細菌の成長曲線の解析と環境応用

Environmental Microbiology

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Overview

ソース: ドクターペッパー イアン博士チャールズ Gerba - アリゾナ大学所
示す著者: ルイーザ Ikner

細菌は地球上最も豊富な生命体の一つです。彼らは全ての生態系に発見され、日常生活に欠かせない。たとえば、細菌に影響を与える人々 は何を食べる、飲む、呼吸、および哺乳類細胞よりも人の体内より実際に細菌の細胞があります。細菌の重要性のため、研究室では、細菌の特定の種を勉強することをお勧めします。これを行うには、細菌の純粋培養、菌の 1 種類のみが検討されていることを意味制御された条件下で栽培しています。純粋培養で細菌が急速に成長し、細胞の数は、時間の短い期間で劇的に増加します。セル人口の率を測定することによって増加していく、「成長曲線」を開発します。利用、または知られている細菌の分離、たとえば植物成長を高める、有害有機物の分解を増加または抗生物質やその他の天然物工業規模で生産する数を接種を目指している、これは重要です。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 環境微生物学の必需品. 細菌の成長曲線の解析と環境応用. JoVE, Cambridge, MA, (2018).

Principles

裂、1 つの細菌細胞が分割し、2 つのセル (図 1) になるを通じて細菌繁殖が行われます。細胞分裂に必要な時間は、平均世代時間、または倍増するセルの数を必要な時間である倍加時間と呼ばれます。

Figure 1
図 1。急激な細胞分裂。各細胞分裂細胞数の倍増で起因します。低細胞数の増加が非常に大きくないです。ただし、数世代後のセル番号増加爆発的。N 区分後の 2n細胞があります。

理解し、特定の微生物の成長を定義、栄養供給と環境条件を制御、フラスコに配置されます。液体培地は、成長と環境パラメーターの成長を促すために必要なすべての栄養素を供給する数の増加が成長曲線を取得する時間の関数として測定できます。成長曲線 (図 2) 内では、いくつかの異なる成長段階を観察できます。遅れ位相、指数またはログ相、固定相、死フェーズでは、それぞれが特定の生理学的な変更 (表 1) に関連付けられているが含まれます。

特性
位相を遅れ 低成長や細胞の培養条件への生理的適応または初期低細胞密度のため exoenzymes の希釈による成長の欠如。
指数またはフェーズのログ 離散時間間隔を平均世代時間として知られている二重セル番号中の最適な成長率。
固定相 (細胞分裂) の成長と細胞の死細胞数の純増加しないお互いを相殺します。減らされた成長率は通常、栄養素の欠乏や有毒廃棄物成分の蓄積のために。
死の相 死亡率は、純損失は実行可能なセルに結果の成長率を超えています。

表 1.細菌の増殖の 4 つのフェーズです

Figure 2
図 2。細菌の人口の典型的な成長曲線します。コロニー形成に基づく曲線の形状を比較単位 (CFUs) 光の密度、特に死の段階で対。違いは、死んだ細胞は濁度の結果をまだが、文化の実行可能なコロニーを形作ることができないという事実によるものです。

全体的にみて、液体培地に存在する細菌のセルの数を知るために特定の細菌分離のため細菌の増殖動態を決定する重要なは多くの場合。比色の分光光度計とシリアル希釈めっきを使用して濁度測定を含む、液体媒体の成長を測定する別の方法があります。濁度測定は、液体培地より多くの濁った液体はなるより多くの細胞が示す事実に依存しています。シリアル希釈平板には固体文化、文化の「コロニー形成ユニット」として知られている測定可能なコロニーを形作ることができる液体培地での細胞数を試金が含まれます。ただし、このようなめっき法は細菌のみ使用できますは、実際には、培養可能。

Procedure

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1. 細菌培養因数のコレクション

  1. 成長の時間ポイントのコレクションの前に 1 日トリプチ醤油スープ (TSB)大腸菌を 50 mL フラスコ中の 20 mL を接種します。
  2. 27 ° C で一晩インキュベートします。この比較的長い潜伏期間は、野生型大腸菌の約 10 の固定相の人口の結果9 CFU/mL。
  3. 次の日に (500 mL フラスコ) で TSB の 250 mL を接種するのに準備の文化の 100 μ L を使用します。ミックス徹底的。 5 mL の約数を削除、4 ° C ですぐに冷蔵庫で冷やしますこれは、T = 0 または T0時間ポイントと約 4 × 105 CFU/mL を含める必要があります。
  4. インキュベーターの振動、37 ° C で残りのエシェリヒア属大腸菌(245 mL) のフラスコを配置します。1 時間ごとの文化の 5 mL 因数を削除、8 h ストア 4 ° C で各因数T8を介してこれらの因数 T1を指定します。

