環境ソースから細菌のグラム染色

Environmental Microbiology
 

Overview

ソース: ドクターペッパー イアン博士チャールズ Gerba - アリゾナ大学所
示す著者: ルイーザ Ikner

スコープと潜在的な応用環境微生物学研究のスペクトルは広いです。ままかどうか仕事は、ベンチ スケールの知られている細菌の菌株や未知の細菌分離株を含む土壌や水のサンプルを収集するフィールドには、迅速かつ視覚的に金利の人為的集団を識別する能力環境微生物学者たちに大きい輸入の今日でも使用可能な分子技術の豊富な。このビデオは、グラム染色として知られているそのようなの 1 つの手法を説明します。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 環境微生物学の必需品. 環境ソースから細菌のグラム染色. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Principles

グラム染色は、古典的なかつ重要な染色技術が環境微生物学者によって広きます。簡単な汚れと同様に、ことができます細菌細胞の形態 (例えば球菌、棒、胞子) の評価のためのサイズ、および配置 (例えば、チェーンまたはクラスター)。また、それは細菌の 2 つの原則のグループへの分化を可能、グラム陰性菌およびグラム陽性、細胞壁組成と構造 (図 1) によると。

グラム染色は、複数段階のプロセスです。染色前に細菌塗抹標本は、プレート、傾斜、またはスープのカルチャを使用して用意しています。塗抹標本準備を乾燥し、きれいなガラスのスライドに固定します。クリスタル ・ バイオレットの主な汚れは、固定の塗抹標本に適用されます。クリスタル バイオレットは積極的にから成る基本的な汚れイオン色 (すなわち発色団) 細菌の細胞壁に負荷電の官能基を持つ弱いイオン結合を形成します。洗浄した後軽く水でスライド、グラムのヨウ素が適用され、細胞壁にクリスタル バイオレットによる不溶性複合体を形作る。クリスタル バイオレット-ヨウ素複合体をさらには、ペプチドグリカン、細菌の細胞壁の主成分をバインドします。第 2 水洗浄後脱色剤は簡単に塗抹標本に適用されます。グラム陰性細菌のクリスタル バイオレット-ヨウ素複合体で洗い流される脱色の段階では、グラム陽性菌の紫の染色を保持します。3 番目と最後の水洗の後に、ピンクや赤のグラム陰性菌を色づけサフラニンの対比染色が続きます。

Figure 1
図 1。グラム陽性およびグラム陰性菌の細胞壁の比較。

Procedure

1. サンプル コレクション

  1. 微生物分析検査室に土のサンプルとトランスポートを収集します。
  2. 演習では、10 g サンプル分析用天秤を使用して重量を量る。
  3. リン酸緩衝生理食塩水 95 mL に、サンプル 1:10 の希釈 (10 の部分の土壌は 5 パーツ水性液に相当) と (図 2ステップ 1) をミックスする渦。
  4. その後 1:10 を実行、mL 当たり少なくとも 10-5 g まで希釈土壌し、拡散板 2 つまたは低栄養寒天媒体 (例えばR2A) に 3 つのレプリケートで希釈を選択した (図 2、手順 2-3)。
  5. (図 2手順 4) 室温で 1 週間の版を孵化させなさい。
  6. 隔離、および (図 3、ステップ 1-3) 新鮮な寒天に連勝の 1 つまたは 2 つのコロニーを選択します。
  7. 縞板室温 (図 3のステップ 4) で 2 〜 3 日間インキュベートします。

