Overview
Fuente: Laboratorios del Dr. Ian Pepper y el Dr. Charles Gerba - Universidad de Arizona
Autores que demuestran: Bradley Schmitz y Luisa Ikner
Superficie de suelos es una mezcla heterogénea de partículas orgánicas e inorgánicas que se combinan juntos para formar agregados secundarios. Dentro y entre los agregados están vacíos o poros que visualmente contienen aire y agua. Estas condiciones crean un ecosistema ideal para las bacterias, todos los suelos contienen grandes poblaciones de bacterias, generalmente sobre 1 millón por gramo de suelo.
Las bacterias son los más simples de los microorganismos, conocidos como procariotas. Dentro de este grupo de procariota, existen los microbios filamentos conocidos como actinomicetos. Actinomicetos son realmente bacterias, pero con frecuencia se consideran ser un grupo único dentro de la clasificación de las bacterias debido a su estructura filamentosa, que consta de varias celdas ensartados a hifas de forma. Este experimento utiliza glicerol caso medios de comunicación que seleccionen para las colonias actinomycete, durante la dilución y chapado. Típicamente, los actinomicetos son aproximadamente el 10% de la población bacteriana total. Las bacterias y los actinomicetos se encuentran en cada ambiente de la tierra, pero la abundancia y diversidad de estos microbios en el suelo es incomparable. Estos microbios son también esenciales para la vida humana y afectan lo que la gente come, bebe, respira o toca. Además, hay especies bacterianas que pueden infectar a personas y causar enfermedad, y hay bacterias que pueden producir productos naturales capaces de curar personas. Actinomicetos son particularmente importantes para la producción de antibióticos como la estreptomicina. Las bacterias son críticas para el ciclismo, crecimiento vegetal y degradación de contaminantes orgánicos nutrientes.
Las bacterias son muy diversas en cuanto al número de especies que se pueden encontrar en el suelo, en parte porque están fisiológicamente y metabólicamente diversas. Las bacterias pueden ser heterótrofos, lo que significa que utilizan compuestos orgánicos como la glucosa, de alimentos y energía, o autótrofos, lo que significa que utilizan compuestos inorgánicos, como el azufre elemental, de alimentos y energía. También pueden ser aeróbicas, utilizando oxígeno para la respiración, o anaerobia, utilizando combinado formas de oxígeno, tales como nitrato o sulfato, que respira. Algunas bacterias pueden utilizar el oxígeno o combinan formas de oxígeno y se conocen como anaerobios facultativos.
Principles
Una forma de enumerar el número de bacterias presentes en una muestra de suelo es utilizar la dilución y la metodología de la galjanoplastia. Esta metodología utiliza agar como medio de crecimiento bacteriano, un proceso denominado "tecnología cultivable". Debido al gran número de bacterias que se encuentran en suelos, una pequeña muestra de suelo en serie se diluye en agua, antes de ser plateado en agar en una placa de Petri. Por lo general, una pequeña cantidad de suelo dentro de 0.1 a 1 mL de la suspensión de suelo diluido es "spread" sobre la superficie de la placa de agar. Las placas contienen agar, que es cuando fundido caliente, pero sólida cuando se enfríe. Además el agar, nutrientes, tales como levadura peptona o un producto comercialmente disponible como R2A, se añaden al medio para permitir el crecimiento de bacterias heterotróficas.
Dilución y galjanoplastia es una tecnología relativamente simple y barata para la enumeración de bacterias del suelo. Sin embargo, hay varios inconvenientes a la técnica. Algunos errores comunes y supuestos asociados a los análisis de dilución y galjanoplastia son las siguientes: se supone que cada bacteria del suelo solo da lugar a una colonia, pero en realidad una colonia puede surgir de un grupo de células, resultando en una subestimación de la verdadera cuenta cultivable. Durante la dilución seriada del suelo, las partículas del suelo pueden se sedimentan (caída a la parte inferior), por lo que la alícuota real de suelo no se pasa la siguiente dilución. Muchos microbios del suelo son viables pero no cultivables. Bacterias de crecimiento lento pueden resultar no en colonias visibles en un plazo razonable (1-2 semanas).
