Overview
Fuente: Laboratorios del Dr. Ian Pepper y el Dr. Charles Gerba - Universidad de Arizona
Demostrando autor: Luisa Ikner
El espectro de la investigación en Microbiología Ambiental es amplio en alcance y potencial de aplicación. Si el trabajo es báscula de mesa con aislamientos bacterianos conocidos, o en el campo recolectando muestras de suelo o agua que contienen aislamientos bacterianos desconocidos, la capacidad de rápidamente y visualmente discernir las poblaciones cultivables de interés sigue siendo de gran importancia para microbiólogos ambientales aún hoy con la abundancia de técnicas moleculares disponibles para su uso. Este vídeo demuestra una tal técnica, conocida como tinción de Gram.
Principles
La tinción de Gram es una clásica e importante técnica de maquillaje que sigue siendo ampliamente utilizada por los microbiólogos ambientales. Similar a una simple mancha, permite para la evaluación de la morfología celular bacteriana (p. ej., cocos, barras, formadores de espora), tamaño y la disposición (por ejemplo, cadenas o racimos). Además, permite la diferenciación de las bacterias en dos grupos distintos de principio, gram-negativas y gram positivas — según la composición de la pared celular y estructura (figura 1).
Tinción de Gram es un proceso de múltiples paso. Antes de teñir, se prepara un frotis bacteriano utilizando una placa, la inclinación o el caldo cultural. La preparación del frotis se seca y se fija sobre un portaobjetos de vidrio limpio. Una mancha principal de la violeta cristalina se aplica para el frotis fijado. Cristal violeta es una tinción básica conformada por positivamente cargado iones coloreados (es decir, cromóforos) que forman débiles enlaces iónicos con cargados negativa grupos funcionales presentes en la pared celular bacteriana. Después de enjuagar suavemente el portaobjetos con agua, yodo de Gram se aplica y forma complejos insolubles con el cristal violeta en la pared celular. Los complejos de cristal violeta-yodo más atan con peptidoglicano, un componente del principio de las paredes celulares bacterianas. Tras un segundo enjuague con agua, un agente decolorante se aplica brevemente en el borrón de transferencia. Para bacterias Gram-negativas, el complejo cristal violeta-yodo es arrastrado durante el paso de decolorante, con bacterias Gram-positivas la mancha púrpura de la retención. Un enjuague con agua de la tercera y última es seguido por una contratinción de safranina que colorea bacterias Gram negativas de color rosas o rojo.
Figura 1. Comparación de la pared celular de bacterias Gram positivas y gram negativas.
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Procedure
1. muestras
- Recoger la muestra de suelo y transporte al laboratorio para su análisis microbiano.
- En el laboratorio, pesar una muestra de 10 g con una balanza analítica.
- Diluir la muestra 1:10 a 95 mL de solución salina con tampón fosfato (10 piezas suelo es equivalente al líquido acuoso de 5 partes) y agitar para mezclar (figura 2, paso 1).
- Realizar posteriores 1:10 diluciones hasta por lo menos 10-5 g de suelo por mL, y placa de extensión seleccionado diluciones en repeticiones de dos o tres en el medio agar nutriente baja (e.g., R2A) (figura 2, los pasos 2 - 3).
- Incubar las placas durante una semana a temperatura ambiente (figura 2, paso 4).
- Seleccione una o dos colonias para el aislamiento y la racha en placas de agar fresco (figura 3, los pasos 1-3).
- Incubar las placas de la racha de dos o tres días a temperatura ambiente (figura 3, paso 4).
2. preparación de frotis bacteriano
- Observar las placas de la racha de colonias aisladas.
- Para preparar cada preparación de frotis, un asa de inoculación de la inmersión en etanol, esterilizar a la llama y coloque 1 a 2 loopfuls de agua destilada estéril en el centro del portaobjetos previamente limpiado.
