Extracción de biomarcadores de sedimentos - acelerado de extracción por solvente

Earth Science
 

Overview

Fuente: Laboratorio de Jeff Salacup - Universidad de Massachusetts Amherst

La distribución de un grupo de biomarcadores orgánicos llamado thioureas glicerol glicerol-tetraethers (GDGTs), producido por un conjunto de arqueas y bacterias, se encontraron en sedimentos modernos para cambiar de manera predecible en respuesta al aire o agua temperatura1.2. Por lo tanto, la distribución de estos biomarcadores en una secuencia de sedimentos de edad conocida puede utilizarse para reconstruir la evolución de la temperatura de aire y agua en plazos decenal a milenario (figura 1). La producción de tiempo alta resolución expedientes de climas pasados, llamados Paleoclimatología, depende de un análisis rápido de cientos, posiblemente miles de muestras. Antiguas técnicas de extracción, como sonicación o Soxhlet, son demasiado lentas. Sin embargo, la técnica de extracción por solvente acelerado más fue diseñada con eficacia en mente.

Figure 1
Figura 1. Un ejemplo de un registro de paleoclima mostrando cambios en la temperatura superficial del mar (SST) en el Mediterráneo Oriental durante los últimos años ~ 27.0003. Este documento consta de ~ 115 muestras y se basa en el isoprenoidal proxy de GDGT basado en TEX86 SST.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Fundamentos de la ciencia de la tierra. Extracción de biomarcadores de sedimentos - acelerado de extracción por solvente. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Principles

Extracción acelerada con disolventes es un método (Thermo Scientific Dionex) marca de extracción que utiliza altas temperaturas (~ 100 ° C) y presiones (~ 1.200 psi) para aumentar la cinética del proceso de extracción. El extractor, llamado acelerado solvente Extractor, o ASE (figura 2), puede contener hasta 24 muestras individuales. Una vez que la ASE es cargar y funcionar, es completamente automático. La ASE permite el control electrónico del proceso de extracción completo: temperatura de extracción, presión, volumen de solvente, mezcla solvente, duración, enjuague y repetición son todo ajustables de muestra a muestra. Laboratorios de geoquímica orgánicos más ahora usan la ASE como el método estándar de extracción por solvente.

Figure 2
Figura 2. Un Extractor solvente acelerado (ASE).

Extracción acelerada de solventes es una técnica rápida, eficaz y de alto rendimiento para separar orgánicas biomarcadores de gran número de muestras de sedimentos geológicos.

Tradicionalmente, se utilizan métodos de extracción de Soxhlet como sonicación, sin embargo, el inconveniente con estos protocolos es que son demasiado lentos para procesar suficiente material para la reconstrucción del paleoclima detallada. Una técnica más nueva, la extracción acelerada de disolvente o ASE método, fue desarrollado con eficiencia y alto rendimiento en mente.

El método ASE utiliza una combinación de altas temperaturas y alta presión para extraer muestras y puede realizar varias muestras en una sola, relativamente rápida preparación ejecutar.

Este video es el tercero de una serie que detalla cómo extraer biomarcadores del sedimento. Cubrirá el procedimiento y proporcionan la penetración en méritos de la ASE por sonicación o extracción de Soxhlet.

En la acelerada extracción de solvente, las muestras se cargan en acero células que luego se cargan en un carrusel. Frascos de colección para cada celda de la muestra también se cargan en un carrusel separado. El instrumento carga una celda de muestra en un horno interno. Solvente se bombea de una botella de solvente a través de una serie de válvulas hasta que se alcanza una presión suficiente.

Esta presión se mantiene durante un período de tiempo de la muestra y el analito. Entonces, el disolvente se purgan de la célula de muestra a través de una línea de acero en el frasco correspondiente. El proceso puede ser repetido varias veces. La temperatura, presión y duración se pueden personalizar para la muestra.