También, las bacterias anaerobias no crecen en condiciones aerobias y bacterias que crecen son seleccionadas para por los nutrientes añadidos al medio. Por lo tanto R2A selecciona para bacterias heterotróficas, mientras selecciona a azufre elemental para oxidantes de azufre autótrofos. En general, se estima que sólo el 0,1 a 1% de todas las bacterias del suelo pueden ser cultivado. Por lo tanto, la dilución y chapado de suelo bacterias sólo representa las bacterias cultivables y subestima la población de cierto suelo viable por una o dos órdenes de magnitud. En la figura 1se muestra un ejemplo de colonias de bacterias heterotróficas que resultó de la galjanoplastia y la dilución de suelo. Tenga en cuenta que aproximadamente 1 millón de células bacterianas se necesitan para que una colonia a ser visible a simple vista.
Este experimento demuestra la dilución y la metodología utilizada para enumerar el número de bacterias en una muestra de suelo de la galjanoplastia de la propagación. En concreto, se utilizan dos medios: uno diseñado para todas las bacterias y el otro que selecciona para actinomicetos. Una vez que las colonias bacterianas han crecido en las placas de agar, aislar los cultivos puros de colonias seleccionadas usando una técnica de placa de racha. Tales cultivos puros se pueden más analizados y caracterizados por las funciones y características específicas.
Figura 1. Colonias heterotróficas en un R2una placa de agar. Surgen una serie de discretas colonias con morfología diversa después de dilución y chapado de suelo. Permiso de uso otorgado por Academic Press.
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Procedure
1. preparación de diluciones de suelo
- Para comenzar el procedimiento, pesar 10 g de muestra de suelo y añadir a 95 mL de agua desionizada. Agite bien la suspensión y la etiqueta como "A".
- Antes de que el suelo se instala, extraiga 1 mL de la suspensión con una pipeta estéril y transferir a un espacio en blanco de 9 mL de agua desionizada. Vórtice y la etiqueta "B".
- Repita este paso de dilución tres veces, cada vez con 1 mL de la suspensión anterior y un 9 mL desionizada en blanco. Etiquetar estos secuencialmente como tubos de C, D y E. Esto se traduce en diluciones seriadas de 10-1 a través de 10-5 gramos de suelo por mL
2. hacer el extendido placas para cultivo bacteriano
- Para hacer crecer colonias de bacterias, tomar tres placas de agar levadura peptona preparados y etiqueta como C, D y E. agitar las muestras C, D y E y pipeta de 0.1 mL en cada placa. Esto aumenta el valor de la dilución más, por un factor de diez (C = 10-3, D = 10-4, E = 10-5).
- A continuación, sumerja un separador de cristal en etanol. Coloque el separador en una llama durante unos segundos para encender y quemar el etanol. Esto esterilizará el separador.
- Mantenga el separador por encima de la primera placa hasta que la llama se extingue. Abra la placa rápidamente, manteniendo la tapa cerca de. Toque el separador para el agar de inóculo (inóculo = utilizadas para iniciar un cultivo de células) a enfriar y luego la gota de inóculo alrededor de la superficie del agar hasta que desaparezcan los rastros de líquido libre. Vuelva a colocar la tapa de la placa.
- Volver a la llama el separador y repita el proceso con el próximo funcionamiento de la placa, rápidamente para que no se contamine el agar con organismos aerotransportados
- Incubar las placas de las bacterias a temperatura ambiente durante 1 semana. Asegúrese de que las placas son invertidas durante la incubación para evitar gotas de humedad de la condensación caigan sobre la superficie del agar.
3. hacer el extendido placas para actinomicetos
- Para crecer actinomicetos, tomar tres platos preparados glicerol-caseína y etiquetarlos como B, C y D. utilizando las técnicas mostradas anteriormente, coloque la placa 0,1 mL de las suspensiones B, C y D. Las diluciones más bajas se utilizan porque actinomicetos están típicamente presentes como 1/10th de la población bacteriana (B = 10-2, C = 10-3, D = 10-4).
- Incubar las placas de Actinomiceto (invertidas) a temperatura ambiente durante 2 semanas.
