Beschallung Extraktion von Lipid Biomarker aus Sediment

Earth Science

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Overview

Quelle: Labor von Jeff Salacup - University of Massachusetts Amherst

Das Material, bestehend aus der lebenden "Bio" Anteil an jedem Ökosystem (Blätter, Pilze, Rinde, Gewebe; Abbildung 1) unterscheidet sich grundlegend von dem Material der unbelebten "anorganischen" Aktie (Felsen und ihre konstituierenden Mineralien, Sauerstoff, Wasser, Metalle). Organisches Material enthält Kohlenstoff verbunden zu einer Reihe anderer Kohlenstoff und Wasserstoff Moleküle (Abbildung 2), die sie von anorganischem Material unterscheidet. Carbon ermöglicht breite Valenz (03:56) es, bis zu vier separate kovalente Bindungen mit benachbarten Atomen, in der Regel C, H, O, N, S und P. bilden Es kann bis zu drei kovalente Bindungen auch teilen, mit einem anderen Atom, wie z. B. die Dreifachbindung in der oft giftige Zyanid oder Nitril, Gruppe. Seit 4,6 Milliarden Jahren führte diese Flexibilität zu einer erstaunlichen Vielfalt an chemischen Strukturen, die sich in Größe, Komplexität, Polarität, Form und Funktion unterscheiden. Der wissenschaftlichen Bereich der organische Geochemie befasst sich mit der Identifizierung und Charakterisierung des Gesamtangebots von nachweisbaren organischen Verbindungen, Biomarker, produziert von Leben auf diesem Planeten, sowie andere, durch geologische Zeit genannt.

Figure 1
Abbildung 1. Organisches Material, wie Bäume, Blätter und Moos, unterscheiden sich chemisch und visuell von anorganischem Material wie Pflaster.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Earth Science. Beschallung Extraktion von Lipid Biomarker aus Sediment. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Principles

Extraktion durch Anwendung von Ultraschall ist die einfachste und kostengünstigste Methode zur Gewinnung von insgesamt Lipid (TLE) Auszug aus einer Probe, und die Erholung verbunden mit dieser Methode ist auf Augenhöhe mit anderen immer raffinierten Techniken. Ein Ultraschallbad verwendet, um eine Probe in ein Fläschchen in Anwesenheit von organischen Lösungsmittel zu agitieren. Biomarker in der Probe enthaltenen lösen sich in der organischen Phase, basierend auf den Regeln der Löslichkeit, die mit organischen Verbindungen, in erster Linie durch die Polarität von der Biomarker und das Lösungsmittel gesteuert werden. Dies wird durch die sogenannte zusammengefasst, "wie löst" auszuschließen, wobei relativ apolaren Biomarker (solche, die ausschließlich C und H; Isopren) in apolaren Lösungsmitteln auflösen (wie Hexan, Polarität = 0,1) und weitere polare Biomarker (solche mit O, N, S, P, Glycerin-Dialkylcarbonat Glycerin-Tetraethers (GDGT)) in mehr polaren Lösungsmitteln auflösen (wie Methanol oder Dichlormethan, Polarität = 5.1 und 3.1). In der Tat ist dies der erste Schritt in dem die Trennung der verschiedenen Gruppen von Biomarkern über die Einführung einer Reihe von Lösungsmitteln aus apolaren, polar, jede Gewinnung von immer mehr polaren Verbindungen aus der Probe erreicht werden kann. Lösungsmittel aus sequenziellen Auszüge aus einem Ziel Sediment können so einzeln analysiert oder kombiniert, um eine totale Lipid-Extrakt (TLE) bilden, der später gereinigt werden können.

Der erste Schritt beim Paläoklimatologie ist zu sammeln oder zu extrahieren, die Biomarker aus dem Sediment fanden sie in. Umweltproben bestehen aus anorganischen Komponenten, z. B. Metalle, Mineralien und Wasser und organischen Bestandteilen, die von lebenden Organismen im Bereich erstellt werden. Bevor diese organischen Bestandteile von Wissenschaftlern verwendet werden können, um Informationen über die Vergangenheit aufzuklären, müssen sie aus ihrer Umgebung entfernt werden. Beschallung, die Ultraschallwellen nutzt, ist die einfachste und kostengünstigste dieser Techniken.

