Extraktion von Biomarkern aus Sedimenten - beschleunigte Lösemittelextraktion

Earth Science
 

Overview

Quelle: Labor von Jeff Salacup - University of Massachusetts Amherst

Die Verteilung von einer Gruppe von organischen Biomarker genannt Glycerin-Dialkylcarbonat Glycerin-Tetraethers (GDGTs), produziert von einer Suite von Archaeen und Bakterien, fanden sich in modernen Sedimenten zu ändern in einer vorhersagbaren Weise als Reaktion auf Luft oder Wasser Temperatur1,2. Daher kann die Verteilung dieser Biomarker in einer Abfolge von Sedimenten des bekannten Alters verwendet werden, um die Entwicklung der Luft und/oder Wasser Temperatur, tausendjährigen dekadische Fristen (Abbildung 1) zu rekonstruieren. Die Produktion von langen hochauflösende Aufzeichnungen der vergangenen Klimas, Paläoklimatologie, genannt hängt die schnelle Analyse von Hunderte, möglicherweise Tausende von Proben. Ältere Extraktionstechniken, wie Beschallung oder Soxhlet, sind zu langsam. Jedoch wurde die neuere Technik beschleunigt Solvent Extraction mit Effizienz im Verstand entworfen.

Figure 1
Abbildung 1: Ein Beispiel für eine Paläoklima-Eintrag zeigen Veränderungen in der Meeresoberflächentemperatur (SST) im östlichen Mittelmeer in den vergangenen Jahren ~ 27.0003. Dieser Datensatz besteht aus ~ 115 Proben und basiert auf der isoprenoider GDGT basierende TEX86 SST Proxy.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Earth Science. Extraktion von Biomarkern aus Sedimenten - beschleunigte Lösemittelextraktion. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Principles

Beschleunigte Lösemittelextraktion ist eine geschützte (Thermo Scientific Dionex) Methode der Extraktion, die hohen Temperaturen (~ 100 ° C) und Druck (~ 1.200 Psi) erhöhen die Kinetik der Extraktion verwendet. Die Extraktor, genannt eine beschleunigte Lösungsmittel Extractor oder ASE (Abbildung 2), kann bis zu 24 einzelne Samples aufnehmen. Sobald die ASE geladen und ausgeführt, ist es vollständig automatisiert. Die ASE ermöglicht die elektronische Steuerung der gesamten Extraktion: Extraktionstemperatur, Druck, Lösemittel Volumen, Lösungsmittelgemisch, Dauer, spülen und Wiederholung sind alle einstellbar von Probe zu Probe. Die meisten organischen Geochemie Labors verwenden jetzt die ASE als die standard-Methode der solvent-Extraktion.

Figure 2
Abbildung 2. Eine beschleunigte Lösungsmittel Extractor (ASE).

Beschleunigte Lösemittelextraktion ist eine schnelle, effiziente und Hochdurchsatz-Technik verwendet, um organische Biomarker von zahlreicher geologischer Sedimentproben zu trennen.

Traditionell werden Methoden wie Ultraschall oder Soxhlet Extraktion verwendet, der Nachteil bei dieser Protokolle ist jedoch, dass sie zu langsam, um genügend Material für detaillierte Paläoklima Wiederaufbau zu verarbeiten sind. Eine neuere Technik, die beschleunigte Solvent Extraction oder ASE Methode entwickelte sich mit Effizienz und hohem Durchsatz im Auge.

Die ASE-Methode verwendet eine Kombination aus hohen Temperaturen und hohem Druck um Muster zu extrahieren und kann mehrere Proben in einem einzigen durchführen, relativ schnelle Vorbereitung laufen.

Dieses Video ist das dritte in einer Reihe wie zum Extrahieren von Biomarkern aus Sediment Detaillierung. Es wird das Verfahren zu decken und Einblick in die Vorzüge der ASE über Beschallung oder Soxhlet-Extraktion.