- Esterilizar el asa de inoculación una vez más como se describió anteriormente. Una vez enfriado, extraer una pequeña cantidad de cultivo de una sola Colonia aislada y se mezcla con las gotitas de agua sobre el portaobjetos (frotis deberían parecerse a leche descremada diluida). El asa de inoculación debe refrigerarse antes de aislamiento de la Colonia. Un bucle que está demasiado caliente hará que la Colonia o medio de salpicaduras, que pueden conducir a la aerosolización de las bacterias. Generalmente, cuando el bucle es demasiado caliente para su uso, un "silbido" se escuchará cuando se aplica al agar o Colonia. Enfriamiento inadecuado del bucle también puede resultar en la transferencia de cultura para Deslice menos eficiente y distorsión de la morfología de la célula.
- Repartidos el frotis de la superficie de la diapositiva mide aproximadamente 2,5 cm x 2,5 cm y déjelo al aire seco. Es importante para el aire de secado se produzca bajo condiciones de flujo laminar. Diapositivas no deben ser sopladas seco para no interrumpir el borrón de transferencia. También, diapositivas no deben ser secados al fuego, para mantener la morfología de la célula.
- Después de secar, calor fijar el frotis al pasar la diapositiva rápidamente a través de una llama de 2-3 x. La diapositiva no debe sostener inmóvil en la llama, para evitar la distorsión de la morfología celular o daño en el portaobjetos de cristal.
3. tinción de gram
- Sujete la corredera en un extremo con una pinza para la ropa limpia.
- Cubrir el frotis con cristal violeta (colorante primario) y mantenga durante 2 a 3 min.
- Cuidadosamente lavar el portaobjetos con agua destilada. La corriente de agua no debe ser dirigida en el borrón de transferencia para prevenir daño o desprendimiento de lo portaobjetos de vidrio.
- Cubrir el frotis con yodo de Gram y mantenga pulsado durante 2 minutos, luego enjuagar suavemente el portaobjetos con agua.
- Decolorar el frotis con etanol al 95% hasta que la mancha ya no se lava de la diapositiva (esto toma generalmente no más de 20 s dependiendo el grosor del frotis), enjuagar inmediatamente con agua destilada. Este paso es vital para evitar el exceso de decolorante la diapositiva, que puede llevar a una Gram Tinción designación falsa (es decir, Gram-variable).
- Añadir el contraste (safranina) para el borrón de transferencia y mantenga durante 30 s. Luego enjuagar suavemente el portaobjetos con agua destilada y seque con papel absorbente.
4. microscopio Observación de diapositivas
- Observar las diapositivas utilizando baja (p. ej., 4 X o 10 X), high-dry (p. ej., 40 X) y objetivos de inmersión (100 X) de aceite. Para inmersión en aceite, agregue el aceite directamente en el frotis.
- Para obtener resultados representativos de bacterias Gram-positivas y gram negativas del suelo, ver figuras 4 y 5.
Figura 2. Dilución y la técnica de propagación-galjanoplastia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Aislamiento de la Colonia mediante la técnica de placa de racha.
Figura 4. Bacteria de suelo Gram-positiva Staphylococcus aureus .
Figura 5. Bacteria del suelo Gram-negativas Escherichia coli.
Tinción de Gram permite la rápida visualización de la morfología bacteriana y amplia distinción celular de una amplia gama de muestras ambientales. Para teñir las bacterias, un borrón de transferencia uniforme se aplica a un lado y deja secar. Después de calor-fijar el frotis, se aplica el cristal violeta.
Un agente decolorante, enjuaga el cristal violeta de células Gram-negativas, pero las células Gram positivas no. Un segundo colorante, generalmente safranina, se utiliza como una mancha de fondo para visualizar las células Gram-negativas. Una vez teñido, las células pueden ser evaluadas para la morfología de la célula, tamaño y arreglo, como cadenas o racimos.
