación de nódulos de la raíz de leguminosas plantas - órganos llenos de bacterias que "fijan" el nitrógeno atmosférico en amoníaco, que es utilizado por la planta para el crecimiento. Los investigadores aquí creados "microcosmos" para estudiar el proceso de nodulación con muesca placas de Petri con medio de cultivo de plantas, coloca las plántulas en ellos e inocular las plántulas con bacterias rizobios formando nódulos. El ambiente aséptico de la campana de flujo previene la contaminación de las culturas con otras bacterias u hongos.

Sólo has visto video de Zeus en técnicas asépticas en ciencias ambientales. Ahora debe comprender por qué las condiciones asépticas de trabajo son importantes; Cómo llevar a cabo asépticamente experimentos microbiológicos; y algunas aplicaciones de técnicas asépticas para la investigación ambiental. ¡Como siempre, gracias por ver!

Results

El resultado del procedimiento demuestra la técnica aséptica adecuada y mala técnica aséptica. Figura 7 muestra la contaminación que puede surgir de la mala técnica aséptica al verter a las placas de agarosa (top placa: medio estéril; las placas inferiores: contaminados de los medios de comunicación).

Figure 7
Figura 7: contaminación que puede surgir de la mala técnica aséptica al verter a las placas de agarosa. Superior de la placa: medio estéril; platos de fondo: contaminados de los medios de comunicación.

Applications and Summary

Que no mecheros Bunsen, entornos de trabajo aséptico se pueden mantener también en estaciones de trabajo especializadas conocidas como campanas de flujo laminar, que el uso dirigido de flujo de aire y filtros para mantener la esterilidad.

El uso correcto de la técnica aséptica es vital para microbiólogos ambientales cuando se muestreo en el campo y en el laboratorio cuando se trabaja con los medios, reactivos y cultivados aislados.  Mala técnica aséptica en el campo puede resultar en la transferencia de microorganismos de muestras ambientales críticas al técnico, así como la contaminación de microbios de una muestra a otra. Este tipo de eventos es de importancia, por ejemplo, en estudios de ecología microbiana que buscan identificar y comparar las poblaciones de bacterias y hongos que pueden estar presentes en un bioma dado. Contaminación de estas muestras puede resultar en una pérdida de integridad de los datos. Técnica aséptica también es crítica para el mantenimiento de cepas de laboratorio procedentes de muestreo de campo o desde los repositorios de cultura microbianas y celular bien establecidas. El tiempo, el trabajo y el costo financiero que se requiere de un laboratorio en un esfuerzo por "limpiar" o reemplazar cultivos contaminados, particularmente raros aislados de ambientes únicos, podría ser muy elevado y prohibitivo, como algunos aislamientos pueden ser irremplazables.