Dieses Video ist Teil einer Serie über Lipid-Extraktion, Reinigung und Analyse von Sedimenten. Es wird Lipid-Extraktion durch Ultraschall zu veranschaulichen und einige Anwendungen der Methode zu präsentieren.

Wegen der breiten Palette von Biomarkern gibt es kein einziges Lösungsmittel so optimiert, dass alle von ihnen extrahieren. Dies wird durch die sogenannte zusammengefasst, "wie löst" auszuschließen, wobei relativ apolaren Moleküle in apolaren Lösungsmitteln wie Dichlormethan auflösen, und weitere polare Moleküle in mehr polaren Lösungsmitteln wie Methanol auflösen. Lösemittelgemische für die Gewinnung von bestimmten Lipiden oder Gruppen von Lipiden sind in der Regel empirisch optimiert.

Zur Beschleunigung der Extraktion und Ertrag zu steigern, wird ein Ultraschall-System zur Ultraschall - Wellen mit Frequenzen größer als 20 kHz, in Verbindung mit dem Lösungsmittelgemisch gelten. Wenn diese Wellen die organische Flüssigphase kontaktieren, verursachen sie die Bildung von kurzlebigen Mikrobläschen Lösungsmitteldämpfe, die rasch wachsen und Zusammenbruch. Diese Bläschen release am zusammenbrechen, eine enorme Menge an Energie als mechanische Scherung, Lipid Solubilisierung zu erleichtern und dramatisch erhöhen die Effizienz der Extraktion.

Nachdem die Ultraschall Lösungsmittel-Extraktion assistierte, ist das Ergebnis eine grobe extrahieren Vorbereitung, genannt eine totale Lipid-Extrakt, die weitere Reinigung, qualitative und quantitative Untersuchung der Lipid-Signaturen ermöglichen ausgesetzt ist. Jetzt, wo Sie einige der wichtigsten Grundsätze hinter Lipid-Extraktion durch Ultraschallbehandlung zu verstehen, werfen wir einen Blick auf ein Protokoll wie das Verfahren durchgeführt wird.

Sammeln Sie die erforderlichen Probenmaterialien von einem gewählten Standort. Einige Beispiele sind lacustrine und marinen Sedimenten, terrestrische Böden, mikrobielle Kulturen oder Pflanzenblätter. Gesammelte Material wird über Nacht eingefroren. Im Anschluss daran ist es gefriergetrocknet in ein Gefriertrockner für 2 bis 3 Tage. Crush und gefriergetrockneten Proben vor der Extraktion mit einem Lösungsmittel gespült Mörser und Stößel zu homogenisieren. Um organische Verunreinigungen zu entfernen, verbrennen die erforderlichen Borosilikat Glas, Pipetten, Fläschchen und mit einem Gewicht von Dosen in einem Ofen. Spülen Sie nach Abzug der Glaswaren im Ofen abkühlen lassen die Metallwerkzeuge mit einer Mischung von Dichlormethan und Methanol. Sobald die Probe und Glaswaren vorbereitet sind, kann die Ultraschall-Verfahren beginnen.

Von diesem Schritt auf alle Container und Glaswaren sollte verbrannt vor dem Gebrauch. Legen Sie die mit einem Gewicht von Zinn auf einer Skala und Tara. Spülen Sie die Lab-Spatel mit der Lösungsmittelgemisches, dann verwenden Sie, um eine entsprechende Masse gefriergetrocknete, homogenisierten Probe in das mit einem Gewicht von Zinn zu übertragen und die Masse aufnehmen. Übertragen Sie sorgfältig die Einwaage in einem beschrifteten Fläschchen. Mit der Spritzflasche DCM:MeOH, hinzufügen genug, dass die Probe von 1 bis 2 cm des Lösungsmittels bedeckt ist, und das Fläschchen Kappe. Legen Sie das Fläschchen auf eine wasserdichte Rack jetzt bereit für Beschallung. Platzieren Sie die Zahnstange direkt in die Anwendung von Ultraschall-Bad. Überprüfen Sie, dass der Wasserstand in der Beschallung Badewanne nur tief genug, um die Probengefäße bis an die Spitze des Lösungsmittels Extraktion zu Tauchen ist. Beschallen Sie für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie nach Beschallung den Ständer aus der Sonikator. Lassen Sie die Fläschchen sitzen um Sedimente absetzen um auftreten zu ermöglichen.

