Pruebas para alimentos modificados genéticamente

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) identifica secuencias de ADN que se han insertado en la planta de GM. A diferencia de las proteínas, el ADN es una molécula relativamente estable, así fragmentos de ADN pueden ser aislados de los productos muy elaborados y son lo suficientemente intactos para ser amplificados por PCR. Ingenieros genéticos utilizan sólo un pequeño número de secuencias reguladoras (secuencias del promotor y terminador) para controlar la expresión de los genes insertados, y así que estas secuencias son comunes a la mayoría de los cultivos transgénicos. Las dos secuencias identificadas en este procedimiento son dos de las secuencias reguladoras más comunes, promotor del gen 35S del virus del mosaico del coliflor (CaMV) y el gen de terminator nopaline sintasa (NOS) de Agrobacterium tumefaciens.

Polimerización en cadena consiste en ciclos repetitivos, cada uno que consiste en la desnaturalización de la plantilla, primer recocido y extensión del primer recocido por Taq ADN polimerasa. Una vez que el ADN se extrae de los alimentos, se utiliza un termociclador para manipular rápidamente la temperatura, causando las etapas de los ciclos PCR.

La etapa de desnaturalización ocurre cuando las muestras se calientan rápidamente a 94 ° C, haciendo que los filamentos de la DNA separar. Enfriamiento rápido a 59 ° C permite cartillas templar a los filamentos de ADN separados y luego recalentar a 72 ° C para la Taq ADN polimerasa extender los iniciadores, hacer copias completas de cada filamento de la DNA y completar un ciclo termal.

Continuación, el ADN amplificado se puede ejecutar a través de un gel de agarosa con electroforesis para separar el DNA en bandas visibles para la identificación del gen promotor 35S y terminador NOS. ADN amplificado se carga en pozos en un extremo del gel, con un tinte de carga adquiridos que pesan la muestra para evitar la disolución en el búfer de circundante. El tinte de carga también proporciona un visual, por lo que se aprecia el movimiento de ADN durante la electroforesis en el tinte "frente". El proceso de electroforesis funciona mediante el uso de una corriente eléctrica separada en los extremos de cátodo y el ánodo. DNA se carga en el gel en el extremo más cercano al lado del cátodo de la cámara, y la carga negativa de ADN se siente atraída por el extremo del ánodo de la cámara y se tira a través de la agarosa. Grandes secuencias de ADN (aumento del número de pares de bases) no se pueden mover fácilmente a través de agarosa y se separarán hacia fuera temprano, mientras que las secuencias más pequeñas son capaces de viajar más lejos abajo del gel hacia el final del ánodo.

Un proceso de tinción ayuda a atar a la DNA para añadir contraste entre el gel de fondo y los bancos de ADN para mejor visualización de los resultados. Utilizando siempre lugares conocidos para los diferentes tamaños de secuencias de ADN que cada gel de prueba puede ser analizada para la presencia o ausencia del promotor 35S y genes terminator de enmiendas.

Los controles se utilizan para que DNA se extrae correctamente y para proporcionar una comparación a las muestras de alimentos de prueba. Planta comprada cartilla se agrega a cada muestra para proporcionar ácidos nucleicos común a todas las plantas. Esto permite una comprobación de control de calidad en el proceso de extracción de ADN, porque cualquier DNA de la planta extraída debe ser extendida con esta cartilla durante PCR y también puede considerarse en el gel después de electroforesis. Primer comprado para el 35S y los genes NOS sirven como control positivo para prever bandas de ADN en el gel de modificación genética. Si el control de la plantilla de GMO-positiva no ampliar, hay un problema con la reacción de PCR y puede confiar en un resultado de GMO-negativo de la comida de prueba. Un producto de alimentos no-GMO certificados también es adquirido y utilizado como control negativo para mostrar lo que la separación de ADN parece cuando ningún material genéticamente modificado está presente.