2. シリアル希釈

  1. 冷蔵庫と氷を運ぶために場所からエシェリヒア属大腸菌の因数を削除します。使用するまで氷の上のすべての文化を維持します。
  2. 大腸菌文化 (図 3) の様々 な希薄を取得する希釈チューブのシリーズを設定します。Microfuge の管は、この機能のために便利です。各希釈チューブ 900 μ L の希釈液 (生理食塩水) が必要です。希釈系列がエシェリヒア属大腸菌カルチャ (T0 T8~); ごとに必要な表 2に従って各チューブにラベルを付けます。
    Figure 3
    図 3。大腸菌をめっきするための手順を示す模式図。
  3. チューブ ラベル T0からエシェリヒア属大腸菌の 100 μ L を追加することによって希釈を開始 (最初のエシェリヒア属大腸菌文化) 管 A、T010-1希釈します。渦管 5 s。
  4. その後、T010-2希釈である生理食塩水、管 B の次のチューブにチューブ A の 100 μ L を追加します。各時間ポイント因数に必要な希釈系列を続行します。忘れずに渦を転送する前に各チューブ。また、各転送の新しいピペット チップを使用することが重要です。
大腸菌文化 希釈に必要なチューブ #
A B C D E F G
T0 10-1 10-2
T1 10-1 10-2
T2 10-1 10-2 10-3
T3 10-1 10-2 10-3 10-4
T4 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
T5 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
T6 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7
T7 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
T8 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

表 2。各エシェリヒア属大腸菌の培養に必要な希釈系列。

3. めっき

  1. 大腸菌培養時間ポイント因数の 3 つの希釈は、表 3によるとメッキされます。希釈倍率と追加するボリューム ラベルの時点 (T1 T8~) とプレートします。各希釈用帳票プレートを使用します。
  2. 寒天プレート (図 3) の中央に金額をピペッティングによる各希釈の 100 μ L をプレートに追加します。すぐに広がる炎を用いた因数は滅菌ガラス棒の形をした"L"です。因数はすぐに広がらない場合それ sorbsその場で最初の接種の場所で細菌の増殖の結果、皿の上。
  3. 時間ポイント T1 T8の希釈系列ごとにメッキを繰り返します。板間と特に異なる希釈率との間のロッドを消毒してください。
  4. プレートは、数分間乾燥した後、反転し、37 ° C のインキュベーターで一晩します。寒天プレート上に落ちるから結露を排除、板を反転します。一晩インキュベート後プレートは冷蔵庫に格納する必要があります。
エシェリヒア属大腸菌文化 めっきされる希釈
T0 10-1 10-2 10-3
T1 10-1 10-2 10-3
T2 10-2 10-3 10-4
T3 10-3 10-4 10-5
T4 10-4 10-5 10-6
T5 10-5 10-6 10-7
T6 10-6 10-7 10-8
T7 * 10-5 10-6 10-7
T8 * 10-4 10-5 10-6

*低い希釈は、死の段階のための低い人口を考慮しています。

表 3.大腸菌文化のためのプロトコルをめっきします

4 コロニーのカウントと平均世代時間を計算します。

  1. コロニーの均一性と汚染の欠如プレートを確認します。
  2. 各時点 (T0 T8~)、30 と 300 のコロニー カウント帳票プレートとが含まれている 1 つの希釈を選ぶ。
  3. T8時間ポイント T0で元の文化の mL あたりのセル数をバック-計算希釈倍率を使用して、します。たとえば、10-4希釈によるコロニー数は 30、28、32。
    コロニーの数を意味する 30 の植民地を =
    これらは 10 の-4希釈の 0.1 mL から生まれた
    1 mL あたりのコロニー数 = 30 x 104 = 3 x 106
  4. ログ10 CFU/mL と (単位は時間) 時間をプロットします。
  5. グラフから、指数関数的成長の段階を識別します。たびに指数的な成長段階と対応するセル番号内 2 時間ポイントを使用して、平均世代時間を計算します。

細菌の成長率を測定基礎微生物学的手法は、広範な使用は、基礎研究だけでなく農業および産業用アプリケーションのように。

細菌は地球の全ての生態系に存在することの最も豊富な生命体の中で人間の体を含んでいます。特定の細菌種はまた遺伝的非常に扱いやすい、工業規模での天然または合成の製品を生産、研究モデルとして利用されました。ただし、ラボでない全ての菌種を培養することができます。これらは、ことができます、重要な特徴は乗算、または「成長カイネティクス」の割合です。

