底質から脂質バイオ マーカーの超音波抽出

Earth Science

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Overview

ソース: ジェフ Salacup - マサチューセッツ大学アマースト校講座

(葉、菌類、樹皮、組織のあらゆる生態系の生活「有機」共有を構成する材料図 1)非生活「無機」共有 (岩の構成鉱物、酸素、水、金属) の材料から根本的に異なります。有機物には炭素無機材料からそれを区別する他の炭素と水素分子 (図 2) のシリーズにリンクされているが含まれています。カーボンの広い結合価範囲 (3:56) 近隣の原子で通常、C、H、O、N、S、および P と最大 4 つの個別共有結合を形成することができます。単一の最大 3 つの共有結合を共有することもしばしば有毒のシアン化物、またはニトリル、グループの三重結合など、他の原子。過去 46 億年にわたってこのような柔軟性は、サイズ、複雑さ、極性、形状、および機能が異なる化学構造の驚くべき配列につながっています。有機地球化学の科学分野は地質学的時間を他のプロパティと同様に、この惑星上の生命によって生成されたバイオ マーカーと呼ばれる検出の有機化合物の全体の範囲の同定およびにかかわっています。

Figure 1
図 1。木、葉、コケなどの有機材料は、舗装などの無機物から化学的、視覚的に異なります。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 地球科学の本質. 底質から脂質バイオ マーカーの超音波抽出. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Principles

超音波処理による抽出は特定のサンプルからのエキス (TLE) 総脂質を得る最も簡単なと最も高価な方法、このメソッドに関連付けられている回復は、他のより高度なテクニックと同等です。有機溶媒存在下でバイアルのサンプルを扇動するために超音波浴を使用します。サンプルに含まれるバイオ マーカーは、バイオ マーカーと溶媒の極性によって主に制御される有機化合物の溶解性、ルールに基づく有機相に溶解します。これをいわゆる要約 'ディゾルブのような' ルール、という比較的極冠バイオ マーカー (C と H のみを含む; イソプレン) は極冠の溶剤に溶解 (ヘキサン、極性など = 0.1) より極性のバイオ マーカー (O、N、S、P を含む; グリセロール ジアルキル グリセロール tetraethers (GDGT)) がより多くの極性溶媒に溶解し、(メタノールまたはジクロロ メタン、極性など 5.1 や 3.1 を =)。実際には、これは最初のステップであるバイオ マーカーのさまざまなグループの分離達成できるポーラー、極冠から溶剤のシリーズの導入各サンプルからより多くの極性化合物を抽出します。ターゲット堆積物の連続抽出物から溶媒を個別に分析従ってまたは後で浄化することが総脂質抽出物 (TLE) を形成するために結合できます。

古の最初のステップは、収集、または彼らがである堆積物からバイオ マーカーを抽出することです。環境試料は、鉱物、水、金属などの非有機成分と生物の地域によって作成される有機成分で構成されます。これらの有機成分は、過去についての情報を明らかにする科学者によって使用されることができる前に彼らは彼らの環境から削除する必要があります。超音波は、超音波を利用して、、最も単純なこれらの技術の最も高価です。

このビデオは、脂質の抽出・精製・分析堆積物からのシリーズの一部です。それは超音波による脂質の抽出を説明し、メソッドのいくつかのアプリケーションを提示します。

バイオ マーカーの広い範囲のためのすべてを抽出する最適化された単一溶剤はありません。これをいわゆる要約 'ディゾルブのような' ルール、極冠分子溶解極冠溶剤、ジクロロ メタンなどの比較的、メタノールなどのより多くの極性溶媒に溶解より極性分子という。経験的には、脂質のグループまたは特定の脂質の抽出のための溶媒の混合物一般に最適化されています。

抽出を促進し、収量を高める、超音波システムを使用して、超音波 - 溶媒混合物と組み合わせて、20 kHz を超える周波数を持つ波を適用します。これらの波は、液体の有機相を連絡した場合、彼らは急速に成長し、崩壊の溶媒蒸気の短命のマイクロバブルの形成を引き起こします。崩壊にこれらの気泡は、機械的せん断、脂質可溶化を容易にし、抽出の効率を大幅に高めることとしてエネルギーの膨大な量をリリースします。

超音波は、溶媒抽出プロセスを支援後、結果は原油抽出脂質署名の定性的および定量的な検討を許可するように更に精製を受ける総脂質エキスと呼ばれる準備です。Sonication によって脂質の抽出の背後にある主要な原則のいくつかを理解したら、プロシージャを実行する方法のためのプロトコルを見てみましょうことができます。