Este video demuestra cómo preparar una muestra ambiental, aislar las especies bacterianas encontraron en ella y realizan una tinción de Gram de las colonias aisladas
Tinción de Gram permite la categorización de la mayoría de las bacterias en dos grandes clases estructurales: bacterias grampositivas y gramnegativas. Mientras que ambas clases tienen una membrana fosfolípidos subyacente, la estructura de la pared celular varía enormemente. Gram-positivas la pared celular se compone principalmente de una gruesa capa de peptidoglicano, que es un polímero que consiste de azúcares y aminoácidos. Paredes celulares Gram-negativas tienen una capa más delgada de peptidoglicano, intercalada entre una segunda membrana lipídica. Normalmente, esta membrana externa contiene lipopolisacáridos.
El violeta de cristal cargado positivamente se une débilmente a la pared celular bacteriana cargada negativamente. Yodo de Gram forma un complejo con el colorante cristal violeta, tal modo de fijación en la pared celular insoluble.
Durante el paso de decolorante, se deshidrata el peptidoglicano en las células Gram positivas, causando que se contrato y atrapar a los complejos de cristal violeta-yodo. En las células Gram-negativas, el agente decolorante compromete la membrana externa, aumentando su porosidad. Esto permite que los complejos de cristal violeta-yodo ser arrastrados.
Ahora que usted entiende los principios detrás de Gram Tinción bacterias del suelo, vamos a ver la labor de las bacterias del suelo en el laboratorio.
Después de recoger una muestra de suelo en el campo, ponerla en el laboratorio de análisis. Refinar la muestra con un tamiz y pesar 10 g de suelo tamizado con una balanza analítica.
Diluir la muestra en 95 mL de solución salina con tampón fosfato y agitar para mezclar. Realizar más diluciones de 1 a 10, Vortex entre cada dilución. Transferir alícuotas de diluciones sucesivas al menos 3, sobre placas de agarosa nutrientes bajos repetidos.
Después de esterilización llama etanol y enfriamiento de una varilla de vidrio doblada dando golpecitos sobre los medios de comunicación, difundir la muestra sobre la superficie de las placas. Incubar las placas a temperatura ambiente. Después de incubar durante 3 a 5 días, seleccionar la dilución mayor con 30 a 300 colonias discretas. Con un asa de inoculación estéril, seleccionar las colonias de interés para el aislamiento.
La Colonia en una sección de una placa fresca de la raya. El lazo entre las rayas de la esterilización, hacer rayas sucesivas en un patrón de zig-zag en cada sección de la placa para permitir el posterior aislamiento de colonias individuales discretas. Incubar las placas durante 1 a 2 días a temperatura ambiente.
Para iniciar la preparación de frotis bacteriano, coloque un clip en un portaobjeto previamente limpiado para facilidad de manejo. Para cada frotis bacteriano, limpiar y llama-esterilizar un asa de inoculación. Coloque 2 loopfuls de agua destilada estéril en el centro de la diapositiva.
Después de esterilizar el asa, extraer una pequeña cantidad de cultivo de una colonia aislada y mezclar con el agua en el portaobjetos. Es importante enfriar el asa antes de tocar la cultura golpeando una parte sin inocular agar varias veces. El borrón de transferencia debería parecerse a la leche diluida. Permita que el portaobjetos se seque a temperatura ambiente. Después de secar, calor fijar el frotis pasándolo rápidamente a través de una llama.
Una vez seco, pipeta de cristal violeta en el frotis y dejar reposar por 2-3 minutos enjuagar cuidadosamente el portaobjetos con agua destilada por dirigir el chorro directo hacia la parte superior de la diapositiva, permitiendo que el agua fluya suavemente hacia abajo. No dirija el flujo de agua directamente en el frotis.
Cubrir el portaobjetos con yodo de Gram. Después de 2 minutos, enjuague suavemente con agua destilada. Decolorar la diapositiva con etanol al 95% hasta que la mancha ya no se remueve. Enjuague inmediatamente con agua destilada. Esto limitará demasiado decolorar el frotis.
