Overview
ソース: ドクターペッパー イアン博士チャールズ Gerba - アリゾナ大学所
示す著者: ブラッドリー ・ シュミッツ
土壌には、生命に寄与する生物的・非生物的要因を含む地球の表面で薄い層が装備されています。非生物的部分には、無機粒子サイズと形状に至るまで土壌のテクスチャを決定するにはが含まれます。生物の部分には、植物残渣、ルーツ、有機物、微生物が組み込まれています。土壌の 1 グラム含まれている 107 8細菌、放線菌 106 8 、105 6菌、103酵母、原生動物4 6 10、103 4藻類と 53線虫は土壌微生物の豊かさと多様性、します広大な。一緒に、生物的・非生物的要因は土壌微生物のための有利な条件を提供する、根圏として知られている植物根の周りのアーキテクチャを形成します。
生物的・非生物的要因は土壌中での生活を促進します。しかし、それらはまた微生物を制限ストレスのダイナミクスを貢献します。生物的ストレスに適応し、環境条件の中で生き残る生活の中で競争が含まれます。たとえば、微生物は、隣接の微生物に害を抑制または有毒物質を分泌できます。ペニシリウム-notatumは悪名高い菌抗菌薬、医薬品のペニシリンを作成する人間が収穫を生産することによって栄養素のための競争を減らします。非生物的ストレスは光、水分、温度、pH、栄養素、およびテクスチャなど、微生物の生存を制限する物理的なまたは化学的特性に起因します。
Principles
直接土壌環境の変化の動作、粒子、土の有機体間の相互関係を観察することは難しいが、ロッシらによって開発されたスライドの試金、埋葬スライド テクニックとして知られています。(1936) 土壌微生物学にスナップショットの視点を提供します。このメソッドは、土壌菌、放線菌、および顕微鏡で細菌を観察するために便利です。とはいえ、微生物の数量のためのものではありません、それだけを意味する大規模な異機種混在環境の 1 つの小さい部分。
このメソッドは、数日間土壌にスライド ガラスを埋めるし、酢酸でスライド上の微生物を固定によって簡単に実行されます。微生物はローズ ベンガルの染料で染色、100 X 目的にオイルの液浸を用いた顕微鏡を介して観察。細菌のような小さな丸い形、薄い文字列として放線菌フィラメントと菌糸は厚い糸としてとして、3 つの微生物グループを区別できます。土中では、ほぼすべての細菌が小さく、縮小より有利な表面の丸めを引き起こす栄養ストレスによる純粋培養に比べて丸く: 容積比。汚れていない不規則な黒い図形が土粒子です。異なる栄養改正は、土壌微生物の増殖および相互作用を促進する炭素とグルコースのソースを提供するために追加できます。この技術は、土壌微生物学の簡単な観察は、いくつか生物環境の存在を識別するのに役立ちます。
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Procedure
1. 土壌のスライドの小宇宙の準備
- 表面から庭の土を収集 (0-6"深さ)、2 つのカップに土壌 150 g の重量を量る。
- 土壌に有機物の高密度がある場合 100 g の重量を量る。
- ラベル一杯「治療」と、その他「制御」
- 含水率を変更するために必要な水の量を計算します。
- 水分含有量が多いフィールドの容量の近くにあります。
- 水分含有量が多いフィールドの容量の近くにあります。
- メスシリンダーの蒸留水の量を測定。
- 2 つのバイアルに蒸留水の量を注ぐ。
- ラベル 1 バイアル「治療」と、その他「制御」
- 「治療」土壌の乾燥重量ベースによると最終的な土壌のグルコース濃度 1% の十分なブドウ糖を「治療」瓶で水を改正します。
- 「治療」のバイアルに 200 mg NH4の3を追加し、改正を溶解する攪拌します。硝酸態窒素は、土壌微生物の栄養素の窒素源として機能します。
- 「コントロール」バイアルを改正すれば。
- 約 50 mg の小さい因数は、「治療」のカップに「治療」バイアルの内容をミックスします。追加するたびに分注後ヘラでかき混ぜます。