In beschleunigte Lösemittelextraktion werden Proben in Stahl Zellen geladen, die dann auf einem Karussell geladen sind. Sammlung-Fläschchen für jede Sample-Zelle sind auch auf einem separaten Karussell geladen. Das Gerät lädt eine Sample-Zelle in einen internen Ofen. Lösungsmittel aus einem Lösungsmittel Flasche durch eine Reihe von Ventilen gepumpt, bis ein ausreichender Druck erreicht ist.

Dieser Druck ist für eine lange Zeit diktiert durch die Probe und Analyten statt. Dann wird das Lösungsmittel aus der Probenzelle durch eine Linie Stahl in den entsprechenden Sammelbehälter geleert. Der Prozess kann einige Male wiederholt. Temperatur, Druck und Dauer können alle für das Beispiel angepasst werden.

Die Hochtemperatur verwendet erhöht die Kinetik der Extraktion der hohe Druck des Lösungsmittels volatizing abhält. Der Sammelbehälter enthält jetzt einen total Lipid-Extrakt, und was übrig bleibt in der Sample-Zelle nennt man einen Rückstand. Es umfasst anorganische Material sowie organisches Material, das nicht Lösungsmittel extrahierbaren Kerogen genannt.

Jetzt, dass wir die Prinzipien hinter beschleunigte Lösemittelextraktion kennen, werfen wir einen Blick auf wie dies im Labor durchgeführt wird.

Nach dem sammeln Proben von Interesse; Gefriertrocknen, Homogenisieren und wie in einem anderen Video in dieser Serie zu dekontaminieren.

Sobald alle Proben vorbereitet haben, montieren Sie eine Zelle jeweils extrahiert werden, und eine extra für eine leere. Schrauben Sie hierzu eine Endkappe auf den Zellkörper. Legen Sie einer Pinzette Lösungsmittel gespült, einen verbrannt Glasfaser Filter oben auf jeder. Drücken Sie langsam und sanft den Filter mit den Kolben.

Beschriften Sie die Zellkörper von Nummer für jede Probe, und beschriften Sie den Rohling separat. Legen Sie ein mit einem Gewicht von Zinn auf einem Labor-Maßstab und Tara verbrannt. Spülen Sie einen Spachtel mit Lösungsmittel, dann verwenden Sie, um 5 bis 10 g der Probe auf der Waage Zinn zu übertragen und zeichnen Sie die Masse auf.

Das gesamte Material mit einem Gewicht von Zinn auf die entsprechende Zelle zu übertragen. Legen Sie ein weiteres Glasfaser Filter oben, und Stampfen Sie sanft zu, bis es die Spitze der Stichprobe erreicht.

Fügen Sie ein Dispergiermittel, z. B. Kieselgur oder Sand, bis fast voll, dabei darauf achten, vermeiden, dass Fremdkörper in die Zellkörper Gewinde ist. Kappe am oberen Rand der Zelle mit einem anderen Endkappe. Wiederholen Sie diese Schritte für jede Probe und den Rohling.

Jede Kollektion mit der Nummer eines entsprechenden Sample-Zelle oder leer Label und Kappe mit einem Fläschchen Kappe. Legen Sie jede Zelle in einer nummerierten Slot auf dem oberen ASE-Tablett. Legen Sie die Parameter für die Extraktionsmethode mit Hilfe der Tastatur auf die ASE bei 100 ° C und 1.200 Psi zu extrahieren. Extrahieren Sie jede Probe 3 Mal mit eine statische Position von 10 min zu und spülen Sie der Zellkörper mit 50 % der Gesamtmenge zwischen statische hält.

Als Nächstes sicher, dass die Lösungsmittel Flasche genug enthält, um alle Beispiele zu extrahieren. Spülen Sie die Instrument Linien 3 Mal vor dem Start des Laufs. Schließlich drücken Sie Start.

Entfernen Sie das Fläschchen aus der ASE. Nun, da die Biomarker extrahiert haben, müssen sie vor der Analyse gereinigt werden.