1. extracción de ADN de muestras de alimentos

1. Añadir 500 μl de la matriz de mezcla PCR comprado a cada uno de los 2 tubos de tapón de rosca con una pipeta de transferencia o micropipeta de volumen ajustable de 200-1.000 μl. Pipetee hacia arriba y hacia abajo con la pipeta entre cada alícuota para mezclar uniformemente la matriz de la polimerización en cadena.
2. Etiquetar un tubo de tapón de rosca "sin transgénicos" y otra "prueba".
3. Pesar 0,5 g de alimentos no-GMO certificados y poner en el mortero.
4. Añadir 2,5 mL de agua destilada y moler con mortero por 2 min formar una mezcla.
5. Añadir otros 2,5 mL de agua destilada y continuar la molienda con mortero hasta que la mezcla se convierte en lo suficientemente suave para pipeta.
6. Extraiga con pipeta 50 μl de mezcla de suelo al tubo de tapón de rosca conteniendo 500 μl de premezcla de PCR con la etiqueta "no-OGM" usando la marca de 50-μL en una pipeta graduada. Tapar el tubo.
7. Repita los pasos 1.3 – 1.6 para preparar la muestra de alimento.
8. Extraiga con pipeta 50 μl de mezcla de alimentos de prueba de suelo al tubo de tapón de rosca etiquetado como "prueba". Tapar el tubo.
9. Vortex no-GMO alimentos y prueba PCR tubos para tubos de 1 min y coloque en baño de agua de 95 ° C durante 5 minutos. Si no se dispone de ningún vórtice, flick el tubo varias veces para mezclar antes de colocar en baño de agua.
10. Colocar tubos en una centrífuga durante 5 minutos. Debe formar una pelotilla sólida en la parte inferior del tubo. Si el pellet no está formado después de 5 min, centrifugar nuevamente por intervalos de 2 min hasta que se forme de la pelotilla.
11. Tubos pueden ser utilizados inmediatamente para PCR o almacenados en el refrigerador hasta por 1 semana.

2. Ajuste de reacciones de PCR

1. Número de tubos de PCR 1 – 6 y les inicial. El número debe corresponder a los siguientes contenidos del tubo aparece en la tabla 1.
2. Coloque cada tubo PCR marcado en un porta de microtubo con las tapas abiertas.
3. Usando una punta nueva para cada adición, agregar 20 μl de la cartilla que se indica en la tabla 1 para cada tubo PCR. Tubos con tapón.
4. Usando una punta nueva para cada tubo, agregar 20 μl de la muestra de ADN indicada en la tabla 1 para cada tubo de PCR, asegurándose de que la pipeta solo partir del sobrenadante y evitando el sedimento sólido en la parte inferior de los tubos.
5. Después de cada muestra de ADN se pipetea en el tubo correspondiente de polimerización en cadena, utilice la pipeta para mezclar ADN y cartilla pipeteando suavemente de arriba abajo; volver a tapar los tubos.
6. Colocar tubos PCR en termociclador y programa al cycler para:
   Desnaturalizar inicial: 1 ciclo a 94 ° C por 2 min.
   Amplificación: 40 ciclos a 94 ° C por 1 min (desnaturalizar), 59 ° C por 1 min (recocido) y 72 ° C por 2 min (extensión).
   Extensión final: 1 ciclo a 72 ° C durante 10 minutos.
   Hold: 4 ° C indefinidamente.

3 Preparación del Gel de agarosa al 3%

1. Con laboratorio o cinta adhesiva, cinta firmemente de los extremos abiertos de la bandeja de gel. Asegúrese de cinta está sellada en los bordes de la bandeja para evitar que la agarosa fundida escaparse hacia fuera.
2. Pesar 3 g de agarosa en un erlenmeyer de 250 mL o más grande.
3. Añadir 100 mL de tampón de x TAE 1 (comprado o preparado de concentrado).
4. Usando una placa magnética con una barra de agitación, calentar el vaso de precipitados hasta que la agarosa se disuelva completamente en el búfer y la solución hierve y se vuelve claro. Alternativamente, puede utilizarse un horno de microondas por colocar la taza en el horno y calefacción para intervalos de 30 s, usando una varilla de agitación para mezclar cada 10 s, repitiendo hasta que la mezcla está hirviendo y vueltas claro.
5. Invertir un matraz Erlenmeyer de 50 mL dentro de la abertura del frasco de 250 mL para actuar como un reflujo, impidiendo la evaporación de solución de agarosa.
6. Deje que la solución de agarosa enfriar a 60 ° C y verter 30-50 mL en cada bandeja de gel con cinta.
7. Coloque un peine de gel en el primer par de muescas para crear pozos de gel.
8. Deje el gel se enfríe completamente antes de retirar la cinta y peine. Gel se solidifique y vuelta de claro a turbio cuando listo, aproximadamente 10-20 minutos.