細菌文化の成長率を測定する知らせることができます科学者の生理・代謝機能、また、下流用細菌のセルの正確な数を取得するために役立ちます。

このビデオは細菌の増殖率の分析の背後にある原則を導入するが、「成長曲線」の成長率を評価するためプロトコル示すし、最後に、細菌の増殖動態を測定するためのいくつかの環境の科学アプリケーションを探索。

細菌は一般的に 1 つの親細胞が同じ 2 つの娘細胞に分割単純な裂を掛ける、無性別します。栄養素が豊かさと環境パラメーターで使用可能な温度は、すべての成長を促すなど、良好な成長条件下で乗算の速度はこれまで死亡率を超えています。急激な成長でこの結果します。

文化の中の細菌の量を時間の関数として測定することにより成長曲線が得られます。最適な条件下で液体培養で細菌の成長のさまざまなフェーズに分けることが特徴的な形状と成長曲線を生成します。カーブは細菌培養条件に慣れながら成長が遅いとき「ラグ フェーズ」に始まります。次に、「ログ」または「指数段階」、細菌が急激な成長を経験するときです。成長には、栄養素が枯渇になるし、老廃物がたまり、「静止した段階」の結果最終的に失速します。最後に、細胞死の率の積率を抜いて、一度文化は「死の段階」を入力します。

成長曲線を構築するには、液体培養のフラスコの中の細菌の数が一定期間培養の異なる時点でカウントされます。細菌数は、いくつかの異なる方法で取得できます。一般的な方法の 1 つは光学密度または"OD"- 600、600 の波長の光の細菌の解決の吸光度は測定する nm。

別の方法は、「CFU」、または文化の 1 ミリリットルあたりのコロニー形成単位を決定することです。細菌の増殖のクローンの性質のため文化の 1 つの細菌を寒天版の 1 つのオブザーバブル コロニーに理論的に展開できます。細菌文化の希薄のシリーズをメッキすることによって、「シリアル希釈めっき」と呼ばれるメソッドを観察個々 で独立したコロニーをすることができます細菌濃度に到達する、コロニー数は 1 mL あたり CFU の面で細菌濃度をバック計算することが使用できます。

今、あなたが理解して細菌の増殖を分析できる老舗細菌エシェリヒア属大腸菌モデルの純粋な文化の成長曲線の分析を行うためのプロトコルを行ってみましょうどのようにシリアル希薄をめっき法を使用して。

ポイント コレクションに時間の前に 1 日、殺菌済みトリプチ醤油スープや TSB、エシェリヒア属大腸菌の単一コロニーを 50 mL のフラスコで培地 20 mL を接種します。

揺れで 37 ° C で一晩文化を孵化させなさい。エシェリヒア属大腸菌、これは約 10 の固定相の人口になる9 CFU/mL。

次の日は、500 mL のフラスコで TSB の 250 mL に一晩かけて培養の 100 μ L を接種します。ミックス徹底的。これは約 4 x 105 CFU/mL の希釈文化を生成します。カルチャ チューブにこの希釈文化の 5 mL を格納します。これは、時点 0 または T0から因数です。4 ° C ですぐに冷蔵庫で冷やします

揺れで 37 ° C で文化の残りのボリュームを孵化させなさい。8 h までの後のすべての時間、文化から 5 ml を収集します。これらサンプル T1 T8を指定し、使用するまで 4 ° C でそれらのすべてを格納します。

実験の日、冷蔵庫から大腸菌時間ポイント因数を削除し、氷のそれらを保ちます。それぞれ 900 μ L の滅菌生理食塩水、滅菌 microfuge の管を使用して、次の表に従って各因数の希釈系列を設定します。

ミックス軽くボルテックスでよく T0文化は、その希釈系列の 1-で-10、または 10-1希釈を作るチューブ A に 100 μ L を追加します。渦管 A、ミックスし、新鮮なピペット チップを使用して管 b、100 で 1 または 10-2希釈を作るチューブ A の 100 μ L を追加します。

表 2 に従って適切な希釈系列をして因数カルチャごとにプロセスを繰り返します。一度すべての時間ポイントのサンプルの希釈系列が行われている無菌トリプチ大豆寒天版の細菌のめっきの準備の適切な数であります。

各時間ポイント文化の 3 希釈液は次の表に従って 3 通でメッキされます。それに応じてプレートをラベル付けします。その後、それぞれ寒天プレートの中央に適切に希釈したカルチャごとの 100 μ L をピペットします。炎-滅菌"L"型のガラス棒、クール、接種から寒天をロッドに触れるとすぐに液を寒天培地の表面に 。接種の場所で細菌の増殖、拡散の遅延が生じるのでご注意ください。