2. 細菌塗抹標本の作製

  1. 隔離されたコロニーの縞板を観察します。
  2. 各塗抹標本準備の準備、接種したループを浸しエタノール、火炎滅菌し、滅菌蒸留水 1 に 2 loopfuls をあらかじめ洗浄し、ガラスのスライドの中央に配置。
  3. 上記のようにもう一度接種したループを滅菌します。いったん冷却、単一の隔離されたコロニーから少量の文化を削除し、(塗抹標本は希釈脱脂乳になります) スライドの水滴をミックスします。接種したループは、植民地の分離前に冷却しなければなりません。高温でループになりますコロニーやスプラッタ、中長期菌エアロゾル化につながる可能性があります。一般的には、ループが使用する熱すぎるとき「ヒスノイズ」寒天または植民地に適用、聞かされます。ループの不適切な冷却効率の文化-スライド転送と細胞形態の歪みの可能性があります。
  4. 塗抹標本を測定約 2.5 cm × 2.5 cm、スライドの表面に広がるし、それを空気乾燥を許可します。空気層流条件下で発生する乾燥が重要です。スライドを乾燥塗抹標本を妨害しないように吹きしない必要があります。また、スライドでは、炎で乾燥させた、細胞の形態を維持するためにする必要がありますできません。
  5. 乾燥後、熱は 2 〜 3 倍、炎を素早くスライドを渡すことによって塗抹標本を修正します。スライドをスライド ガラスに細胞の形態および/または損傷の歪みを防ぐために、炎の中で固定開催しない必要があります。

3. グラム染色

  1. きれいな洗濯はさみを使用して 1 つの端にスライドを固定します。
  2. クリスタル バイオレット (プライマリ染色) で汚れをカバー、2 〜 3 分押し続けます。
  3. 蒸留水を使用してスライドを慎重に洗います。水の流れは、損傷および/またはスライド ガラスからの剥離を防ぐために塗抹標本でない監督する必要があります。
  4. グラムのヨウ素塗抹標本をカバーし、2 分間保持水スライドを優しく洗浄します。
  5. 95% のエタノールを使用して汚れをもはやスライドから洗うまで塗抹標本を脱色 (これは通常 20 以上かかる塗抹標本の厚さに応じて s)、すぐに水で洗い流し。この手順は、スライドで、偽グラム染色指定 (すなわち、グラム変数) につながる可能性がありますを脱色を避けるために重要です。
  6. 塗抹標本に対比染色 (サフラニン) を追加を押し 30 秒。蒸留水を使用してスライドを洗い流し優しく、しみ、乾燥が吸水紙を使用します。

4. スライドの顕微鏡

  1. (例えば4 X、10 X)、低高ドライ (例えば40 X) を使用してスライドを観察し、オイルの浸漬 (100 X) 目的。オイルの液浸、塗抹標本に直接オイルを追加します。
  2. グラム陽性およびグラム陰性の土壌細菌の代表的な結果は、図 45を参照してください。

Figure 2
図 2。希釈・拡散めっき技術この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3。ストリーク プレート法によるコロニーの分離。

Figure 4
図 4グラム陽性細菌黄色ブドウ球菌.

Figure 5
図 5。グラム陰性細菌大腸菌.

細菌の形態と環境試料の広い範囲から広範な細胞区別が視覚化グラム染色が可能です。細菌を染色するには、制服の汚れがガラス面に適用し、乾燥します。塗抹標本を熱固定後クリスタル ・ バイオレットが適用されます。

脱色剤はグラム陰性の細胞がないグラム陽性細胞からクリスタル バイオレットでリンスです。第 2 の色素は、通常サフラニンは、グラム陰性菌の細胞を可視化する背景の汚れとして使用されます。ステンド グラス、したら、チェーンやクラスターなどの配置、サイズ、細胞の形態のセルを評価できます。

このビデオは、環境試料、分離菌種そこに発見、隔離されたコロニーをグラム染色を実行を準備する方法を実演します

2 つの広い構造クラスにほとんどの細菌の分類では、グラム染色: グラム陽性およびグラム陰性。両方のクラスは、基になるリン脂質の膜を持っているが、細胞壁の構造が大きく異なります。グラム陽性菌の細胞壁は主に糖とアミノ酸で構成されるポリマーであるペプチドグリカンの厚い層で構成されます。グラム陰性菌の細胞壁は、ペプチドグリカン、2 番目の脂質膜に挟まれた薄い層を持っています。通常、この外膜には、リポ多糖が含まれています。

荷電クリスタル バイオレットは負荷電の細菌の細胞壁に弱くバインドします。グラムのヨウ素は、不溶性錯体により細胞壁の固定、クリスタル バイオレット色素を形成します。

脱色の段階では、契約し、クリスタル バイオレット-ヨウ素複合体をトラップにそれを引き起こしているグラム陽性細胞におけるペプチドグリカンは脱水です。グラム陰性菌細胞は、脱色剤、多孔性を増やす外膜が損なわれます。これは洗い流されるためクリスタル バイオレット-ヨウ素複合体ことができます。