La alta temperatura empleada aumenta la cinética de la extracción mientras que la alta presión impide que volatilicen el solvente. El frasco contiene ahora un extracto de lípidos totales, y lo que queda en la celda de muestra se llama residuo. Se compone de material no orgánico, así como material orgánico que no es solvente extraíble, llamado kerógeno.

Ahora que estamos familiarizados con los principios de extracción acelerada con disolventes, echemos un vistazo a cómo esto se lleva a cabo en el laboratorio.

Después de recoger las muestras de interés; liofilización, homogeneizar y descontaminar como demostrado en otro video de esta serie.

Una vez que todas las muestras se han preparado, armar una celda para cada uno se extrae y uno extra para un espacio en blanco. Para ello, atornille un tapón en el cuerpo de la célula. Usando solventes enjuagados pinzas, coloque un filtro de fibra de vidrio quemado encima de cada uno. Lenta y suavemente presione el filtro con el émbolo.

Los cuerpos celulares por número para cada muestra de la etiqueta y el espacio en blanco de la etiqueta por separado. Lugar una combustión, peso de la lata en una escala de laboratorio y de Tara. Enjuague una espátula con el disolvente, luego use transferencia de 5 a 10 g de muestra a la bandeja de pesaje y registrar la masa.

Transferir todo el material en la bandeja de pesaje a su celda correspondiente. Colocar otro filtro de fibra de vidrio en la parte superior y Apisone suavemente hasta que alcance la parte superior de la muestra.

Agregar un dispersante, como tierra o arena, hasta que esté casi lleno, teniendo cuidado de evitar que cualquier suciedad en las roscas del cuerpo de la célula. Tapa la parte superior de la celda con otra tapa. Repita estos pasos para cada muestra y el blanco.

Etiqueta de cada frasco con el número de una celda de muestra o espacio en blanco correspondiente y la tapa con una tapa de frasco. Coloque cada célula en una ranura numerada en la bandeja superior de la ASE. Definir los parámetros para el método de extracción con el teclado en la ASE para extraer a 100 ° C y 1.200 psi. Extraer cada muestra 3 veces con una espera estática de 10 min y enjuague el cuerpo de la célula con el 50% de su volumen total entre sostiene estática.

A continuación, asegúrese de que la botella de disolvente contiene suficiente para extraer todas las muestras. Enjuague las líneas de instrumento 3 veces antes de comenzar la carrera. Por último, pulse iniciar.

Sacar la cubeta de la ASE. Ahora que los biomarcadores han sido extraídos, deben ser purificados antes de análisis.

Extracción acelerada de solventes es una técnica versátil, que puede ser utilizada para una variedad de aplicaciones, algunas de las cuales son exploradas aquí.

Extracción acelerada con disolventes puede utilizarse también en otros tipos de muestra, incluyendo los alimentos. Análisis de residuos para comprobar la contaminación de plaguicidas con frecuencia se lleva a cabo en instalaciones industriales y reglamentarias para determinar la seguridad y calidad de los productos alimenticios como frutas o verduras. ASE puede utilizarse para extraer pesticidas organoclorados en muestras de alimentos y determinar los tipos o niveles de residuos presentes en los productos. Esta información puede utilizarse entonces para establecer si el producto es apto para consumo humano o animal. Por ejemplo, dieldrín debe encontrarse dentro de 0 a 0.1 partes por millón en alimento, dependiendo del producto.

Los componentes nutricionales del alimento también pueden ser extraídos utilizando ASE. Por ejemplo, se pueden extraer productos como el chocolate, que tenga alto contenido en grasa gravimétrico. Usando ASE con éter de petróleo como solvente, grasa puede ser separada de muestras de chocolate y sometida a análisis cuantitativo para determinar un porcentaje exacto de grasa por una cantidad conocida de chocolate. Con esta información, organismos reguladores pueden verificar afirmaciones hechas por los fabricantes de chocolate, o fabricantes pueden obtener información para crear etiquetas de los alimentos precisos.