選択した場所から必要な試料を収集します。いくつかの例は、湖沼および海洋堆積物、地上の土壌、微生物培養液や植物の葉。収集資料は夜間に凍結です。この後 2 〜 3 日の凍結乾燥機で凍結乾燥です。粉砕し、抽出溶媒洗浄乳鉢と乳棒の前に凍結乾燥試料をホモジナイズしてください。有機汚染物質を削除するには、燃焼必要なホウケイ酸ガラス ピペット、バイアル、計量缶オーブンで。オーブンで冷却しガラスを許可すると後に、、ジクロロ メタンとメタノールの混合物金属工具をすすいでください。サンプルやガラスを準備、超音波処理の手順を開始できます。

このステップからすべてのコンテナーおよびガラス製品に使用する前に燃焼させる必要があります。スケールと風袋に計量の錫を配置します。混合溶媒とラボ ヘラをすすぎ、凍結乾燥、均質化のサンプルの適切な質量計量錫に質量を記録を使用してください。慎重にラベル付けされたバイアルに重量を量られたサンプルを転送します。DCM:MeOH のホヤの瓶を使用して、十分なサンプルが、溶媒を 1 〜 2 cm で覆われていることを追加し、バイアルのキャップします。バイアル ラックに置き、防水、今超音波処理の準備ができて。超音波風呂に直接ラックを配置します。超音波風呂の水位がちょうど深い十分抽出溶媒の最上部までのサンプル瓶が水没することを確認します。室温で 30 分間の超音波照射します。超音波処理後、超音波発生装置からラックを削除します。土砂発生する解決を許可するように座っているバイアルをしましょう。

ピペットと電球を使用して抽出バイアルからジクロロ メタノールの上部の段階を削除し、別に転送済みの重量を量ったし、バイアルをラベル付けします。各サンプルの合計 3 回の超音波処理プロセスを繰り返します。1 バイアルに抽出物を収集します。そのバイアル、キャップ、フード、箔の部分で緩やかに覆われて乾燥して抽出されたサンプルを許可します。'抽出残渣' としてラベルを付けるし、抽出溶媒に格納します。今では、バイオ マーカーを抽出した分析が起こることができる前に彼ら浄化されなければなりません。

超音波処理はいくつかの溶媒抽出プロセスを加速し、地球化学的研究で広く使用されています。多くの考古学者は、初期の人類の文明が住んでいる環境、文化的な状況を再構築するために地球化学で動作します。陶器、発掘されたときの最も古い人間の発明の 1 つは、ワイン、米、または一度内で格納されていた他の内容から残留の分子化石を含む見つけることができます。

小さな陶器のサンプルは有機溶媒存在下で超音波処理し、抽出された化合物をその後することができます表面に吸収された物質の化学的証拠を発掘するには、分光学的手法による下流を識別しました。この種の分析は、考古学者古代の人口に利用されたリソースの種類を検出し、その生息地の状態を再構築できます。

海洋および淡水の生態系における光合成微細藻類があります。海水ベースのメディアで育つ彼らの文化が大幅に小さい領域を占めているため、彼ら今広くおこなっています陸生植物バイオ燃料の生産のために有望な代替手段として。

微細藻類バイオマスから脂質を抽出するには、は、これらの研究者は、超音波処理による溶媒抽出をについて説明します。超音波処理中に音響キャビテーションは効果的に脂質を解放するために硬質の微細藻類細胞壁を破壊します。このようなテクニックは、非石油エネルギーの生産のための環境から新しい微細藻類の評価を支援します。

堆積物中のバイオ マーカーの Sonication-Assisted 抽出のゼウスの概要を見てきただけ。次の動画は、分析用抽出物を精製するさらに説明します。

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Procedure

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1. 必要な資料を収集します。

  1. (葉、汚れ、カビ、樹皮、組織)、通常冷凍、凍結乾燥、粉砕、および効率を最大にするグループで抽出、抽出前に均質化したサンプルです。3 つのサンプルを抽出します。
  2. サンプルのサイズ、に応じてボリューム 4 60 mL に至るバイアルを使用できます。この実験では、ホウケイ酸ガラスの瓶 (40 mL) と溶剤の安全キャップを使用します。バイアル、ホウケイ酸ガラス ピペットおよび計量缶 550 ° C、6 時間前に可能な有機汚染物質の除去を確実に燃焼させる必要があります。
  3. ほとんどの有機地球化学研究室では、ジクロロ メタン、メタノールが多い。実験室のツールと使用前にガラスを洗浄する個別に使用されます。多くのラボでメタノール (メタノール; 9:1) (DCM) ジクロロ メタンの混合物を使用することで、極性の広い範囲でバイオ マーカーを効率的に抽出します。溶剤は、有機汚染物質の無料する必要があります。
  4. 室温で超音波処理水のお風呂を使用します。超音波発生装置サイズおよび熱の有無は超音波処理の範囲は主要な科学機器の小売商から利用できます。
  5. 超音波風呂、防水する必要があります、バイアル ラックになります。
  6. 溶剤は、化学のフードを承認しました。