グラム染色土壌細菌の背後にある原理を理解すると、処理を行う研究室では、土壌細菌をみましょう。

フィールドに土のサンプルを収集した後解析の研究室にそれをもたらします。サンプルを絞り込む、ふるい、ふるわれた土壌分析用天秤を使用しての 10 グラムの重量を量る。

リン酸緩衝生理食塩水とミックスする渦 95 mL にサンプルを希釈します。希釈液 1 に 10 追加、各希釈間ボルテックスを実行します。複製の低栄養 agarose のプレートの上に、少なくとも 3 の連続希釈の因数を転送します。

エタノール火炎滅菌でメディアに叩くことによって曲げガラス棒の冷却、板の表面にサンプルを広がってください。板室温で孵化させなさい。3 〜 5 日をインキュベート後 30 に 300 離散植民地で最も高い希釈を選択します。滅菌接種ループの分離のための興味のコロニーを選択します。

新鮮な板の 1 つのセクションの上にコロニーを連勝します。縞の間のループを殺菌、離散シングル コロニーのそれに続く分離のためにプレートの各セクションの上にジグザグ パターンの連続した縞を作る。プレートを 1 〜 2 日間室温でインキュベートします。

細菌塗抹標本の作製を開始するには、取り扱いの容易さのためあらかじめ洗浄し、ガラスのスライドにクリップをつけてください。各細菌塗抹標本をきれいおよび接種ループを火炎滅菌します。滅菌蒸留水の 2 loopfuls をスライドの中央に配置します。

ループを殺菌後、隔離されたコロニーから少量の文化をもう一度、削除、スライド上の水と混ぜます。寒天の接種部分数回タップすることで、文化に触れる前にループを冷却することが重要です。塗抹標本には、薄められた牛乳がようになります。室温で乾燥するためにスライドを許可します。乾燥後、熱はすぐに炎を通すことで塗抹標本を修正します。

一度乾燥し、ピペット、塗抹標本上にクリスタル ・ バイオレットと放置の 2-3 分は慎重に優しく流れる水をできるように、スライドの上部に向かって直接の流れを目指すことで蒸留水を使用してスライドをすすいでください。塗抹標本に直接水流を目指していません。

グラムのヨウ素を使用してスライドをカバーします。2 分後蒸留水で優しくすすいでください。汚れはもはや洗い流すまで 95% のエタノールを含むスライドを脱色します。すぐに水で洗い流してください。これは、過剰に塗抹標本を脱色が制限されます。

カウンターの汚れとして 30 の塗抹標本にサフラニンを追加 s。これは、グラム陰性菌の細胞の存在を汚します。慎重に蒸留水ですすぎ、吸水紙で乾燥しみ。結果スライドを顕微鏡で観察します。粗調整を行いより高い倍率の小さいビューのフィールド移動する前に汚れの理想的な部分を見つけるに最初低消費電力目的を使用します。

さらにイメージングおよび媒体力目的の塗抹標本を調整後、塗抹標本に直接浸漬オイルを追加します。オイルは、最高の顕微鏡写真を提供する高出力目的に必要です。グラム陽性菌は、グラム陰性菌の細胞は赤色になります間、青や紫の色で表示されますまたはピンク。細胞壁の構造に加え形状と配置を生じる顕微鏡写真から明らかです。

細菌を質的研究する染色グラムの機能は、科学分野の広い範囲にとって重要です。

土壌は細菌の分離し、分析から環境のソースのひとつです。飲料水、サンプル準備を変更しなければなりません。水道水のサンプルを蛇口から引き出される、多様な従属栄養細菌のコロニーの成長を促進する成長メディアにメッキできます。R2A など媒体にめっき、時にプロセスは土壌手順とほぼ同じです。

特定の細菌同定手法のパラメーターが興味の細菌の細胞壁の種類に依存します。この例では、敗血症患者の血液はテストされ、グラム陽性菌をかくまっているように発見されました。

この情報により、細胞の rRNA は連結を種特異的ペプチド核酸プローブを選ばれました。これらのプローブは、現在の種を識別するために使用された蛍光染料にバインドされていた。