4. bacterias y cuentas de Actinomiceto
- Después de la incubación, examinar todas las placas bacterias cuidadosamente y tenga en cuenta las diferencias en forma y tamaño de la Colonia. Cuando se cultiva en agar, las bacterias producen colonias viscosos desde incoloro a color naranja brillante, amarillo o rosa. Por el contrario, actinomycete colonias son calcáreos, firme, correosa y se romperán bajo presión, donde otras colonias de bacterias se manchan. Esto permite distinguir por el tacto con un asa estéril colonias.
- Cuente y anote el número de colonias bacterianas, incluyendo cualquier actinomicetos. Sólo contar las placas con 30-200 colonias por placa.
5. aislamiento de cultivos puros
- Seleccione las colonias bacterianas individuales de cualquiera de las placas. Más colonias se pueden seleccionar si hay especial interés en el suelo. Utilice una placa de alta dilución, ya que tiende a tener colonias puras que se separan bien. Seleccionar sólo las colonias que están muy separadas de colonias vecinas y parecen morfológicamente distintos unos de otros.
- Esterilice el asa por inmersión en alcohol y flamearlo. Rápidamente Abra la caja Petri de interés y toque el lazo a un lugar pelado en el agar para enfriarlo. Luego, extraer una pequeña cantidad de una colonia de interés en el bucle.
- Tomar una placa de peptona-levadura fresca, hacer una racha de unos pocos centímetros de un lado. Esterilizar y enfriar otra vez, y hacer una raya que cruza la franja inicial sólo en la primera pasada. Repita este proceso dos veces más de la misma manera. Este talento "dilución" produce en las células en el lazo de ser separados uno del otro. Coloque la placa en un lugar oscuro a incubar a temperatura ambiente durante dos semanas.
Determinar un conteo preciso de bacterias ambientales es fundamental para evaluar la salud de un ecosistema de suelo. Esto se puede lograr cultivar colonias de bacterias con diluciones adecuadas.
Bacterias del suelo son una parte importante de un ecosistema de suelo sano, interpretando papeles en descomposición, fijadoras de nitrógeno y ciclo de nutrientes. Suelos superficiales son un sustrato de materia orgánica y partículas inorgánicas formando una matriz compleja que rodea a los poros que se llenan de aire o agua. Estas condiciones crean un ecosistema ideal para las bacterias, con suelos superficiales que contienen típicamente más de 1 millón de bacterias por gramo.
Debido a esta alta concentración de bacterias, dilución es necesaria antes de placas en medios del crecimiento. Diluciones seriadas pueden reducir la concentración de la muestra original de suelo a niveles suficientemente bajos para las colonias solo ser cultivada en las placas de los medios de comunicación, permitiendo el cálculo de las cuentas iniciales de bacterias en la muestra de suelo.
Este video ilustra cómo preparar diluciones seriadas de las muestras de suelo, cómo estas muestras bacterianas de la placa y cómo calcular cuenta bacteriana del suelo de las placas de la dilución.
Las bacterias son organismos procariotas simples, pero muy diversas en cuanto a especies y ecosistemas. Actinomycetes son un subconjunto de las bacterias que con frecuencia se consideran un grupo único debido a su estructura filamentosa, donde crecen encordadas a hifas de forma.
Por lo general, actinomicetos representan 10% de la población bacteriana en el suelo. Las bacterias y los actinomicetos son abundantes en casi todos los ambientes en la tierra, pero se encuentran en una diversidad y abundancia en el suelo.
Bacterias del suelo son enumeradas y potencialmente cultivadas e identificadas por la galjanoplastia de la dilución. Aquí, una muestra de suelo en serie es diluido en agua y luego dispersados en las placas de crecimiento de agar. Luego se cuentan las colonias resultantes. Este valor, junto con el factor de dilución, se usa para aclarar la concentración inicial de bacterias en el suelo.
Placas de la dilución es un método simple para la enumeración bacteriana y común, barato, pero sufre de varios inconvenientes. El suelo no se debe colocar durante las diluciones, que podrían conducir a un crecimiento sesgado. Algunos suelo bacterias no la cultura en las placas, o crecen demasiado lento para ser observado. Además, este método asume que las colonias están formadas por una sola bacteria, pero pueden surgir de los montones de células múltiples.
Ciertas especies bacterianas crecen mejores en medios de cultivo diferentes. Un sustrato común a la cultura una amplia gama de bacterias es una placa de agar-peptona levadura. Actinomicetos crecen preferentemente en las placas base de glicerol-caseína, que adaptan mejor el crecimiento de estas bacterias filamentosas.