- 小さい因数で「コントロール」のカップに「コントロール」バイアルの内容をミックスします。追加するたびに分注後ヘラでかき混ぜます。
- 4 つのきれいな顕微鏡スライド ラベル: 2 つの「治療」と「制御」の 2 つのスライド。
- 「治療」土壌カップに 2 つの「治療」のスライドを挿入し、「コントロール」土壌カップに 2 つの「コントロール」のスライドを挿入します。土の表面の上に投影各スライドの 2 cm を残して、2 つのスライド間のギャップを残すようにしてください。
- プラスチック製のラップとカップをカバーし、ゴムのバンドで固定します。
- 空気がまだ余分な蒸発を防ぐためにラップの数回を穿刺します。
- 両方のコップの重量を記録します。
- 7 日土壌充填カップ指定エリア/インキュベーターに室温で孵化させなさい。
2. スライドの染色と顕微鏡観察
- 両方のコップの重量を記録します。
- スライドの取り外しの時に土壌水分を計算します。
- 傾斜位置に各スライドを押してスライドの上面を妨げないので撤退、それぞれのカップから 2 つのスライドを削除します。
- 識別し、染色して観察したスライドの側面をマークします。
- 優しく大きな土壌粒子を除去するベンチ上のスライドをタップします。
- 少し湿らせたペーパー タオルで、スライドの下面を拭きます。室温でスライドを乾燥させます。
- 保護ゴーグルを着用し、鉗子で各スライドを保持、ヒューム フードの下で 1 〜 3 分の 40% (v/v) 酢酸にスライドを浸します。
- 水の穏やかな流れの下で過剰な酸を洗浄します。
- ドロッパー ボトルを使用すると、フェノール ローズ ベンガルとスライドの表面を覆います。余分な汚れをキャッチするためのコンテナーで、染色ラックにスライドをサポートします。注意してください、スライドの表面から微生物を削除可能性があります力で洗浄しないでください。
- 5 ~ 10 分スライドになるスライドさせないで汚れは乾燥します。必要に応じてより多くの汚れを追加します。
- 余分な汚れを削除するスライドを優しく洗います。
- スライドは、室温で乾燥させてください。
- 油浸対物レンズを使用して、顕微鏡 (図 1) を使用してスライドを確認します。
図 1。顕微鏡下でのスライド。
様々 な生物と土壌中の無機成分との関係は土壌の変化と環境のストレスを理解することが重要ですが、直接可視化することがなく解明することはできません。
土壌は、非常に複雑なシステムは、何百万もの多様な生物の生息地です。直接植物の根の周りの土壌の地域は特に、根圏と呼ばれる、植物の根が直接影響を受ける生物のユニークな配列が含まれています。
根圏の非生物的、または非生物学的コンポーネントには、土壌のテクスチャに貢献する無機の粒子サイズと形状に至るまでが含まれます。植物残渣、ルーツ、有機物、微生物、生物、または生物学的部分が含まれます。
土壌の変化に影響を与える要因を理解するために、環境ストレスを予測する、このビデオは根圏土壌の生物的・非生物的構成要素の直接可視化を示します。
微生物は土壌毛穴内にある水の中に存在する傾向があります。細菌は、最も単純な最も豊富な生物、土壌、および球菌、桿菌と糸状の形態と呼ばれる棒と呼ばれる球を含む多くの形態であります。
カビ、酵母などの真菌種は、土で 2 番目の最も豊富な生物です。彼らは仕事を分解し有機物をリサイクルします。微視的な糸状菌類が視覚的に異なる他の微生物から胞子を解放する長く、枝分かれした菌糸を所有しているようです。
これらの生物間の関係の観察はチャレンジです接触スライド アッセイを使用して達成することができます。このメソッドは、ガラス スライドを土に数日間水没と生物と土壌粒子のスライド表面に吸着することによって実行されます。
表面のスミアを防ぐために角度では、スライドが削除されます。微生物は酢酸で固定、ローズ ベンガル染色顕微鏡を介して可視化を有効にします。
スライドの試金技術の背後にある原理を理解すると、後は研究室でプロセスを見ています。