Entfernen Sie die obere Phase Dichlormethan Methanol aus der Extraktion Fläschchen mit Pipette und Birne, und übertragen Sie in ein anderes vorgewogene und beschrifteten Fläschchen. Wiederholen Sie die Anwendung von Ultraschall insgesamt drei Mal für jede Probe. Sammeln Sie die Extrakte in einer Durchstechflasche. Lassen Sie entnommene Proben in ihre Flaschen, Kappen, und in der Kapuze, locker mit Folie bedeckt trocknen. Als "extrahierten Rückstand" beschriften und in dem Lösungsmittel Extraktion zu speichern. Nun, da die Biomarker extrahiert haben, müssen sie gereinigt werden bevor Analyse stattfinden kann.

Beschallung mehrere solvent-Extraktion Prozesse beschleunigt und ist weit verbreitet in geochemischen Untersuchungen. Viele Archäologen arbeiten mit Geochemiker um die ökologische und kulturelle Verhältnisse zu rekonstruieren, unter denen frühe menschlichen Kulturen gelebt. Keramik, eines der ältesten menschlichen Erfindungen, wenn ausgegraben, kann gefunden werden, enthalten restliche molekulare Fossilien aus Wein, Reis oder andere Inhalte, die einmal gespeichert wurden.

Chemischen Nachweis der Substanzen auf die Zahnoberfläche, kleine Proben von Keramik sind in Gegenwart organischer Lösungsmittel beschallt und extrahierte Verbindungen können anschließend resorbiert auszugraben stromabwärts durch spektroskopische Methoden identifiziert. Diese Art der Analyse hilft Archäologen erkennen der Arten von Ressourcen, die alten Bevölkerungen zur Verfügung standen und die Bedingungen ihres Lebensraums zu rekonstruieren.

Photosynthetische Mikroalgen findet man in Meeres- und Süßwasser-Ökosysteme. Denn sie in Meerwasser-basierte Medien wachsen und ihre Kultur deutlich kleinere Gebiete nimmt, werden sie jetzt weithin als eine viel versprechende Alternative zur terrestrischen Pflanzen für die Erzeugung von Biokraftstoffen untersucht.

Zum Extrahieren von Lipiden aus Mikroalgen Biomasse beschreiben diese Forscher eine Ultraschall-gestützte solvente-Extraktion. Akustische Kavitation bei Beschallung stört effektiv starre Mikroalgen Zellwände um Lipide zu befreien. Solche Techniken unterstützen die Charakterisierung von neuen Mikroalgen aus der Umwelt für die Produktion von nicht-Erdöl Energiequellen.

Sie habe nur Jupiters Einführung in Sonication-Assisted Extraktion von Biomarkern aus Sedimenten beobachtet. In den folgenden Videos erklären, wie der Extrakt für die Analyse weiter gereinigt wird.

Danke fürs Zuschauen!

Procedure

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(1) die notwendigen Materialien zu sammeln.

  1. Proben (Blätter, Schmutz, Pilzen, Rinde, Gewebe), in der Regel eingefroren, gefriergetrocknet, zerkleinert und homogenisiert vor Extraktion, extrahiert in Gruppen um die Effizienz zu maximieren. Drei Proben zu extrahieren.
  2. Abhängig von der Größe der Stichprobe können mit einem Volumen von 4-60 mL Fläschchen verwendet werden. Für dieses Experiment Borosilikat Glasvials (40 mL) und Lösungsmittel sicher Kappen verwendet. Fläschchen, Borosilikatglas Pipetten und mit einem Gewicht von Dosen sollten verbrannt bei 550 ° C 6 h vor der Entfernung der möglichen organischen Verunreinigungen gewährleistet werden.
  3. Dichlormethan und Methanol sind häufig in den meisten organischen Geochemie Laboratorien. Sie werden einzeln zur Lab-Tools und Glaswaren vor Gebrauch abspülen. Eine Mischung von Dichlormethan (DCM) in Methanol (MeOH; 9:1) ist in vielen Labors verwendet, um effizient Biomarker mit einer breiten Palette von Polaritäten zu extrahieren. Lösungsmittel sollte frei von organischen Verunreinigungen sein.
  4. Verwenden Sie ein Wasserbad Beschallung bei Raumtemperatur. Eine Reihe von Sonikator Größen und Beschallung mit oder ohne Hitze sind wichtige wissenschaftliche Ausrüstung Handel erhältlich.
  5. Vial-Racks, die wasserdicht sein sollte, werden in Beschallung Bad platziert werden.
  6. Lösungsmittel genehmigte chemische Haube.