Ahora que usted entiende el concepto de enumeración bacteriana, vamos a ver cómo este proceso se lleva a cabo en el laboratorio.
Para comenzar el procedimiento, pesar 10 g de muestra de suelo y añadir a 95 mL de agua desionizada. Agite bien la suspensión y la etiqueta como "A". Antes de que el suelo se instala, extraiga 1 mL de la suspensión con una pipeta estéril y transferir a 9 mL de agua desionizada. Vórtice y la etiqueta "B".
Repita este paso de dilución 3 veces, cada vez con 1 mL de la suspensión anterior y 9 mL de agua desionizada. Etiquetar estos secuencialmente como tubos de C, D y E. El resultado en diluciones seriadas de 10-1 a través de 10-5 gramos de suelo por mL.
Para hacer crecer colonias de bacterias, tomar 3 placas de agar levadura peptona preparados y etiquetarlos como C, D y E. agitar las muestras correspondientes y pipetear 0,1 mL en cada placa. Puesto que se reportan unidades formadoras de colonias por mL, con 0,1 mL más aumenta la dilución en un factor de diez.
A continuación, sumerja un separador de cristal en etanol. Coloque el separador en una llama durante unos segundos para encender y quemar el etanol. Esto esterilizará el separador.
Mantenga el separador por encima de la primera placa hasta que la llama se extingue. Abra la placa rápidamente, manteniendo la tapa cerca de. Toque el separador para el agar de inóculo se enfríe y luego la gota de inóculo sobre la superficie hasta que desaparezcan los rastros de líquido libre. Vuelva a colocar la tapa de la placa.
Volver a la llama el separador y repita el proceso con el próximo funcionamiento de la placa, rápidamente para que no se contamine la placa con organismos aerotransportados. Invertir las placas para evitar que gotas de humedad sobre el agar e Incube las placas a temperatura ambiente durante una semana.
Para crecer actinomicetos, tomar tres platos preparados glicerol-caseína y etiquetarlos como B, C y D. utilizando las técnicas mostradas anteriormente, coloque la placa 0,1 mL de las suspensiones B, C y D. Las diluciones más bajas se utilizan porque actinomicetos están típicamente presentes como 1/10 de la población bacteriana.
Finalmente, invertir las placas y almacenar a temperatura ambiente durante dos semanas.
Después de la incubación, examinar todas las placas bacterias cuidadosamente y tenga en cuenta las diferencias en forma y tamaño de la Colonia. Cuando se cultiva en agar, las bacterias producen colonias viscosos desde incoloro a color naranja brillante, amarillo o rosa. Por el contrario, actinomycete colonias son calcáreos, firme, correosa y se romperán bajo presión, donde otras colonias de bacterias se manchan. Esto permite distinguir por el tacto con un asa estéril colonias.
Cuente y anote el número de colonias bacterianas, incluyendo cualquier actinomicetos. Sólo contar las placas con 30-200 colonias por placa.
Para crecer cultivos de bacterias individuales específicas, seleccione colonias discretas de cualquiera de las placas, seleccionar las colonias que están bien separadas de los vecinos de las colonias. Esterilizar un bucle que se separa, entonces abra la placa y tocar el lazo a un lugar vacío para enfriar. A continuación, toma una pequeña cantidad de la colonia de interés en el bucle.
Tomar una placa de peptona-levadura fresca, hacer una racha de unos pocos centímetros de un lado. Esterilizar y enfriar otra vez, y hacer una raya que cruza la franja inicial sólo en la primera pasada. Repita este proceso dos veces más de la misma manera. Este talento "dilución" produce en las células en el lazo de ser separados uno del otro. Coloque la placa en un lugar oscuro a incubar a temperatura ambiente durante dos semanas.
De los recuentos de colonias bacterianas y Actinomiceto, las unidades formadoras de colonias por gramo de suelo puede ser determinadas. El número de colonias por gramo de suelo es igual al número de colonias contadas en la placa, multiplicada por el recíproco de la dilución plateada. Por ejemplo, si se cuentan 46 colonias en una placa de dilución de 10-5 con un inoculante de 0,1 mL, entonces la UFC por gramo de suelo es igual a 10-6 por 46 y 46 millones de unidades formadoras de colonias por gramo de suelo.