1. preparación para el trabajo aséptico

  1. Obtener y aplicar los siguientes elementos de la PPE: bata de laboratorio, guantes de látex o de nitrilo (sin desgarros o agujeros) y gafas de seguridad (figura 1). Para seguridad en caso de utilizar una llama abierta, atar el cabello largo.
    Figure 1
    Figura 1: PPE: una bata de laboratorio, guantes de látex y gafas de seguridad.
  2. Un segundo aspecto importante de la técnica aséptica es la correcta esterilización y almacenamiento de los medios de comunicación/reactivos a utilizarse en el laboratorio. Preparación de medio líquido caldo (p. ej., caldo de soja tríptica) y agar-medios de comunicación (p. ej., R2A) pesando la cantidad adecuada de polvo seco de la base, que se agrega a la cantidad apropiada de agua desionizada.
  3. Para el medio de caldo disolver el polvo en un plato caliente con poco calor aplicado y dispensar el líquido en volúmenes de 100 mL en frascos de vidrio tapa de rosca o en volúmenes de 10 mL en tubos de ensayo de vidrio tapa de rosca. Utilizando una barra de agitación magnética, agitar el medio de agarosa en el agitador de placa calefactora hasta que el polvo se haya disuelto completamente.
  4. Aplique cinta de autoclave a los envases y autoclave de los medios de comunicación según las instrucciones del fabricante (p. ej., 20 min a 121 ° C) (figuras 2 y 3). Tenga en cuenta que el color de las rayas en la cinta de autoclave debe cambiar de blanco (autoclave previo) a negro (post-autoclave). Aunque el cambio de color indica generalmente que la esterilización fue exitosa, esterilidad comprueba utilizando kits de la tira de esporas puede llevarse a cabo para verificar el proceso de esterilización en autoclave.
    Figure 2
    Figura 2: Cinta de Autoclave se aplica al material.
    Figure 3
    Figura 3: Tenga en cuenta el cambio de color de las rayas en la cinta de autoclave del blanco (autoclave previo) a negro (post-autoclave).
  5. Enfriar los caldos líquidos a temperatura ambiente y luego almacenar a temperatura ambiente o refrigerada a 4 ° C.
  6. Enfriar el medio de agarosa colocando el recipiente en un baño de agua a 50 ° C. Una vez fríos, los medios de comunicación se pueden verter en placas de Petri estériles. Permitir que el medio a enfriar y solidificar y consolidar almacenamiento bajo temperaturas especificadas por el fabricante.
  7. Hay varias variedades de medios de cultivo que no puede ser esterilizado como las altas temperaturas degradan ingredientes críticos. Esterilizar estos requieren filtro de esterilización mediante un sistema de filtración de vacío empleando un filtro de 0,22 μm, seguido de almacenamiento a la temperatura adecuada.
  8. Antes de realizar el trabajo en el Banco, desinfectar la superficie con una solución apropiada (p. ej., 500 ppm de cloro). Esto reduce el riesgo de transferencia de contaminantes de la superficie de trabajo para las culturas y medios estériles.
  9. Para establecer un campo estéril, encender un mechero de Bunsen. El tipo de llama más adecuado para metal esterilización inoculación bucles es una llama azul intenso, con un cono azul definitivo en el centro (figura 4).
    Figure 4
    Figura 4: Aislar a una transferencia de bacterias de una placa de Petri mostrando crecimiento de un cultivo a otro no inoculada placa de Petri conteniendo un medio de cultivo base de agar.
  10. Pase lentamente el asa de inoculación a través de la parte más caliente de la llama (punta del cono azul). El bucle debe virar a rojo caliente con el fin de esterilización.

2. traslados bacterianas: De placa de Petri para la placa de Petri

  1. Un escenario de la transferencia de bacterias es de una placa de Petri mostrando crecimiento de una placa de Petri aislante a otro, estéril cultivada que contiene un medio de cultivo base de agar.
  2. Para comenzar, abra ligeramente la placa de Petri que contiene el cultivo bacteriano puro y golpee suavemente el asa de inoculación esterilizada, caliente sobre la superficie del agar.
  3. Recuperar una colonia aislada de la superficie de la placa utilizando el asa de inoculación refrescado y cierre la placa de Petri.
  4. Realizar una racha de aislamiento utilizando una nueva placa de Petri que contenga medio de cultivo, con la tapa entreabierta.
  5. Para cada porción de la franja de aislamiento (3 total por placa), llama-esterilizar el asa de inoculación justo antes de usar. También, llama-esterilizar el asa justo después de la racha final se realiza con el fin de evitar la contaminación de la superficie del Banco y como una consideración a los demás en el laboratorio que más tarde puede utilizar o entrar en contacto con las asas de inoculación.
  6. Coloque las placas veteadas en una incubadora para el crecimiento durante la noche.

3. bacterianas transferencias: Del caldo de cultivo en placa de Petri

  1. Un segundo escenario de la transferencia de bacterias es de un cultivo en caldo exhibiendo crecimiento general observado por turbidez a una placa de Petri estéril con medio de cultivo.
  2. Retire la tapa del tubo (o frasco) conteniendo el cultivo bacteriano puro y pasar a la apertura del envase x 2-3 a través de la parte más caliente de la llama. Para evitar la contaminación, no ponga la tapa sobre la mesa.
  3. Baje con cuidado el asa de inoculación esterilizada en la cubeta de tubo y presione suavemente contra el costado del recipiente para enfriar justo antes de la inserción en el caldo de cultivo.
  4. Quitar un asa llena de caldo de cultivo (figura 5) y vuelva a colocar inmediatamente la tapa.
    Figure 5
    Figura 5: Un asa llena de caldo de cultivo.
  5. Realizar una racha de aislamiento utilizando una nueva placa de Petri que contenga medio de cultivo, con la tapa entreabierta.
  6. Para cada parte de la raya (3 total por placa), llama-esterilizar el asa de inoculación justo antes de usar. También, llama-esterilizar el lazo justo después de la racha final se realiza con el fin de evitar la contaminación de la superficie del Banco y como una consideración a los demás en el laboratorio que más tarde pueda utilizar las asas de inoculación.
  7. Coloque las placas de rayas para el aislamiento en una incubadora para el crecimiento durante la noche.