2. Vorbereitung der Probe

  1. Legen Sie ein mit einem Gewicht von Zinn auf den Labormaßstab und dann Tara verbrannt.
  2. Spülen Sie die Labor-Spachtel mit Lösungsmittel, dann verwenden Sie, um eine entsprechende Masse der Probe in das mit einem Gewicht von Zinn zu übertragen, und zeichnen Sie die Masse.
    1. Die Masse der Probe variiert je nach seinen Gehalt an organischer Substanz. Schlanke Material relativ organischer Substanz (marine Schlamm) erfordern mehrere Gramm, während organische Substanz Reiches Material (Blattgewebe) viel weniger erfordern.
  3. Übertragen Sie das gesamte Material in der Waage Dose in einer verbrannt, vorher gewogen und etikettiert Fläschchen. Verschließen Sie das Fläschchen, dann verwerfen Sie mit einem Gewicht von Zinn zu.
  4. Führen Sie Schritte 2.1-2.3 für jede Probe extrahiert werden.

3. Gewinnung

  1. Mit einem Pre-verbrannt-Pipette und Birne, ~ 20 mL der DCM:MeOH (9:1) Mischung in jedes Fläschchen zu übertragen (Fläschchen sollte etwa halb voll sein). Rekapitulieren Sie Fläschchen, bevor ich auf nächste Probe, so dass die flüchtige Lösungsmittel nicht verdunsten.
    1. Die Volatilitäten der DCM und MeOH sind unterschiedlich. Verdunstung der Lösungsmittel Extraktion durch entdeckelte Probenfläschchen hat die Fähigkeit, seine Polarität, und somit die Extraktion zu ändern.
  2. Legen Sie die Probengefäße in einem wasserdichten Vial Rack.
  3. Überprüfen Sie, dass das Niveau des Wassers in der Beschallung Badewanne nur tief genug, um die Probengefäße bis an die Spitze des Lösungsmittels Extraktion zu versenken. Zuviel Wasser kann dazu führen, dass die Fläschchen zu schweben; zu wenig Wasser reagiert die Proben aus wird richtig aufgeregt.
  4. Legen Sie das Fläschchen-Rack mit den Proben in es direkt in die Anwendung von Ultraschall-Bad.
  5. Beschallen Sie für 30 min bei Raumtemperatur.
  6. Entfernen Sie Probenrack aus Sonikator. Wenn Sedimente zu extrahieren, lassen Sie es für 30 min erlauben absetzen auftreten. Wenn eine andere Gruppe von Proben zu extrahieren, geben Sie Sonikator zu diesem Zeitpunkt.
  7. Entfernen Sie die DCM:MeOH Mischung aus der Extraktion-Durchstechflasche mit einem Pre-verbrannt-Pipette und Birne, und Einfügen in ein anderes vorab gewogen, Pre-verbrannt, und mit der Bezeichnung 40-mL-Fläschchen.
  8. Wiederholen Sie die 3.1-3.7 3 X für alle Proben.
  9. Lassen Sie entnommene Proben in ihre Flaschen, Kappen, und in der Kapuze, locker mit Folie bedeckt trocknen. Als "extrahierten Rückstand" beschriften und speichern.
  10. Beschriften Sie die kombinierten Extrakte für jede Probe als 'TLE'.