グラム陽性および否定的な細胞構造の根本的な違いのため細菌クリスタル バイオレット以外にも他の化合物にユニークな応答があります。この実験は、クロストリジウム ・ ディフィシル、糞便検体からのグラム陽性菌を孤立させようとします。グラム陰性菌の細胞の成長を阻害する、サイクロセリンは寒天プレートに追加されました。プレートに成長したグラム陽性の細胞がさらに他の方法で分離しました。

ゼウスのグラム染色環境研究入門を見てきただけ。今、プロセスと手法を実行し、結果を利用する方法の利点を理解する必要があります。見てくれてありがとう!

Applications and Summary

グラム染色は、環境および臨床微生物学の多くのサブ分野で使用されます。水品質の科学者は、水中の糞便細菌の検出のため、グラム染色を検証ツールとして使用できます。土壌から分離された細菌は、さらに培養土社会を特徴付けるために染色グラムです。環境微生物のグラム染色細胞壁の構造によると細菌集団の分類の補助です。これは順番に、乾燥と他の環境ストレスに耐えるように与えられた群集の一般的な機能についての情報を提供します。グラム染色指定の知識は、グラム陽性菌、グラム陰性の細菌よりも特定の化学反応によって不活化を受けにくくする傾向がある、総合殺菌剤およびその他の抗菌薬の開発で重要なもです。

臨床微生物学用、グラム染色、伝統的な診断法とともに細菌病原体の身元を確認する使用されます。これはまた素晴らしい援助の培養に失敗しました、またはオプションではない場合です。臨床検体のグラム染色は、可能性がありますいない観察されているそれ以外の場合病因のエージェントの存在を明らかにできます。

1. サンプル コレクション

  1. 微生物分析検査室に土のサンプルとトランスポートを収集します。
  2. 演習では、10 g サンプル分析用天秤を使用して重量を量る。
  3. リン酸緩衝生理食塩水 95 mL に、サンプル 1:10 の希釈 (10 の部分の土壌は 5 パーツ水性液に相当) と (図 2ステップ 1) をミックスする渦。
  4. その後 1:10 を実行、mL 当たり少なくとも 10-5 g まで希釈土壌し、拡散板 2 つまたは低栄養寒天媒体 (例えばR2A) に 3 つのレプリケートで希釈を選択した (図 2、手順 2-3)。
  5. (図 2手順 4) 室温で 1 週間の版を孵化させなさい。
  6. 隔離、および (図 3、ステップ 1-3) 新鮮な寒天に連勝の 1 つまたは 2 つのコロニーを選択します。
  7. 縞板室温 (図 3のステップ 4) で 2 〜 3 日間インキュベートします。

2. 細菌塗抹標本の作製

  1. 隔離されたコロニーの縞板を観察します。
  2. 各塗抹標本準備の準備、接種したループを浸しエタノール、火炎滅菌し、滅菌蒸留水 1 に 2 loopfuls をあらかじめ洗浄し、ガラスのスライドの中央に配置。
  3. 上記のようにもう一度接種したループを滅菌します。いったん冷却、単一の隔離されたコロニーから少量の文化を削除し、(塗抹標本は希釈脱脂乳になります) スライドの水滴をミックスします。接種したループは、植民地の分離前に冷却しなければなりません。高温でループになりますコロニーやスプラッタ、中長期菌エアロゾル化につながる可能性があります。一般的には、ループが使用する熱すぎるとき「ヒスノイズ」寒天または植民地に適用、聞かされます。ループの不適切な冷却効率の文化-スライド転送と細胞形態の歪みの可能性があります。
  4. 塗抹標本を測定約 2.5 cm × 2.5 cm、スライドの表面に広がるし、それを空気乾燥を許可します。空気層流条件下で発生する乾燥が重要です。スライドを乾燥塗抹標本を妨害しないように吹きしない必要があります。また、スライドでは、炎で乾燥させた、細胞の形態を維持するためにする必要がありますできません。
  5. 乾燥後、熱は 2 〜 3 倍、炎を素早くスライドを渡すことによって塗抹標本を修正します。スライドをスライド ガラスに細胞の形態および/または損傷の歪みを防ぐために、炎の中で固定開催しない必要があります。