4. electroforesis de los productos PCR

1. Un gel de agarosa 3% hecha de antemano sobre una bandeja de gel o utilice una bandeja de gel que se ha utilizado para lanzar un gel de agarosa 3% vertido.
2. Deslice la bandeja de gel en la cámara de electroforesis con los pozos más cercanos al extremo del cátodo (negro).
3. Vierta 1 buffer de x TAE en la cámara, lo suficiente para tener 2 mm de tampón sobre la parte superior de la bandeja de gel.
4. Obtener tubos PCR de Termociclador y lugar en soporte para microtubo.
5. Utilizando una punta de pipeta nueva cada vez, añadir 10 μl de compra anaranjado G carga del tinte (LD) para cada muestra y mezclar bien.
6. Carga 20 μl de la regla de peso molecular y 20 μl de cada muestra en el gel en el orden indican (tabla 2).
7. Electroforesis del gel del funcionamiento durante 30 min a 100 V.
8. Retire la bandeja de gel de gel cámara y deslice para quitar de la bandeja. Coloque el gel en una bandeja de tinción.
9. Sumergir el gel en la mancha de gel ADN adquirida durante 5 min., agitando cuidadosamente la bandeja para ayudar a distribuir la tinción en el gel.
10. Transferir el gel a un recipiente de lavado y enjuague con agua corriente (40-55 ° C) para aproximadamente 10 s.
11. Desmanchar por 3 x el lavado en agua caliente del grifo durante 6 min con suave agitación para obtener mejores resultados. Si es necesario, continuar la extracción en agua caliente hasta que se alcanza el contraste deseado.

Tabla 1. Lista de los números de tubo adecuado, imprimaciones y muestras de ADN.

Tabla 2. El orden adecuado para cargar 20 μl de la regla de peso molecular y 20 μl de cada muestra en el gel.

Después de la extracción, geles pueden analizarse examinando en carriles de alimentación de prueba (tabla 3) para determinar si las bandas de ADN para el promotor 35S y NOS terminator genes están presentes en los lugares conocidos en el gel. Colocar el gel en una caja de luz ultravioleta puede ayudar a proporcionar mayor contraste (figura 1). Alternativamente, los geles pueden colocarse sobre papel blanco o amarillo para proporcionar un fondo que contraste para destacar las bandas de ADN (figura 2).

Figura 1. Un gel destained que separan las bandas de ADN. Gel de agarosa después de electroforesis en gel de agarosa en caja de luz UV.

Figura 2. Diagrama de los lugares conocidos para el promotor 35S y terminador NOS DNA. La presencia o ausencia de una banda de bp 200 en carril 5 indica si o no la comida de prueba contiene OMG.

Tabla 3. Tamaños de banda muestra de PCR (pares de bases (bp)).

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utiliza para amplificar la DNA, permitiendo una amplia gama de pruebas de ADN lab. Un área de pruebas ahora posible con PCR es identificar los organismos modificados genéticamente por la prueba de presencia o ausencia de la DNA secuencias utilizados en la modificación genética de cultivos alimenticios. Típicamente, un cultivo es modificado genéticamente para conferir una ventaja contra impedimentos naturales al rendimiento ideal, por ejemplo, las plagas (figura 3), enfermedades, las condiciones de sequía (figura 4), etcetera. Ya que la ventaja se obtiene mediante la inserción de material genético de una especie diferente en el cultivo de la planta DNA, salud humana potencial y los riesgos ambientales se han identificado con el uso de organismos modificados genéticamente. Una preocupación ambiental es la capacidad de la ADN genéticamente modificado para cambiarse sin querer a través de procesos de polinización, que podrían conducir a transgénicos ADN entrando en que los genomas de cultivos destinados a venderse como no transgénicos.

Figura 3. Larvas de escarabajo de Colorado, devorando hojas de patata.

Figura 4. Maíz destruida por la sequía.