2. サンプルの調製

  1. ラボ ・風袋錫の重量を量る燃焼を配置します。
  2. 洗浄溶剤、ラボへら計量錫に適切なサンプル量を転送するためにそれを使用し、質量を記録します。
    1. 試料の質量は、その有機物の含有量によって異なります。有機物豊富な材料 (葉組織) が、はるかに少ない必要ですが、比較的有機物の無駄のない材料 (海泥) は数グラムを必要があります。
  3. 燃焼され、事前に圧迫されラベル付けされたバイアルにすべての計量のブリキ缶に材料を転送します。バイアル、キャップ、計量の錫を破棄します。
  4. 2.1 から 2.3 各サンプルを抽出するための手順に従います。

3. 抽出

  1. 各バイアルに 〜 20 mL DCM:MeOH (9:1) 混合物の前燃焼ピペットと電球を使用して、転送 (バイアルが約半分を完全にする必要があります)。バイアルを要約すると、揮発性溶剤が蒸発しないので、次のサンプルに移る前に。
    1. DCM とメタノールの情勢は異なっています。Uncapped サンプル瓶による抽出溶媒の蒸発抽出でき、その極性を変更する機能があります。
  2. 防水バイアル ラックにサンプル瓶を配置します。
  3. 超音波風呂の水のレベルだけ抽出溶媒の最上部までのサンプル瓶を水没に十分な深さであることを確認します。あまりにも多くの水をフローティングにバイアルを引き起こす可能性があります。少なすぎる水が攪拌されて正しく採取を停止します。
  4. 超音波風呂に直接それのサンプルとバイアル ラックを配置します。
  5. 室温で 30 分間超音波照射します。
  6. 超音波発生装置からサンプル ラックを削除します。堆積物を抽出する場合が発生する整 30 分の設定それをみましょう。サンプルの別のセットを抽出する場合は、この時点で超音波発生装置に入れ。
  7. 前燃焼ピペットと電球を使用して抽出バイアルから DCM:MeOH の混合物を削除して 40 mL のバイアルをラベル別に挿入前の体重は、pre-燃焼。
  8. 3.1 3.7 3 を繰り返してすべてのサンプルのための x。
  9. そのバイアル、キャップ、フード、箔の部分で緩やかに覆われて乾燥して抽出されたサンプルを許可します。'抽出残渣' としてラベル付けし、保存します。
  10. 「TLE' としてサンプルごとに合わせた抽出液にラベルを付けます。

Results

抽出の最後には、各サンプルの総脂質抽出 (TLE) は明らかです。各バイアルには、底質、土壌、または植物組織から抽出される有機物が含まれています。これら TLEs を解析することができ、その化学成分を識別して定量化します。

Applications and Summary

バイオ マーカーの別のクラスは、地球システムの特定の側面に関する情報を伝えます。たとえば、揺籃期に有機地球化学の形成、移行、および石油の変質にかかわっていた主に、有機地球化学を今日使用して化学のツールの多くはこれらの初期の調査に基づいています。イソプレノイド化合物のクラスの調査を通じて、繰り返し 5 つのカーボン パターン (図 2)、その科学者発見された石油で構成されています (図 3の油に変換する) 海や土地 (石炭、図 4) 泥炭湿原でプランクトンなどの古代の一次生産者の化学的に変更されたまま。大規模な石油企業で化学使用様々 な化合物の比率、それぞれどのように古い石油を推定するため、改ざんの知られている率が、どこから、来たとそれを悪用する価値があった。今日、新しいバイオ マーカーを発見されている、識別、および世界中の有機地球化学ラボで分析した現代と古代のサンプルで特徴づけられる。今日のアプリケーションの多く (葉、土、微生物、水試料、等) の気候、環境、および過去の生態系を再構築するために古代の堆積物中のバイオ マーカーのユーティリティを拡張するために近代的なサンプルで得られるバイオ マーカーから環境情報を抽出しようとします。たとえば、グリセロール ジアルキル グリセロール tetraethers (略して GDGTs)、古細菌と細菌のスイート プロデュースと呼ばれるバイオ マーカーのグループの分布は、空気や水の温度に応答した予測可能な方法で変更する現世堆積物中で発見されました。そのため古代の堆積物中のこれらのバイオ マーカーの分布は使用できますが、前後の一連の知られている時代の堆積物、空気や水を再構築する温度数百万年。