Results

Am Ende der Extraktion zeigt sich ein insgesamt Lipid-Extrakt (TLE) für jede Probe. Jede Durchstechflasche enthält die extrahierbare organische Substanz vom Sediment, Boden oder Pflanzengewebe. Diese TLEs können jetzt analysiert und ihre chemischen Bestandteile identifiziert und quantifiziert.

Applications and Summary

Verschiedene Klassen von Biomarkern vermitteln Informationen über spezifische Aspekte des Systems Erde. Zum Beispiel in den Kinderschuhen, organische Geochemie befasste sich hauptsächlich mit der Bildung, Migration und Veränderung von Erdöl, und viele der chemischen Werkzeuge verwenden organische Geochemiker heute basieren auf dieser ersten Untersuchungen. Es war durch die Untersuchung einer Klasse von Verbindungen genannt Isoprenoids, nachdem ein sich wiederholendes fünf Kohlenstoff-Muster (Abbildung 2), dass Wissenschaftler entdeckten Erdöl umfasste die chemisch veränderte Überreste der alten Primärproduzenten, wie Plankton im Meer (Umwandlung in Öl, Abbildung 3) oder Torfmoore auf dem Land (Kohle, Abbildung 4). Chemiker der großen Ölgesellschaften verwendet die Verhältnisse von einer Vielzahl von Verbindungen, jedes mit seinen eigenen bekannten Kurs der Veränderung zu schätzen, wie alt Erdöl war, woher es stammt, und ob es Wert auszunutzen war. Heute werden neue Biomarker, identifiziert und charakterisiert in moderne und antike Proben analysiert in organische Geochemie Labors auf der ganzen Welt entdeckt. Viele der heutigen Anwendungen versuchen, Umweltinformationen von Biomarkern in modernen Proben (Blätter, Boden, Mikroben, Wasserproben, etc.), um die Biomarker-Dienstprogramm, um alte Ablagerungen in einer Bemühung, die Klimazonen, die Umgebungen und die Ökosysteme der Vergangenheit rekonstruieren verlängern erhalten zu extrahieren. Beispielsweise die Verteilung von einer Gruppe von Biomarkern genannt Glycerin-Dialkylcarbonat Glycerin-Tetraethers (kurz GDGTs), produziert von einer Suite von Archaeen und Bakterien, fanden sich in modernen Sedimenten in einer vorhersagbaren Weise in Reaktion auf die Luft oder Wasser Temperatur ändern. Die Verteilung dieser Biomarker in alten Sedimenten kann daher verwendet werden, oder durch eine Reihe von Sedimenten des bekannten Alters, um Luft und Wasser zu rekonstruieren Temperatur mehrere Millionen Jahre zurück.

Figure 2
Abbildung 2: Isopren besteht aus fünf Kohlenstoffatomen und zwei Doppelbindungen. Beim addieren in Biosynthese Reaktion können sie komplexe Moleküle, die Diagnose auf das Vorhandensein des Lebens bilden. Z. B. 2, 6,10,15,19-Pentamethyleicosane, häufig in Cyanobakterien Matten gefunden.

Figure 3
Abbildung 3. Beleuchtung von Plankton auf Malediven. Copyright PawelG Foto geteilt.

Figure 4
Abbildung 4. Torfmoor in 4.500 m Höhe in den ecuadorianischen Anden. Copyright Dr. Morley Read

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(1) die notwendigen Materialien zu sammeln.