Beschleunigte Solvent Extraction ist eine vielseitige Technik, die für eine Vielzahl von Anwendungen genutzt werden können, von denen einige hier erkundet werden.

Beschleunigte Lösemittelextraktion kann auch auf andere Arten von Proben, einschließlich Nahrung verwendet werden. Rückstandsanalytik Pestizidbelastung testen erfolgt häufig in behördlichen und industriellen Anlagen zu prüfen, die Sicherheit und Qualität von Lebensmitteln wie Obst oder Gemüse. ASE kann verwendet werden, organische Pestizide von Lebensmittelproben extrahieren, und bestimmen die Typen oder Ebenen von Rückständen in den Produkten vorhanden. Diese Informationen können dann verwendet werden, um festzustellen, ob Produkte für menschlichen oder tierischen Verzehr geeignet ist. Zum Beispiel sollten Dieldrin innerhalb 0 bis 0,1 Teile pro million für Nahrungsmittel, je nach Produkt gefunden werden.

Lebensmittel-Ernährungs-Komponenten können auch mit ASE extrahiert werden. Zum Beispiel können Produkte wie Schokolade, die gravimetrische fettreichen Inhalt haben können, extrahiert werden. Mit ASE mit Petrolether als Lösungsmittel, werden Fett von Schokolade Proben getrennt und Quantitative Analyse zu bestimmen, einen genaue Fettgehalt pro bekannte Menge Schokolade unterzogen. Mithilfe dieser Informationen Aufsichtsbehörden können Ansprüche Schokolade Hersteller überprüfen, oder Hersteller erhalten Informationen zum genauen Lebensmittel-Etiketten zu erstellen.

Sie habe nur Jupiters Einführung in die Gewinnung von Lipid-Biomarker mit beschleunigten solvent-Extraktion oder ASE beobachtet. Methoden zur Weiterverarbeitung und Auswertung finden Sie im nachfolgenden Videos.

Danke fürs Zuschauen!

Procedure

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1. Erhebung der notwendigen Materialien

  1. Proben zu extrahieren. Proben (in diesem Fall, Sediment) sind eingefroren, gefriergetrocknet, zerkleinert, und vor der Extraktion homogenisiert und in Gruppen, um die Effizienz zu maximieren extrahiert.
  2. Abhängig von der Größe der Stichprobe Sammlung Fläschchen mit einem Volumen von 40 oder 60 mL verwendet. Für dieses Experiment Borosilikat Glasvials (40 mL) und Lösungsmittel sicher Kappen verwendet. Verbrennen Vials, Borosilikatglas Pipetten und mit einem Gewicht von Dosen bei 550 ° C 6 h vor der Beseitigung der möglichen organischen Verunreinigungen zu gewährleisten.
  3. Dichlormethan (DCM) und Methanol sind häufig in den meisten organischen Geochemie Laboratorien. Einzeln zu verwenden, (Methanol zuerst, gefolgt von DCM) Labor-Tools und Glaswaren vor Gebrauch abspülen. Eine Mischung von Dichlormethan, Methanol (MeOH; 9:1) ist in vielen Labors verwendet, um effizient Biomarker mit einer breiten Palette von Polaritäten zu extrahieren. Lösungsmittel sollte frei von organischen Verunreinigungen sein.
  4. Erhalten Sie eine beschleunigte Lösungsmittel Extraktor für dieses Experiment zu verwenden.

2. Vorbereitung des Sample-Zellen

  1. Montieren Sie eine Sample-Zelle für jede Probe extrahiert werden, plus ein Leerzeichen.
    1. Schrauben Sie für jede Zelle eine Endkappe auf ein Ende der Zellkörper.
    2. Legen Sie einen verbrannt-Glas-Faser-Filter auf jede Zelle mit einer Pinzette Lösungsmittel gespült. Dann, langsam und vorsichtig den Filter nach unten drücken in die Zelle mit der Filter-Kolben.
    3. Beschriften Sie die Zellkörper von Nummer (z.B. 1-22) für jede Probe und schreiben Sie "leer" auf die leere Zelle.
    4. Füllen Sie die Lücke mit Kieselgur (oder Sand) und Kappe mit einem zweiten Endkappe. Handfest anziehen.