まず、庭の表土を収集し、研究室に土を転送します。2 別容器に土壌の 150 グラムの重量を量る。1 つのコンテナーの有機体の急速な拡散を促進する栄養素に変更されます治療のサンプルとしてラベルを貼ってください。変更されないコントロールとその他のラベルを付けます。
土壌の含水率のこのコレクションの決定ビデオで示したテクニックを用いた土壌中の水分を計算します。この計算に基づいて、乾燥重量ベースで、土壌中の水の量を決定します。今 15% 土壌水分を与えるに追加する必要があります水の量を計算します。これはフィールドの容量で微生物の成長に最適な水分をもたらします。
蒸留水、メスシリンダーを使用しての計算の量を測定します。各コンテナーに水の計算量を注ぐ。土の以前に決定された乾燥重量に基づいて、質量、乾燥重量ベースを使用して最終的な土壌のグルコース濃度 1% を達成するために必要なブドウ糖の量を計算します。このグルコース量の重さし、治療のコンテナーのみを追加します。
硝酸アンモニウムの 200 mg の重量を量るし、治療のコンテナーのみを追加します。硝酸アンモニウム態窒素は、土壌微生物の窒素栄養源として提供しています。コンテナーに土、グルコースと硝酸アンモニウムの混合物を混ぜます。
次に、4 つのクリーンな顕微鏡スライドのラベル: 治療として 2 つと 2 つのコントロールとして。処理土壌コンテナーに 2 つの治療スライドを挿入します。土壌表面上公開される各スライドのセクションを残すし、2 つのスライドの間にギャップがあることを確認します。
同じ方法で土壌コンテナー コントロールに 2 つの制御スライドを挿入します。プラスチック製のラップとカップをカバー、ゴムバンドで固定します。空気の転送を許可するが、まだ余分な蒸発を防ぐためにプラスチック製のラップの数回を穿刺します。
最後に、両方のコップの重さ、自分の体重を記録し、7 日間室温で指定された領域にそれらをインキュベートします。
7 日間培養後土のカップを秤量することにより土壌の水分を計算します。重量が水の蒸発により失われているかどうかを判断し、必要であれば水を交換します。
コンテナーから、プラスチック製のラップ、傾斜した位置に、各スライドを押しながら撤退してスライドの上面が邪魔で土から 2 つのスライドを取り外します。
優しく大きな土壌粒子を除去するスライドをタップします。少し湿らせたペーパー タオルで、スライドの下面を拭きます。ヒューム フードに室温で乾燥させます。一度乾燥、鉗子、スライドをピックアップし、1 〜 3 分用酢酸に没頭します。
過剰な酸を除去する蒸留水の穏やかな流れとスライドの上部をすすいでください。すべてのスライドには、この手順を繰り返します。乾燥空気にスライドを許可します。
余分な染料をキャッチするためのコンテナーで、染色ラックにスライドをサポートします。フェノール ローズ ベンガルの染料で各スライドの表面を覆う優しくスポイトを使用して。世話を濡れているスライドを保つために必要に応じてより多くの染料を追加する 5 〜 10 分のためにスライドを許可します。優しく余分な染色を削除する水スライドをすすいで、室温で乾燥するスライドを許可します。
油浸対物レンズを用いた光顕微鏡のスライドを確認します。処理土でお越しの際にもより多くの土壌微生物。
典型的な土壌試料中の真菌や細菌の有機体の間の空間的相互作用を視覚化することができます簡単に。土粒子は、褐色の不規則な図形を表示します。
真菌は、放線菌は、細い糸状の菌糸を表示中に太い糸状の菌糸を表示します。
小さい球菌または塊、土粒子や糸状菌の菌糸を裏地で通常のロッド形状として細菌があります。
土壌から有機体の直接分離土壌と環境の特性を理解することが重要です。
昆虫病原性線虫が寄生昆虫ラウンドワーム顕微鏡です。間接触スライド アッセイには表示されません、彼らは、この例で示すように、収集した土壌試料から分離できます。
まず、線虫が目視検査から識別される昆虫を使用して土に餌を付けた。線虫は、湿った、暗い環境に死んだ昆虫を置き、周囲の水を移行する線虫をできるように死んだ昆虫の餌から分離しました。線虫、水から収集され分析します。