Agregar safranina como colorante contra al frotis para 30 s. Esto mancha las células gramnegativas presentes. Suavemente, enjuague con agua destilada y seque con papel absorbente. Observe la diapositiva resultante con un microscopio. Utilice un objetivo de baja potencia primero hacer ajustes gruesos y encontrar una porción ideal del frotis antes de pasar a las más pequeño campo de vistas de los aumentos más altos.
Después de la proyección de imagen adicional y ajustar el frotis con un objetivo de potencia media, agregue aceite de inmersión directamente en el frotis. El aceite es necesario para objetivos de alta potencia que proporcionarán el mejores micrografías. Bacterias Gram-positivas aparecerán azul o púrpura en color, mientras que las células Gram negativas será rojo o rosa. Además de estructura de la pared celular, forma y disposición están aclados de las imágenes resultantes.
La capacidad de tinción para el estudio cualitativo bacterias de Gram es importante para una amplia gama de campos científicos.
Suelo es una de las fuentes ambientales de que bacterias pueden ser aisladas y analizadas. Para el agua potable, se debe modificar la preparación de la muestra. Muestras de agua del grifo pueden ser dibujadas de un grifo y plateadas en medios del crecimiento que facilita el crecimiento de colonias bacterianas diversas, heterótrofos. Sobre chapado en un medio como R2A, el proceso es casi idéntico al procedimiento de suelo.
Para ciertas técnicas de identificación bacteriana, los parámetros son dependientes en el tipo de pared celular de las bacterias de interés. En este ejemplo, la sangre de un paciente séptico fue probada y fue encontrada para ser albergar bacterias Gram-positivas.
Con esta información, sondas de ácidos nucleicos péptidos específicos fueron elegidas que se unen a rRNA las células. Estas puntas de prueba fueron obligados a tintes fluorescentes que fueron utilizados para identificar las especies presentes.
Debido a las diferencias fundamentales de estructura celular Gram-positiva y - negativo, bacterias tienen respuestas únicas a otros compuestos además de violeta cristal. Este experimento buscaba aislar Clostridium difficile, una bacteria gram-positiva, de muestras de heces. Cicloserina, que inhibe el crecimiento de las células Gram negativas, se añadió a la placa de agar. Las células Gram positivas que crecieron en la placa fueron más aisladas mediante otros métodos.
Sólo ha visto introducción de JoVE a tinción de Gram para estudios ambientales. Ahora debe comprender los beneficios del proceso y cómo realizar la técnica y utilizar los resultados. ¡Gracias por ver!
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Applications and Summary
La tinción de Gram se utiliza en los muchos subcampos de Microbiología Ambiental y clínica. Los científicos de calidad de agua pueden utilizar la tinción de Gram como herramienta confirmatoria para la detección de coliformes fecales en muestras de agua. Aislamientos bacterianos de suelos son gramo manchado con el fin de caracterizar las comunidades de suelo cultivable. Para microbiólogos ambientales, tinción de Gram SIDA en la categorización de las poblaciones bacterianas según la estructura de la pared celular. Esto, a su vez, proporciona información sobre la capacidad general de una comunidad microbiana dada para resistir la desecación y otros factores de estrés ambientales. Conocimiento de la designación de tinción de Gram es también de importancia en la investigación y desarrollo de desinfectantes y otros antimicrobianos, como bacterias Gram-positivas tienden a ser más resistente a la inactivación por química particular que las bacterias Gram-negativas.
Para las aplicaciones de la microbiología clínica, la tinción de Gram se utiliza para confirmar la identidad de agentes de enfermedades bacteriológicas junto con métodos de diagnóstico tradicionales. También es de gran ayuda cuando el cultivo ha fallado o no es una opción. Tinción de Gram de muestras clínicas puede revelar la presencia de agentes etiológicos que pueden no se han observado lo contrario.
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