4. bacterianas transferencias: De la placa de Petri con el crecimiento en medio líquido estéril de

  1. Un tercer escenario de la transferencia de bacterias es de una placa de Petri que contienen una racha aislada cultura a un tubo/frasco que contenga medio de cultivo líquido estéril.
  2. Un poco abrir la placa de Petri que contiene el cultivo bacteriano puro y enfriar el asa de inoculación caliente golpeando suavemente sobre la superficie del agar.
  3. Recuperar una colonia aislada de la superficie de la placa utilizando el asa de inoculación refrescado y cierre la placa de Petri.
  4. Quite la tapa del tubo de ensayo (o frasco) que contiene el líquido estéril medio de crecimiento y pasar la apertura del envase 2 a 3 veces a través de la parte más caliente de la llama. Para evitar la contaminación, no ponga la tapa en la mesa.
  5. Baje con cuidado la Colonia extraída en el medio líquido caldo y frote suavemente el bucle para liberar las bacterias. Inmediatamente vuelva a colocar la tapa.
  6. Llama-esterilizar el asa de inoculación para prevenir la contaminación de la superficie del Banco y como una consideración a los demás en el laboratorio que más tarde pueda utilizar las asas de inoculación.
  7. Lugar el frasco en una incubadora para el crecimiento durante la noche.
  8. Retire el frasco de incubación el día siguiente. Realizar una serie de diluciones para enumerar la cultura.
  9. Las diluciones de la serie sobre los medios de cultivo de la agarosa de la placa e incubar las placas durante la noche.
  10. Retire las placas al día siguiente y observar para cualquier tipo de contaminación.

5. transferencias bacterianas: De caldo de cultivo al medio de cultivo líquido estéril

  1. Un cuarto escenario de la transferencia de bacterias es de un cultivo en caldo exhibiendo crecimiento a un tubo/frasco que contenga medio de cultivo líquido estéril.
  2. Retire la tapa del tubo (o frasco) conteniendo el cultivo bacteriano puro y pasar la apertura del envase dos veces a través de la parte más caliente de la llama. Para evitar la contaminación, no ponga la tapa sobre la mesa.
  3. Cuidadosamente baje el asa de inoculación en el frasco de tubo y presione suavemente contra el costado del recipiente para enfriar justo antes de la inserción en el caldo de cultivo.
  4. Quitar un asa llena de caldo de cultivo y vuelva a colocar inmediatamente la tapa.
  5. Quite la tapa del tubo de ensayo (o frasco) que contiene el líquido estéril medio de crecimiento y pasar la apertura del envase dos veces a través de la parte más caliente de la llama. Para evitar la contaminación, no ponga la tapa sobre la mesa.
  6. Cuidadosamente baje el asa llena extraído en el medio caldo líquido estéril y frote suavemente el bucle para liberar las bacterias. Inmediatamente vuelva a colocar la tapa.
  7. Llama-esterilizar el asa de inoculación (figura 6) con el fin de evitar la contaminación de la superficie del Banco y como una consideración a los demás en el laboratorio que más tarde pueda utilizar las asas de inoculación.
    Figure 6
    Figura 6: Inocular lazo rojo que da vuelta caliente mientras se esterilizan con un mechero de Bunsen.
  8. Lugar el frasco en una incubadora para el crecimiento durante la noche.
  9. Retire el frasco de incubación el día siguiente. Realizar una serie de diluciones para enumerar la cultura.
  10. Las diluciones de la serie sobre los medios de cultivo de la agarosa de la placa e incubar las placas durante la noche.
  11. Retire las placas al día siguiente y observar para cualquier tipo de contaminación.

Técnica aséptica es una habilidad fundamental en Microbiología y tiene aplicaciones cruciales en la investigación ambiental.

Si las culturas microbiológicas están contaminadas, el tiempo, el trabajo y el costo financiero que se requiere de un laboratorio de "limpiar" o reemplazar las culturas, particularmente raras aislados de ambientes únicos, podría ser muy elevado y prohibitivo, y algunas muestras pueden ser insustituibles.

Uso adecuado de técnicas asépticas reduce la posibilidad de contaminación bacteriana y fúngica de reactivos, medios de cultivo y muestras ambientales y también evita la contaminación cruzada entre muestras. También es una medida de seguridad que disminuye la potencial transmisión de los microbios al experimentador, que es especialmente importante cuando se trabaja con agentes patógenos.