糸状菌は、土壌の健康栄養塩循環の役割のために不可欠です。この例では分離と土壌糸状菌の観測を行った。
土壌試料は、水で希釈され、滅菌ローズ ベンガル ストレプトマイシン寒天を別に追加。ストレプトマイシンは細菌の増殖を防ぐし、真菌の成長を有効に。真菌のコロニーはカウントされ、粘着テープを使用してスライド ガラスにマウントされています。菌類は、光学顕微鏡をイメージしました。
土壌微生物は自然土、死んだ植物や生物などのコンポーネントに分割します。この例で示すように、生分解性、生分解性プラスチック フィルムの植民地化、検討しました。
菌類は、数ヶ月間土に埋もれてプラスチック フィルムから分離された.菌は、プラスチック フィルム上の成長は個別にテスト、されました。プラスチック フィルム次いで, 成長メディアなしで選択した真菌ひずみ、菌によるプラスチックの直接分解を観察するために。
土壌微生物の定性用スライド アッセイをゼウスの紹介を見てきただけ。今接触スライドを準備し、土壌微生物を視覚化する方法を理解する必要があります。見てくれてありがとう!
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Results
菌類は、厚さ、糸状の菌糸 (図 2) を表示します。放線菌は、薄い、糸状の菌糸を表示します。細菌は小さい球菌またはロッド図形を表示します。彼らはしばしば土壌粒子、またはライニング菌糸の塊で発見しています。土壌粒子は、不規則な暗い形 (図 3) を表示します。
図 2。スライド イメージの 100 倍の対物レンズを使用してお問い合わせください。
写真礼儀 W.H. フラー。
図 3。スライド イメージの 100 倍の対物レンズを使用してお問い合わせください。
写真礼儀 W.H. フラー。
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Applications and Summary
スライドの試金、埋葬スライドとも呼ばれますは、土壌生物相を質的観察を活用シンプルな手法です。この試金は質的、土粒子、細菌、放線菌フィラメント菌糸間の空間的相互作用を示しています。個人や業界は、ガーデニング、堆肥化、教育、そして勉強に関しては農業、特定の土壌の健康に関する知識を収集するこのアッセイを使用できます。しかし、この手法としてそれだけ大規模な異機種混在環境の小さな肖像土壌マイクロ生物相を定量化しない場合。
土壌生物関係は、100 倍油浸顕微鏡 (図 2および3) で結果を表示およびスライド アッセイを実行して観察できます。シンプルさとやすこの分析を実行するのになりますを偉大な開始技術微生物にさらされていることと、初めて顕微鏡で微生物を表示可能性があります人のため。
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References
- Pepper, I. L., & Gerba, C P. 'Contact Slide Assay.' Environmental Microbiology A Laboratory Manual. 2nd ed. Elsevier 19-25 (2004).
- Pepper, I. L., Gerba, C. P., & Gentry, T. J. 'Earth Environments.' Environmental Microbiology. 3rd ed. Elsevier 59-88 (2014).
- Rossi, G., Ricardo, S., Gesue, G., Stanganelli, M., and Want, T.K. Direct Microscopic and bacteriological investigations of the soil. Soil Science. 41, 52 – 66 (1936).