  1. Proben (Blätter, Schmutz, Pilzen, Rinde, Gewebe), in der Regel eingefroren, gefriergetrocknet, zerkleinert und homogenisiert vor Extraktion, extrahiert in Gruppen um die Effizienz zu maximieren. Drei Proben zu extrahieren.
  2. Abhängig von der Größe der Stichprobe können mit einem Volumen von 4-60 mL Fläschchen verwendet werden. Für dieses Experiment Borosilikat Glasvials (40 mL) und Lösungsmittel sicher Kappen verwendet. Fläschchen, Borosilikatglas Pipetten und mit einem Gewicht von Dosen sollten verbrannt bei 550 ° C 6 h vor der Entfernung der möglichen organischen Verunreinigungen gewährleistet werden.
  3. Dichlormethan und Methanol sind häufig in den meisten organischen Geochemie Laboratorien. Sie werden einzeln zur Lab-Tools und Glaswaren vor Gebrauch abspülen. Eine Mischung von Dichlormethan (DCM) in Methanol (MeOH; 9:1) ist in vielen Labors verwendet, um effizient Biomarker mit einer breiten Palette von Polaritäten zu extrahieren. Lösungsmittel sollte frei von organischen Verunreinigungen sein.
  4. Verwenden Sie ein Wasserbad Beschallung bei Raumtemperatur. Eine Reihe von Sonikator Größen und Beschallung mit oder ohne Hitze sind wichtige wissenschaftliche Ausrüstung Handel erhältlich.
  5. Vial-Racks, die wasserdicht sein sollte, werden in Beschallung Bad platziert werden.
  6. Lösungsmittel genehmigte chemische Haube.

2. Vorbereitung der Probe

  1. Legen Sie ein mit einem Gewicht von Zinn auf den Labormaßstab und dann Tara verbrannt.
  2. Spülen Sie die Labor-Spachtel mit Lösungsmittel, dann verwenden Sie, um eine entsprechende Masse der Probe in das mit einem Gewicht von Zinn zu übertragen, und zeichnen Sie die Masse.
    1. Die Masse der Probe variiert je nach seinen Gehalt an organischer Substanz. Schlanke Material relativ organischer Substanz (marine Schlamm) erfordern mehrere Gramm, während organische Substanz Reiches Material (Blattgewebe) viel weniger erfordern.
  3. Übertragen Sie das gesamte Material in der Waage Dose in einer verbrannt, vorher gewogen und etikettiert Fläschchen. Verschließen Sie das Fläschchen, dann verwerfen Sie mit einem Gewicht von Zinn zu.
  4. Führen Sie Schritte 2.1-2.3 für jede Probe extrahiert werden.

3. Gewinnung

  1. Mit einem Pre-verbrannt-Pipette und Birne, ~ 20 mL der DCM:MeOH (9:1) Mischung in jedes Fläschchen zu übertragen (Fläschchen sollte etwa halb voll sein). Rekapitulieren Sie Fläschchen, bevor ich auf nächste Probe, so dass die flüchtige Lösungsmittel nicht verdunsten.
    1. Die Volatilitäten der DCM und MeOH sind unterschiedlich. Verdunstung der Lösungsmittel Extraktion durch entdeckelte Probenfläschchen hat die Fähigkeit, seine Polarität, und somit die Extraktion zu ändern.
  2. Legen Sie die Probengefäße in einem wasserdichten Vial Rack.
  3. Überprüfen Sie, dass das Niveau des Wassers in der Beschallung Badewanne nur tief genug, um die Probengefäße bis an die Spitze des Lösungsmittels Extraktion zu versenken. Zuviel Wasser kann dazu führen, dass die Fläschchen zu schweben; zu wenig Wasser reagiert die Proben aus wird richtig aufgeregt.
  4. Legen Sie das Fläschchen-Rack mit den Proben in es direkt in die Anwendung von Ultraschall-Bad.
  5. Beschallen Sie für 30 min bei Raumtemperatur.
  6. Entfernen Sie Probenrack aus Sonikator. Wenn Sedimente zu extrahieren, lassen Sie es für 30 min erlauben absetzen auftreten. Wenn eine andere Gruppe von Proben zu extrahieren, geben Sie Sonikator zu diesem Zeitpunkt.
  7. Entfernen Sie die DCM:MeOH Mischung aus der Extraktion-Durchstechflasche mit einem Pre-verbrannt-Pipette und Birne, und Einfügen in ein anderes vorab gewogen, Pre-verbrannt, und mit der Bezeichnung 40-mL-Fläschchen.
  8. Wiederholen Sie die 3.1-3.7 3 X für alle Proben.
  9. Lassen Sie entnommene Proben in ihre Flaschen, Kappen, und in der Kapuze, locker mit Folie bedeckt trocknen. Als "extrahierten Rückstand" beschriften und speichern.
  10. Beschriften Sie die kombinierten Extrakte für jede Probe als 'TLE'.

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