Este video presenta los principios de asepsia; varias técnicas importantes para mantener los reactivos estériles y las culturas; y por último, algunos de sus usos en ciencias ambientales.

El objetivo de la utilización de técnicas asépticas es crear y mantener un ambiente estéril de trabajo, equipos y reactivos, con el fin de minimizar la contaminación de las muestras biológicas. Fuentes comunes de contaminación son los microorganismos aerotransportados, microbios presentan en el Banco del laboratorio o equipo y las del pelo, el cuerpo y la ropa del investigador.

Dos tipos de agentes son fundamentales para eliminar o prevenir la contaminación en el laboratorio: desinfectantes químicos y calor. Soluciones como el 70% de etanol y diluir blanqueador se utilizan para la desinfección de equipos, superficies de trabajo y guantes de experimentadores antes de participar en trabajo aséptico.

Al mismo tiempo, microbios o en herramientas, cristalería y medios líquidos pueden ser muerto de calor en una autoclave, que es una cámara que esteriliza el contenido vía la exposición a alta temperatura de vapor a presión. Además, herramientas tales como barras de cristal utilizadas para difundir la galjanoplastia y loops de inoculación metal pueden ser esterilizado de calor usando una fuente de llama, como un mechero de Bunsen.

El uso de una fuente de fuego es también una de las maneras más comunes para establecer un ambiente de trabajo aséptico. El calor de la llama provoca convección del aire, generando una corriente ascendente que eleva cualquier contaminantes en el aire de las proximidades del quemador y la creación de un "campo estéril" en el que llevar a cabo trabajo experimental aséptico.

Ahora que usted entiende los principios de técnicas asépticas y por qué son importantes, vamos a ir a través de un protocolo para crear un ambiente de trabajo aséptico, confección de medios de cultivo estéril y asépticamente transferir bacterias entre diversas condiciones de cultivo.

Antes de comenzar el trabajo aséptico, es importante para el experimentador a don apropiado equipo de protección personal o EPP. El propósito de esto es tanto para evitar que al experimentador contaminen las muestras y los cultivos de laboratorio y también para evitar a la transferencia de microbios potencialmente patógenos para el investigador. Artículos PPE incluyen una bata de laboratorio, guantes y gafas de seguridad.

El siguiente paso es esterilizar y almacenar los medios de crecimiento para cultivo las muestras microbianas. En primer lugar, pesar la cantidad apropiada de componentes sólidos del medio y añadir el volumen adecuado de líquido disolvente especificado por el fabricante, tales como agua desionizada, en un recipiente apto para el autoclave agregar una barra de agitación magnética, coloque el recipiente sobre un agitador de placa caliente y disolver los componentes medio sólidos con baja temperatura y revolviendo.

Cerrar los envases medianos. Si utiliza un recipiente de vidrio con tapa de rosca, asegúrese de no apriete la tapa totalmente, el aire dentro de los vasos aumentará debido al calentamiento en autoclave y escapar. Sin escape, el gas puede causar la nave a la ruptura. Poner un trozo de cinta de autoclave en los vasos y autoclave de los medios de comunicación según las instrucciones del fabricante, como 20 min a 121 ° C. Después de la esterilización en autoclave, asegúrese de que las rayas de las cintas autoclave activado negras, indicando que se alcanzó la temperatura adecuada.

Para medios de cultivo líquido, dejan enfriar a temperatura ambiente y guárdelos a temperatura ambiente o con refrigeración según sea el caso. Para los medios de agar sólido crecimiento, dejan enfriar a aproximadamente 50 ° C y, a continuación, verter en placas de Petri estériles. Permitir que el agar se enfríe y solidifique antes de almacenar a la temperatura adecuada.

Para los medios de comunicación que no pueden ser esterilizado debido a la presencia de componentes sensibles al calor, filtro esterilice usando un filtro de 0,22 μm.

Una técnica de base en el trabajo microbiológico debe transferir asépticamente las culturas bacterianas entre los medios de crecimiento, sólidos y líquidos. Antes del principio, limpie la superficie del Banco de laboratorio con un desinfectante. Esto reduce el riesgo de contaminación de cultivos o medios estériles.

Transferencia de cultivos bacterianos comúnmente hace uso de una herramienta llamada un asa de inoculación, que debe ser esterilizados antes del uso por la calefacción en una llama.