3. Vorbereitung der Proben

  1. Legen Sie ein mit einem Gewicht von Zinn auf den Labormaßstab und dann Tara verbrannt.
  2. Spülen Sie die Labor-Spachtel mit Lösungsmittel, dann verwenden Sie, um eine entsprechende Masse der Probe in das mit einem Gewicht von Zinn zu übertragen, und zeichnen Sie die Masse.
    1. Die Masse der Probe variiert je nach seinen Gehalt an organischer Substanz. Schlanke Material relativ organischer Substanz (marine Schlamm) erfordern mehrere Gramm, während organische Substanz Reiches Material (Blattgewebe) viel weniger erfordern.
  3. Übertragen Sie das gesamte Material in der Waage Dose in eine vorbereitete ASE Zelle.
  4. Legen Sie ein weiteres Glasfaser Filter auf den oberen Teil der Zelle, dann drücken Sie langsam und sanft nach unten, bis es erreicht die Spitze der Stichprobe mit der Filter-Kolben.
  5. Hinzufügen von Kieselgur (oder Sand) für die Zelle, bis es fast voll ist. Achten Sie darauf, um jeglichen Schmutz aus den Zellkörper Threads zu entfernen.
  6. Kappe am oberen Rand der Zelle mit einem anderen Endkappe.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.6 für jede Probe.

4. Vorbereitung der Sammlung Fläschchen

  1. Beschriften Sie jedes Fläschchen mit der Nummer eines entsprechenden Zelle (z. B. 1-22 oder leer) und Kappe mit ASE Sammlung Fläschchen Kappe.

(5) Extraktion

  1. Platzieren Sie jedes Sample-Zelle in einen nummerierten Steckplatz auf dem oberen ASE-Tablett.
  2. Legen Sie den entsprechenden Sammelbehälter in der gleichen Nummer Steckplatz auf dem unteren ASE-Tablett.
  3. Erstellen der Extraktionsmethode mit Hilfe der Tastatur auf die ASE. Bei 100 ° C und 1.200 Psi zu extrahieren. Extrakt probieren jeweils 3 X mit ein statisches Halten von 10 min und spülen die Zellkörper mit 50 % der Gesamtmenge zwischen statische hält.
  4. Sicherstellen Sie, dass die Lösungsmittel Flasche enthält genügend Lösungsmittel um alle Beispiele zu extrahieren.
  5. Spülen Sie die ASE 3 X vor dem Start des Laufs durch Drücken der Taste "Spülen" auf dem Steuerkreuz ASE.
  6. Drücken Sie Start.

Results

Am Ende der Extraktion ist ein total Lipid-Extrakt (TLE) für jede Probe. Jede Durchstechflasche enthält nun die extrahierbare organische Substanz vom Sediment, Boden oder Pflanzengewebe. Diese TLEs analysiert werden können, und ihre chemischen Bestandteile identifiziert und quantifiziert.

Applications and Summary

Die TLEs der entnommenen Proben enthalten ein breites Spektrum von verschiedenen organischen Verbindungen, einschließlich die GDGTs verwendet werden, um alten Temperaturen zu rekonstruieren. Glycerin-Dialkylcarbonat Glycerin-Tetraethers sind eine große Suite von Biomarkern, die Sensibilität für Wachstum Temperaturen zeigen. Es gibt zwei Gruppen von GDGTs, verzweigt und Nahrung, die sich in den Charakter der Verzweigung Muster auf die Core-Alkyl-Gruppen ()Abbildung 3unterscheiden). Im Ozean eine kosmopolitische Gruppe von Archaeen, genannt Thaumarchaeota, produzieren isoprenoider GDGTs4. Verzweigte GDGTs werden auf dem Land in Böden5Seen, und im See Sedimente6 von noch nicht identifizierten Bakterien, wahrscheinlich Acidobacteria7produziert. Archaeen und Bakterien passen Sie die Anzahl der Methyl-Verzweigungen und Ring-Strukturen in der Kerngruppe Alkyl Wachstum temperaturabhängig, und weil GDGTs für Millionen von Jahren beständig in Sedimenten sind, entstehen lange hochauflösende Aufzeichnungen des Klimawandels einzusetzen.