3. グラム染色

  1. きれいな洗濯はさみを使用して 1 つの端にスライドを固定します。
  2. クリスタル バイオレット (プライマリ染色) で汚れをカバー、2 〜 3 分押し続けます。
  3. 蒸留水を使用してスライドを慎重に洗います。水の流れは、損傷および/またはスライド ガラスからの剥離を防ぐために塗抹標本でない監督する必要があります。
  4. グラムのヨウ素塗抹標本をカバーし、2 分間保持水スライドを優しく洗浄します。
  5. 95% のエタノールを使用して汚れをもはやスライドから洗うまで塗抹標本を脱色 (これは通常 20 以上かかる塗抹標本の厚さに応じて s)、すぐに水で洗い流し。この手順は、スライドで、偽グラム染色指定 (すなわち、グラム変数) につながる可能性がありますを脱色を避けるために重要です。
  6. 塗抹標本に対比染色 (サフラニン) を追加を押し 30 秒。蒸留水を使用してスライドを洗い流し優しく、しみ、乾燥が吸水紙を使用します。

4. スライドの顕微鏡

  1. (例えば4 X、10 X)、低高ドライ (例えば40 X) を使用してスライドを観察し、オイルの浸漬 (100 X) 目的。オイルの液浸、塗抹標本に直接オイルを追加します。
  2. グラム陽性およびグラム陰性の土壌細菌の代表的な結果は、図 45を参照してください。

Figure 2
図 2。希釈・拡散めっき技術この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3。ストリーク プレート法によるコロニーの分離。

Figure 4
図 4グラム陽性細菌黄色ブドウ球菌.

Figure 5
図 5。グラム陰性細菌大腸菌.

細菌の形態と環境試料の広い範囲から広範な細胞区別が視覚化グラム染色が可能です。細菌を染色するには、制服の汚れがガラス面に適用し、乾燥します。塗抹標本を熱固定後クリスタル ・ バイオレットが適用されます。

脱色剤はグラム陰性の細胞がないグラム陽性細胞からクリスタル バイオレットでリンスです。第 2 の色素は、通常サフラニンは、グラム陰性菌の細胞を可視化する背景の汚れとして使用されます。ステンド グラス、したら、チェーンやクラスターなどの配置、サイズ、細胞の形態のセルを評価できます。

このビデオは、環境試料、分離菌種そこに発見、隔離されたコロニーをグラム染色を実行を準備する方法を実演します

2 つの広い構造クラスにほとんどの細菌の分類では、グラム染色: グラム陽性およびグラム陰性。両方のクラスは、基になるリン脂質の膜を持っているが、細胞壁の構造が大きく異なります。グラム陽性菌の細胞壁は主に糖とアミノ酸で構成されるポリマーであるペプチドグリカンの厚い層で構成されます。グラム陰性菌の細胞壁は、ペプチドグリカン、2 番目の脂質膜に挟まれた薄い層を持っています。通常、この外膜には、リポ多糖が含まれています。

荷電クリスタル バイオレットは負荷電の細菌の細胞壁に弱くバインドします。グラムのヨウ素は、不溶性錯体により細胞壁の固定、クリスタル バイオレット色素を形成します。

脱色の段階では、契約し、クリスタル バイオレット-ヨウ素複合体をトラップにそれを引き起こしているグラム陽性細胞におけるペプチドグリカンは脱水です。グラム陰性菌細胞は、脱色剤、多孔性を増やす外膜が損なわれます。これは洗い流されるためクリスタル バイオレット-ヨウ素複合体ことができます。

グラム染色土壌細菌の背後にある原理を理解すると、処理を行う研究室では、土壌細菌をみましょう。

フィールドに土のサンプルを収集した後解析の研究室にそれをもたらします。サンプルを絞り込む、ふるい、ふるわれた土壌分析用天秤を使用しての 10 グラムの重量を量る。

リン酸緩衝生理食塩水とミックスする渦 95 mL にサンプルを希釈します。希釈液 1 に 10 追加、各希釈間ボルテックスを実行します。複製の低栄養 agarose のプレートの上に、少なくとも 3 の連続希釈の因数を転送します。