Encender una fuente de la llama. Pase lentamente el asa de inoculación a través de la punta de la llama. El lazo se vuelve rojo caliente. Para transferir una colonia de bacterias de una placa de agar sólido, abrir un poco la placa de Petri y golpee suavemente el asa de inoculación caliente sobre una zona vacía de la superficie del agar para evitar el calor mata las bacterias. Raspar una sola Colonia con el asa de inoculación y cerrar la placa.

Para transferir bacterias de un medio de crecimiento líquido, retire la tapa del recipiente de cultivo. Para ayudar a prevenir la contaminación, evitando bajar la tapa en el Banco. Pasar la boca del envase 2 - 3 veces a través de la parte más caliente de la llama. Luego, con cuidado toque el asa de inoculación esterilizada, caliente en el interior del recipiente y déjela enfriar antes de introducirlo en el caldo de cultivo. Quitar un asa llena de la cultura y cerrar inmediatamente la tapa.

Para transferir las bacterias obtenidas a un medio de cultivo estéril, retire la tapa de un recipiente con el caldo estéril y pasar el contenedor de apertura a través de la llama 2 - 3 veces. Luego, cuidadosamente baje el asa de inoculación en el medio y agite suavemente para liberar las bacterias. Inmediatamente cierre la tapa. Esterilizar el asa de inoculación después de su uso.

Si la transferencia de bacterias en una placa de agar estéril, abra la tapa de un fresco plato de Petri con agar no inoculado. Raya el asa de inoculación con el cultivo bacteriano y atrás a través de un sector del agar. Esterilice el asa y fresco que al tocar una zona vacía del agar, luego realizar otra raya en el agar en un ángulo obtuso en la primera racha, asegurándose de que al cruzar la primera raya a los primeros trazos 1-2 pero evite tocar la primera racha en movimientos posteriores. Repita la esterilización y rayas 2 veces más. Cierre la placa de Petri y esterilizar el asa de inoculación.

Una vez inoculado, el caldo o agar de la placa entonces debe incubarse a la temperatura ideal de crecimiento para el microorganismo determinado obtener cultura viable. En medio sólido, un césped o un filamento continuo de bacterias sería visible en agar cubierto por las dos primeras vetas, pero colonias individuales deben obtenerse en la racha final. Técnicas asépticas pobres resultaría en el crecimiento de moho y otros contaminantes en la placa.

Técnicas asépticas son importantes en muchos experimentos con muestras de microbios del ambiente. En este estudio, los investigadores aislaron bacteriófagos, que son bacterias que infectan los virus, de la bacteria común del suelo Arthrobacter. Arthrobacter culturas primero fueron cultivadas bajo condiciones asépticas. Muestras de suelo fueron lavadas y filtradas en tampón de fago, y la solución de phage era mezclada con la cultura bacteriana y revestida en placas de agar. Forma un césped bacteriano en la placa, pero habría claros o "placas", en lugares donde el virus había infectado y matado la bacteria. Phage entonces podría ser purificada de estas placas para el estudio adicional.

Que no mecheros Bunsen, entornos de trabajo aséptico se pueden mantener también en estaciones de trabajo especializadas conocidas como campanas de flujo laminar, que el uso dirigido de flujo de aire y filtros para mantener la esterilidad. Aquí, los científicos trabajaron en una campana de flujo para aislar posibles bacterias patógenas y los virus de las muestras de agua. Estos aislamientos fueron entonces cultivados junto con amebas. Porque las amebas normalmente comerán o "fagocitar" a las bacterias, las bacterias que eran capaces de resistir la digestión amoebal y permanecen en estos organismos también pueden permanecer viables en las células humanas y causan enfermedades.

Finalmente, las condiciones de esterilidad permiten estudio detallado de los mecanismos ecológicos tales como la formación de nódulos de la raíz de leguminosas plantas - órganos llenos de bacterias que "fijan" el nitrógeno atmosférico en amoníaco, que es utilizado por la planta para el crecimiento. Los investigadores aquí creados "microcosmos" para estudiar el proceso de nodulación con muesca placas de Petri con medio de cultivo de plantas, coloca las plántulas en ellos e inocular las plántulas con bacterias rizobios formando nódulos. El ambiente aséptico de la campana de flujo previene la contaminación de las culturas con otras bacterias u hongos.

Sólo has visto video de Zeus en técnicas asépticas en ciencias ambientales. Ahora debe comprender por qué las condiciones asépticas de trabajo son importantes; Cómo llevar a cabo asépticamente experimentos microbiológicos; y algunas aplicaciones de técnicas asépticas para la investigación ambiental. ¡Como siempre, gracias por ver!

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