Sólo ha visto la introducción de Zeus a la extracción de biomarcadores lípidos mediante extracción acelerada con disolventes o ASE. Métodos para posterior procesamiento y análisis se pueden encontrar en videos posteriores.

¡Gracias por ver!

Procedure

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1. recolección de los materiales necesarios

  1. Extraer muestras. Muestras (en este caso, sedimento) son congeladas, liofilizadas, trituradas, homogeneizadas antes de la extracción y extraídas en grupos para maximizar la eficiencia.
  2. Dependiendo del tamaño de la muestra, utilizar los frascos de colección volúmenes de 40 o 60 mL. Para este experimento, se utilizan frascos de vidrio de borosilicato (40 mL) y casquillos seguros solvente. Quema los frascos, pipetas de vidrio de borosilicato y pesaje latas a 550 ° C por 6 h antes de eliminar los posibles contaminantes orgánicos.
  3. Metanol y diclorometano (DCM) son comunes en los laboratorios de geoquímica orgánicos más. Utilizarlos individualmente, (metanol en primer lugar, seguida de DCM) para enjuagar los instrumentos de laboratorio y cristalería antes de su uso. Una mezcla de diclorometano metanol (MeOH; 9:1) se utiliza en muchos laboratorios para extraer eficientemente biomarcadores con un amplio rango de polaridades. Disolventes deben estar libres de contaminantes orgánicos.
  4. Obtener un Extractor solvente acelerado para este experimento.

2. preparación de muestra de las células

  1. Montar una célula de muestra para cada muestra que se extrae, además de un espacio en blanco.
    1. Para cada celda, atornille un tapón en un extremo del cuerpo celular.
    2. Coloque un filtro de fibra de vidrio quemado encima de cada celda usando pinzas solvente-aclaró. Luego, lentamente y suavemente presione el filtro en la célula utilizando el émbolo del filtro.
    3. Los cuerpos celulares por número (por ejemplo, 1-22) para cada muestra de la etiqueta, escriba "en blanco" en la celda en blanco.
    4. Llene el espacio en blanco con tierra de diatomeas (o arena) y la tapa con un segundo tapón. Apriete a mano.

3. preparación de muestras

  1. Coloque una combustión peso de lata en la escala de laboratorio y Tara.
  2. Enjuague el espátula de laboratorio con solvente, luego utilizar para transferir una masa adecuada de muestra en la bandeja de pesaje y registrar la masa.
    1. La masa de la muestra varía en función de su contenido de materia orgánica. Materia orgánica relativamente magro material (barro marino) puede requerir varios gramos, mientras que el material rico de materia orgánica (tejido foliar) puede requerir mucho menos.
  3. Transferir todo el material en la bandeja de pesaje en una celda preparada de ASE.
  4. Coloque otro filtro de fibra de vidrio en la parte superior de la celda, luego lentamente y suavemente presione hacia abajo hasta llegar a la parte superior de la muestra utilizando el émbolo del filtro.
  5. Añadir tierra de diatomeas (o arena) a la celda hasta que esté casi lleno. Tenga cuidado quitar cualquier residuo de la rosca del cuerpo de la célula.
  6. Tapa la parte superior de la celda con otra tapa.
  7. Repita los pasos 3.1-3.6 para cada muestra.

4. preparación de los frascos de colección de

  1. Etiqueta de cada frasco con el número de un celular correspondiente (por ejemplo, 1-22 o en blanco) y la tapa con tapa de frasco de colección de ASE.

5. extracción

  1. Coloque cada celda muestra una ranura numerada en la bandeja superior de la ASE.
  2. Coloque el frasco correspondiente en la misma ranura número de la bandeja inferior de ASE.
  3. Crear el método de extracción con el teclado en la ASE. Extracto a 100 ° C y 1.200 psi. Extracto de cada muestra x 3 con un control estático de 10 min y lave el cuerpo de la célula con el 50% de su volumen total entre sostiene estática.
  4. Asegúrese de que la botella de disolvente contiene suficiente solvente para extraer todas las muestras.
  5. Enjuague la ASE 3 x antes de iniciar la ejecución pulsando el botón "aclarar" en el cojín del control de ASE.
  6. Presione start.