Figure 2
図 2。イソプレン 5 つの炭素原子と 2 つの二重結合で構成されています。生合成反応で一緒に追加されると、彼らは複雑な分子生命の存在のための診断を形成できます。たとえば、2、6,10,15,19-pentamethyleicosane、シアノ バクテリア マットで一般的に見られます。

Figure 3
図 3。モルディブでプランクトンの照明。著作権 PawelG 写真。

Figure 4
図 4。エクアドルのアンデス山脈の標高 4,500 m の泥炭湿原。著作権博士モーリー読み取り

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1. 必要な資料を収集します。

  1. (葉、汚れ、カビ、樹皮、組織)、通常冷凍、凍結乾燥、粉砕、および効率を最大にするグループで抽出、抽出前に均質化したサンプルです。3 つのサンプルを抽出します。
  2. サンプルのサイズ、に応じてボリューム 4 60 mL に至るバイアルを使用できます。この実験では、ホウケイ酸ガラスの瓶 (40 mL) と溶剤の安全キャップを使用します。バイアル、ホウケイ酸ガラス ピペットおよび計量缶 550 ° C、6 時間前に可能な有機汚染物質の除去を確実に燃焼させる必要があります。
  3. ほとんどの有機地球化学研究室では、ジクロロ メタン、メタノールが多い。実験室のツールと使用前にガラスを洗浄する個別に使用されます。多くのラボでメタノール (メタノール; 9:1) (DCM) ジクロロ メタンの混合物を使用することで、極性の広い範囲でバイオ マーカーを効率的に抽出します。溶剤は、有機汚染物質の無料する必要があります。
  4. 室温で超音波処理水のお風呂を使用します。超音波発生装置サイズおよび熱の有無は超音波処理の範囲は主要な科学機器の小売商から利用できます。
  5. 超音波風呂、防水する必要があります、バイアル ラックになります。
  6. 溶剤は、化学のフードを承認しました。

2. サンプルの調製

  1. ラボ ・風袋錫の重量を量る燃焼を配置します。
  2. 洗浄溶剤、ラボへら計量錫に適切なサンプル量を転送するためにそれを使用し、質量を記録します。
    1. 試料の質量は、その有機物の含有量によって異なります。有機物豊富な材料 (葉組織) が、はるかに少ない必要ですが、比較的有機物の無駄のない材料 (海泥) は数グラムを必要があります。
  3. 燃焼され、事前に圧迫されラベル付けされたバイアルにすべての計量のブリキ缶に材料を転送します。バイアル、キャップ、計量の錫を破棄します。
  4. 2.1 から 2.3 各サンプルを抽出するための手順に従います。

3. 抽出

  1. 各バイアルに 〜 20 mL DCM:MeOH (9:1) 混合物の前燃焼ピペットと電球を使用して、転送 (バイアルが約半分を完全にする必要があります)。バイアルを要約すると、揮発性溶剤が蒸発しないので、次のサンプルに移る前に。
    1. DCM とメタノールの情勢は異なっています。Uncapped サンプル瓶による抽出溶媒の蒸発抽出でき、その極性を変更する機能があります。
  2. 防水バイアル ラックにサンプル瓶を配置します。
  3. 超音波風呂の水のレベルだけ抽出溶媒の最上部までのサンプル瓶を水没に十分な深さであることを確認します。あまりにも多くの水をフローティングにバイアルを引き起こす可能性があります。少なすぎる水が攪拌されて正しく採取を停止します。
  4. 超音波風呂に直接それのサンプルとバイアル ラックを配置します。
  5. 室温で 30 分間超音波照射します。
  6. 超音波発生装置からサンプル ラックを削除します。堆積物を抽出する場合が発生する整 30 分の設定それをみましょう。サンプルの別のセットを抽出する場合は、この時点で超音波発生装置に入れ。
  7. 前燃焼ピペットと電球を使用して抽出バイアルから DCM:MeOH の混合物を削除して 40 mL のバイアルをラベル別に挿入前の体重は、pre-燃焼。
  8. 3.1 3.7 3 を繰り返してすべてのサンプルのための x。
  9. そのバイアル、キャップ、フード、箔の部分で緩やかに覆われて乾燥して抽出されたサンプルを許可します。'抽出残渣' としてラベル付けし、保存します。
  10. 「TLE' としてサンプルごとに合わせた抽出液にラベルを付けます。

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