Realizar conteos bacterianos y culturas es un primer paso clave en muchas investigaciones científicas o protocolos.
Suelo sano contiene entre 106 y 108 bacterias por gramo. Enumeración de bacteria del suelo puede utilizarse para determinar la salud de los suelos de interés y cuentas de menos de 106 y 108 bacterias por gramo indican terreno malsano o pobres. Esto puede ser causado por la falta de nutrientes o materia orgánica, estrés abiótico debido al pH del suelo extremas o la contaminación del suelo.
Muchos tipos de antibióticos usados en la medicina hoy se identificaron primero en suelo vivienda bacterias u hongos. Aislamiento de cepas puras de culturas de suelo ayuda en potencialmente ayuda los científicos identifiquen nuevos compuestos antibióticos. Prueba aquí, las bacterias o compuestos aislados de interés pueden añadirse a platos crecidos césped bacteriano, y sus efectos sobre el crecimiento del césped. Claro parches de céspedes bacterianos donde el crecimiento fue inhibido por las bacterias de prueba o compuesto pueden indicar actividad antibiótica.
Leguminosas, como guisantes y frijoles se basan en una relación simbiótica con la fijación de nitrógeno las bacterias. Estas bacterias viven libremente en el suelo o dentro de los nódulos en la raíz del sistema y producen compuestos de nitrógeno que son utilizados por la planta. En suelos pobres, complementando los cultivos de leguminosas con bacterias fijadoras de nitrógeno cultivadas en suelos puede estimular el crecimiento y la salud de las plantas. Esto puede resultar en plantas más grandes, más resistentes, que a su vez dan mayor rendimiento del cultivo.
Sólo ha visto la introducción de Zeus a enumeración bacteriana. Ahora debería entender cómo realizar las diluciones de las muestras de suelo, cómo la placa para recuento de colonias y el aislamiento de la Colonia y cómo calcular el número de bacterias en muestras de suelo. ¡Gracias por ver!
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Results
Se analiza una muestra de 10 g de suelo con un contenido de humedad del 20% sobre una base de peso seco para bacterias viables cultivables mediante dilución y técnicas de la galjanoplastia. Las diluciones se hicieron como se muestra en la tabla 1. 1 mL de solución E es plateado de vierte en un medio apropiado y resulta en 200 colonias bacterianas.
Pero, para 10 g de suelo húmedo,
Por lo tanto,
| Paso | Dilución | |
| 10 g suelo (peso/volumen) | solución salina 95 mL (solución A) | 10-1 |
| solución de 1 mL (volumen/volumen) | solución salina 9 mL (solución B) | 10-2 |
| 1 mL de solución B (volumen) | solución salina 9 mL (solución C) | 10-3 |
| 1 mL de solución C (volumen) | solución salina 9 mL (solución D) | 10-4 |
| 1 mL de solución D (volumen) | solución salina 9 mL (solución E) | 10-5 |
Tabla 1: dilución y placas de las muestras.
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Applications and Summary
Hay dos aplicaciones fundamentales de dilución y galjanoplastia de bacterias del suelo. La primera aplicación es la enumeración de bacterias cultivables en un suelo particular. La cuantificación del número de bacterias del suelo da una indicación de la salud del suelo. Por ejemplo, si hay 106 a 108 bacterias cultivables presentes por gramo de suelo, esto se consideraría un número saludable. A menos de 10 del número6 por gramo indica pobre salud del suelo, que puede ser debido a la falta de nutrientes que se encuentran en suelos de poca materia orgánica; estrés abiótico impuestas por valores de pH de suelo extremas (pH < 5 o > 8); o toxicidad por contaminantes antropogénicos orgánicos o inorgánicos.
La segunda aplicación importante es la visualización y el aislamiento de cultivos puros de bacterias. Los cultivos puros posteriormente pueden caracterizados y evaluados para características específicas que pueden ser útiles en aplicaciones médicas o ambientales. Ejemplos: producción de antibióticos; biodegradación de compuestos orgánicos tóxicos; o rizobios específicos útiles para la fijación de nitrógeno por los cultivos de leguminosas, como guisantes o judías.
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