Results

Al final de la extracción, hay un extracto total de lípidos (TLE) para cada muestra. Cada vial contiene ahora la extraíble materia orgánica de un sedimento, suelo o tejido vegetal. Estos TLEs pueden ser analizados, y sus componentes químicos identifican y cuantificaron.

Applications and Summary

TLEs de las muestras extraídas contienen un amplio espectro de diferentes compuestos orgánicos, incluyendo el GDGTs para ser utilizado para reconstruir las temperaturas antiguas. Thioureas glicerol glicerol-tetraethers son un gran conjunto de biomarcadores que muestran sensibilidad a las temperaturas de crecimiento. Hay dos grupos de GDGTs, ramificados e Isoprenoide, que se diferencian en el carácter de los patrones de ramificación en los grupos alkyl ()figura 3). En el océano, un grupo cosmopolitano de archaea, llamado Thaumarchaeota, producen isoprenoidal GDGTs4. GDGTs ramificados se producen en la tierra en suelos5, lagos y en el lago sedimentos6 por bacterias aún no identificados, probablemente Acidobacteria7. Archaea y bacteria ajusta el número de ramas de metilo y estructuras de anillo en el grupo Alquilo según temperatura de crecimiento, y porque GDGTs son estables en los sedimentos durante millones de años, registros de tiempo de alta resolución del cambio climático son generados utilizando.

El proxy de temperatura de agua de TEX86 paleo se basa en la relación de cierto isoprenoidal GDGTs, cada uno que contiene 86 átomos de carbono en su núcleo de alkyl (figura 3):

TEX86 = (GDGT-2 + 3 de GDGT GDGT-4') /
(GDGT-1 + GDGT-2 + 3 DE GDGT GDGT-4')

Temperatura del agua de paleo se infiere entonces mediante una calibración, como la ecuación original:

TEX86 = 0.015T + 0.28 (R2 = 0.92)

Propuesto por Schouten et al. 1, donde T es paleotemperature. Varias otras calibraciones locales y regionales se han desarrollado para perfeccionar al proxy para el uso en grandes lagos o en los trópicos, por ejemplo.

Figure 3
Figura 3. Estructuras químicas de isoprenoidal y ramificados GDGTs. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

References

  1. Schouten, S. et al. Distributional variations in marine crenarchaeotal membrane lipids: a new tool for reconstructing ancient sea water temperatures?, Earth and Planetary Science Letters204(1-2), 265-274 (2002).
  2. Weijers, J. W. H. et al. Environmental controls on bacterial tetraether membrane lipid distribution in soils, Geochimica et Cosmochimica Acta71(3), 703-713 (2007).
  3. Castaneda, I. S. et al. Millennial-scale sea surface temperature changes in the eastern Mediterranean (Nile River Delta region) over the last 27,000 years, Paleoceanography, 25, 13 (2010).
  4. Damste, J. S. S. et al. Crenarchaeol: the characteristic core glycerol dibiphytanyl glycerol tetraether membrane lipid of cosmopolitan pelagic crenarchaeota, J Lipid Res, 43(10), 1641-1651 (2002).
  5. Hopmans, E. C. et al. A novel proxy for terrestrial organic matter in sediments based on branched and isoprenoid tetraether lipids, Earth and Planetary Science Letters224(1-2), 107-116 (2004).
  6. Tierney, J. E., Russell J. M. Distributions of branched GDGTs in a tropical lake system: Implications for lacustrine application of the MBT/CBT paleoproxy, Organic Geochemistry40(9), 1032-1036 (2009).
  7. Damste, J. S. S. et al. 13,16-Dimethyl Octacosanedioic Acid (iso-Diabolic Acid), a Common Membrane-Spanning Lipid of Acidobacteria Subdivisions 1 and 3, Appl Environ Microb, 77(12), 4147-4154 (2011).
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1. recolección de los materiales necesarios