エタノール火炎滅菌でメディアに叩くことによって曲げガラス棒の冷却、板の表面にサンプルを広がってください。板室温で孵化させなさい。3 〜 5 日をインキュベート後 30 に 300 離散植民地で最も高い希釈を選択します。滅菌接種ループの分離のための興味のコロニーを選択します。

新鮮な板の 1 つのセクションの上にコロニーを連勝します。縞の間のループを殺菌、離散シングル コロニーのそれに続く分離のためにプレートの各セクションの上にジグザグ パターンの連続した縞を作る。プレートを 1 〜 2 日間室温でインキュベートします。

細菌塗抹標本の作製を開始するには、取り扱いの容易さのためあらかじめ洗浄し、ガラスのスライドにクリップをつけてください。各細菌塗抹標本をきれいおよび接種ループを火炎滅菌します。滅菌蒸留水の 2 loopfuls をスライドの中央に配置します。

ループを殺菌後、隔離されたコロニーから少量の文化をもう一度、削除、スライド上の水と混ぜます。寒天の接種部分数回タップすることで、文化に触れる前にループを冷却することが重要です。塗抹標本には、薄められた牛乳がようになります。室温で乾燥するためにスライドを許可します。乾燥後、熱はすぐに炎を通すことで塗抹標本を修正します。

一度乾燥し、ピペット、塗抹標本上にクリスタル ・ バイオレットと放置の 2-3 分は慎重に優しく流れる水をできるように、スライドの上部に向かって直接の流れを目指すことで蒸留水を使用してスライドをすすいでください。塗抹標本に直接水流を目指していません。

グラムのヨウ素を使用してスライドをカバーします。2 分後蒸留水で優しくすすいでください。汚れはもはや洗い流すまで 95% のエタノールを含むスライドを脱色します。すぐに水で洗い流してください。これは、過剰に塗抹標本を脱色が制限されます。

カウンターの汚れとして 30 の塗抹標本にサフラニンを追加 s。これは、グラム陰性菌の細胞の存在を汚します。慎重に蒸留水ですすぎ、吸水紙で乾燥しみ。結果スライドを顕微鏡で観察します。粗調整を行いより高い倍率の小さいビューのフィールド移動する前に汚れの理想的な部分を見つけるに最初低消費電力目的を使用します。

さらにイメージングおよび媒体力目的の塗抹標本を調整後、塗抹標本に直接浸漬オイルを追加します。オイルは、最高の顕微鏡写真を提供する高出力目的に必要です。グラム陽性菌は、グラム陰性菌の細胞は赤色になります間、青や紫の色で表示されますまたはピンク。細胞壁の構造に加え形状と配置を生じる顕微鏡写真から明らかです。

細菌を質的研究する染色グラムの機能は、科学分野の広い範囲にとって重要です。

土壌は細菌の分離し、分析から環境のソースのひとつです。飲料水、サンプル準備を変更しなければなりません。水道水のサンプルを蛇口から引き出される、多様な従属栄養細菌のコロニーの成長を促進する成長メディアにメッキできます。R2A など媒体にめっき、時にプロセスは土壌手順とほぼ同じです。

特定の細菌同定手法のパラメーターが興味の細菌の細胞壁の種類に依存します。この例では、敗血症患者の血液はテストされ、グラム陽性菌をかくまっているように発見されました。

この情報により、細胞の rRNA は連結を種特異的ペプチド核酸プローブを選ばれました。これらのプローブは、現在の種を識別するために使用された蛍光染料にバインドされていた。

グラム陽性および否定的な細胞構造の根本的な違いのため細菌クリスタル バイオレット以外にも他の化合物にユニークな応答があります。この実験は、クロストリジウム ・ ディフィシル、糞便検体からのグラム陽性菌を孤立させようとします。グラム陰性菌の細胞の成長を阻害する、サイクロセリンは寒天プレートに追加されました。プレートに成長したグラム陽性の細胞がさらに他の方法で分離しました。

ゼウスのグラム染色環境研究入門を見てきただけ。今、プロセスと手法を実行し、結果を利用する方法の利点を理解する必要があります。見てくれてありがとう!

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