TEX86 Paleo Wasser Temperatur Proxy basiert auf dem Verhältnis von bestimmten isoprenoider GDGTs, jeweils 86 Kohlenstoff-Atome in der Kerngruppe Alkyl (Abbildung 3):

TEX-86 = (GDGT-2 + GDGT-3 + GDGT-4 ") /
(GDGT-1, GDGT-2, GDGT-3 + GDGT-4 ")

Paleo-Wassertemperatur wird dann geschlossen mit einer Kalibrierung, wie die ursprüngliche Gleichung:

TEX-86 = 0.015T + 0.28 (R2 = 0,92)

Vorgeschlagen von Schouten Et al. 1, wo T Paleotemperature ist. Mehrere andere regionalen und lokalen Kalibrierungen sind entwickelt worden, um den Proxy für den Einsatz in großen Seen oder in den Tropen, zum Beispiel zu verfeinern.

Figure 3
Abbildung 3. Chemische Strukturen von isoprenoider und verzweigten GDGTs. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

References

  1. Schouten, S. et al. Distributional variations in marine crenarchaeotal membrane lipids: a new tool for reconstructing ancient sea water temperatures?, Earth and Planetary Science Letters204(1-2), 265-274 (2002).
  2. Weijers, J. W. H. et al. Environmental controls on bacterial tetraether membrane lipid distribution in soils, Geochimica et Cosmochimica Acta71(3), 703-713 (2007).
  3. Castaneda, I. S. et al. Millennial-scale sea surface temperature changes in the eastern Mediterranean (Nile River Delta region) over the last 27,000 years, Paleoceanography, 25, 13 (2010).
  4. Damste, J. S. S. et al. Crenarchaeol: the characteristic core glycerol dibiphytanyl glycerol tetraether membrane lipid of cosmopolitan pelagic crenarchaeota, J Lipid Res, 43(10), 1641-1651 (2002).
  5. Hopmans, E. C. et al. A novel proxy for terrestrial organic matter in sediments based on branched and isoprenoid tetraether lipids, Earth and Planetary Science Letters224(1-2), 107-116 (2004).
  6. Tierney, J. E., Russell J. M. Distributions of branched GDGTs in a tropical lake system: Implications for lacustrine application of the MBT/CBT paleoproxy, Organic Geochemistry40(9), 1032-1036 (2009).
  7. Damste, J. S. S. et al. 13,16-Dimethyl Octacosanedioic Acid (iso-Diabolic Acid), a Common Membrane-Spanning Lipid of Acidobacteria Subdivisions 1 and 3, Appl Environ Microb, 77(12), 4147-4154 (2011).
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1. Erhebung der notwendigen Materialien

  1. Proben zu extrahieren. Proben (in diesem Fall, Sediment) sind eingefroren, gefriergetrocknet, zerkleinert, und vor der Extraktion homogenisiert und in Gruppen, um die Effizienz zu maximieren extrahiert.
  2. Abhängig von der Größe der Stichprobe Sammlung Fläschchen mit einem Volumen von 40 oder 60 mL verwendet. Für dieses Experiment Borosilikat Glasvials (40 mL) und Lösungsmittel sicher Kappen verwendet. Verbrennen Vials, Borosilikatglas Pipetten und mit einem Gewicht von Dosen bei 550 ° C 6 h vor der Beseitigung der möglichen organischen Verunreinigungen zu gewährleisten.
  3. Dichlormethan (DCM) und Methanol sind häufig in den meisten organischen Geochemie Laboratorien. Einzeln zu verwenden, (Methanol zuerst, gefolgt von DCM) Labor-Tools und Glaswaren vor Gebrauch abspülen. Eine Mischung von Dichlormethan, Methanol (MeOH; 9:1) ist in vielen Labors verwendet, um effizient Biomarker mit einer breiten Palette von Polaritäten zu extrahieren. Lösungsmittel sollte frei von organischen Verunreinigungen sein.
  4. Erhalten Sie eine beschleunigte Lösungsmittel Extraktor für dieses Experiment zu verwenden.