  1. Extraer muestras. Muestras (en este caso, sedimento) son congeladas, liofilizadas, trituradas, homogeneizadas antes de la extracción y extraídas en grupos para maximizar la eficiencia.
  2. Dependiendo del tamaño de la muestra, utilizar los frascos de colección volúmenes de 40 o 60 mL. Para este experimento, se utilizan frascos de vidrio de borosilicato (40 mL) y casquillos seguros solvente. Quema los frascos, pipetas de vidrio de borosilicato y pesaje latas a 550 ° C por 6 h antes de eliminar los posibles contaminantes orgánicos.
  3. Metanol y diclorometano (DCM) son comunes en los laboratorios de geoquímica orgánicos más. Utilizarlos individualmente, (metanol en primer lugar, seguida de DCM) para enjuagar los instrumentos de laboratorio y cristalería antes de su uso. Una mezcla de diclorometano metanol (MeOH; 9:1) se utiliza en muchos laboratorios para extraer eficientemente biomarcadores con un amplio rango de polaridades. Disolventes deben estar libres de contaminantes orgánicos.
  4. Obtener un Extractor solvente acelerado para este experimento.

2. preparación de muestra de las células

  1. Montar una célula de muestra para cada muestra que se extrae, además de un espacio en blanco.
    1. Para cada celda, atornille un tapón en un extremo del cuerpo celular.
    2. Coloque un filtro de fibra de vidrio quemado encima de cada celda usando pinzas solvente-aclaró. Luego, lentamente y suavemente presione el filtro en la célula utilizando el émbolo del filtro.
    3. Los cuerpos celulares por número (por ejemplo, 1-22) para cada muestra de la etiqueta, escriba "en blanco" en la celda en blanco.
    4. Llene el espacio en blanco con tierra de diatomeas (o arena) y la tapa con un segundo tapón. Apriete a mano.

3. preparación de muestras

  1. Coloque una combustión peso de lata en la escala de laboratorio y Tara.
  2. Enjuague el espátula de laboratorio con solvente, luego utilizar para transferir una masa adecuada de muestra en la bandeja de pesaje y registrar la masa.
    1. La masa de la muestra varía en función de su contenido de materia orgánica. Materia orgánica relativamente magro material (barro marino) puede requerir varios gramos, mientras que el material rico de materia orgánica (tejido foliar) puede requerir mucho menos.
  3. Transferir todo el material en la bandeja de pesaje en una celda preparada de ASE.
  4. Coloque otro filtro de fibra de vidrio en la parte superior de la celda, luego lentamente y suavemente presione hacia abajo hasta llegar a la parte superior de la muestra utilizando el émbolo del filtro.
  5. Añadir tierra de diatomeas (o arena) a la celda hasta que esté casi lleno. Tenga cuidado quitar cualquier residuo de la rosca del cuerpo de la célula.
  6. Tapa la parte superior de la celda con otra tapa.
  7. Repita los pasos 3.1-3.6 para cada muestra.

4. preparación de los frascos de colección de

  1. Etiqueta de cada frasco con el número de un celular correspondiente (por ejemplo, 1-22 o en blanco) y la tapa con tapa de frasco de colección de ASE.

5. extracción

  1. Coloque cada celda muestra una ranura numerada en la bandeja superior de la ASE.
  2. Coloque el frasco correspondiente en la misma ranura número de la bandeja inferior de ASE.
  3. Crear el método de extracción con el teclado en la ASE. Extracto a 100 ° C y 1.200 psi. Extracto de cada muestra x 3 con un control estático de 10 min y lave el cuerpo de la célula con el 50% de su volumen total entre sostiene estática.
  4. Asegúrese de que la botella de disolvente contiene suficiente solvente para extraer todas las muestras.
  5. Enjuague la ASE 3 x antes de iniciar la ejecución pulsando el botón "aclarar" en el cojín del control de ASE.
  6. Presione start.

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