2. Vorbereitung des Sample-Zellen

  1. Montieren Sie eine Sample-Zelle für jede Probe extrahiert werden, plus ein Leerzeichen.
    1. Schrauben Sie für jede Zelle eine Endkappe auf ein Ende der Zellkörper.
    2. Legen Sie einen verbrannt-Glas-Faser-Filter auf jede Zelle mit einer Pinzette Lösungsmittel gespült. Dann, langsam und vorsichtig den Filter nach unten drücken in die Zelle mit der Filter-Kolben.
    3. Beschriften Sie die Zellkörper von Nummer (z.B. 1-22) für jede Probe und schreiben Sie "leer" auf die leere Zelle.
    4. Füllen Sie die Lücke mit Kieselgur (oder Sand) und Kappe mit einem zweiten Endkappe. Handfest anziehen.

3. Vorbereitung der Proben

  1. Legen Sie ein mit einem Gewicht von Zinn auf den Labormaßstab und dann Tara verbrannt.
  2. Spülen Sie die Labor-Spachtel mit Lösungsmittel, dann verwenden Sie, um eine entsprechende Masse der Probe in das mit einem Gewicht von Zinn zu übertragen, und zeichnen Sie die Masse.
    1. Die Masse der Probe variiert je nach seinen Gehalt an organischer Substanz. Schlanke Material relativ organischer Substanz (marine Schlamm) erfordern mehrere Gramm, während organische Substanz Reiches Material (Blattgewebe) viel weniger erfordern.
  3. Übertragen Sie das gesamte Material in der Waage Dose in eine vorbereitete ASE Zelle.
  4. Legen Sie ein weiteres Glasfaser Filter auf den oberen Teil der Zelle, dann drücken Sie langsam und sanft nach unten, bis es erreicht die Spitze der Stichprobe mit der Filter-Kolben.
  5. Hinzufügen von Kieselgur (oder Sand) für die Zelle, bis es fast voll ist. Achten Sie darauf, um jeglichen Schmutz aus den Zellkörper Threads zu entfernen.
  6. Kappe am oberen Rand der Zelle mit einem anderen Endkappe.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.6 für jede Probe.

4. Vorbereitung der Sammlung Fläschchen

  1. Beschriften Sie jedes Fläschchen mit der Nummer eines entsprechenden Zelle (z. B. 1-22 oder leer) und Kappe mit ASE Sammlung Fläschchen Kappe.

(5) Extraktion

  1. Platzieren Sie jedes Sample-Zelle in einen nummerierten Steckplatz auf dem oberen ASE-Tablett.
  2. Legen Sie den entsprechenden Sammelbehälter in der gleichen Nummer Steckplatz auf dem unteren ASE-Tablett.
  3. Erstellen der Extraktionsmethode mit Hilfe der Tastatur auf die ASE. Bei 100 ° C und 1.200 Psi zu extrahieren. Extrakt probieren jeweils 3 X mit ein statisches Halten von 10 min und spülen die Zellkörper mit 50 % der Gesamtmenge zwischen statische hält.
  4. Sicherstellen Sie, dass die Lösungsmittel Flasche enthält genügend Lösungsmittel um alle Beispiele zu extrahieren.
  5. Spülen Sie die ASE 3 X vor dem Start des Laufs durch Drücken der Taste "Spülen" auf dem Steuerkreuz ASE.
  6. Drücken Sie Start.

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