すべての 9 の各希釈系列をめっきを続けるポイント文化、各希釈系列間ロッドを拡散ガラスを火炎滅菌の時間します。

プレートは、数分間乾燥するために許可されている、一度反転し、37 ° C の定温器に一晩置いてください。成長のこの期間の後、プレートは 4 ° C で格納できます。

希釈平板の一晩インキュベートした後汚染とコロニーの均一性にそれらを確認します。たびにポイントの文化のプレートごと 30 300 コロニー間ある希釈を選ぶ。その希釈用帳票のプレートのそれぞれのコロニーの数をカウントします。

各希釈し、希釈倍率のコロニー数の平均を使用して、CFU/mL の各時点で元のカルチャにおける細菌の濃度を計算します。たとえば、平均 30 植民地、3 通からプレート セット 10-4、0.1 mL から得られたまたは 10,000 の 1、希釈しそこがある場合 30 で割ること 0.1 mL 10,000、または 300 万 CFU/mL を掛けた。

各時点の計算細菌濃度を使用して、時間の時間に対して CFU/mL に、細菌の濃度の基本 10 ログのグラフをプロットします。グラフから元の細菌文化の成長のログ段階を識別し、t としてこれらの時間ポイントの最初を指定するログ段階の時間ポイントの 2 つを選んで 0 を =。計算式 X を使用して平均世代時間に等しい 2 n倍を乗じた力0 X は0 X の時間 t における細菌の濃度は t 初期濃度 = 0、n は 2 つの間に経過した世代数とタイム ポイント。

たとえば、X0は 1,000 CFU/mL と仮定します、t = 6 h で、濃度は 16,000 CFU/mL。式を使用して、我々 は 4 世代が 6 h、6 世代あたり 4 または 1.5 h で割った値の生成時間を与えるに行われていることを取得します。

細菌の増殖速度の測定は研究、農林やバイオ エンジニア リングの目的のための多くのアプリケーションに不可欠です。

細菌の増殖速度を知るための 1 つの使用は、別のカルチャまたは培地に接種を取得して細菌培養の正確な量を許可することです。たとえば、特定の作物, マメ科植物などはフォーム結節に植物の根を植民地化し、「修正」窒素 - 大気中の窒素を植物によって利用することができますアンモニアに変換する根粒菌と呼ばれる共生細菌に成長する必要があります。農業用には、根粒菌の既知量は植物細菌の共生を確立するマメ科植物種子を接種するものですし、泥炭基づく炭素中に追加されます。

生長解析は、産業廃棄物が低下し、必要な貴重な副産物を生成する細菌の種を識別するためにも使用できます。この例では、研究者は、成長培地黒液、木材パルプおよびペーパー生産から廃棄物が環境微生物分離株の成長に影響を検討しました。

細菌だけでなく、黒液と強化された成長を示したこと、また細菌の代謝することができます黒の液で 1 つ以上の炭素源の存在を示す「ダイフェーズ」成長パターンを示した。黒液の個々 のコンポーネントがその成長解析の詳細に抽出されています。

最後に、成長率測定もたとえば、油汚染の浄化として特定工業用設計されている細菌の特性評価に役立ちます。ここでは、科学者たちは、石油の炭化水素成分を低下させる酵素を含む遺伝子組み換え細菌の緊張を作成しました。生長解析は組み換え細菌組み換え細菌汚染クリーンアップ機能を行うようになります改善の公差を示す有害な炭化水素の存在下での正常な細菌よりも成長率が増加していることを確認するために実行されます。

成長曲線と細菌の増殖率の分析にゼウスのビデオを見てきただけ。今細菌文化、時間ポイント コレクションとシリアル希釈めっきを使用して成長曲線を取得する実験を実行する方法および研究および産業目的のための成長分析の適用方法の異なる成長段階を理解する必要があります。いつも見てくれてありがとう!

Results

次のシリアル希薄をめっき実験、次のデータが得られました。ここで指定した指数関数的成長の初めに時間 t = 0、細菌細胞の初期濃度が 1,000 CFU/mL。時間 t = 6 h、細胞の濃度が 16,000 CFU/mL。

今、X = 2n x X0

場所: X0 = セルの初期濃度 = 1,000 CFU/mL
X 時間 t 後の細胞の濃度を = = 16,000 CFU/mL
n = 世代数
16,000 = 2n x 1,000
2n = 16
ログイン10 2n = ログ10 16
0.301 = 1.204 x n
n = 1.204 = 4
0.301

だから 6 h で 4 世代を経過

平均世代時間 = 6/4 = 1.5 h。

Figure 4
図 4。根粒窒素固定菌が含まれています。

Applications and Summary

培地で細菌の増殖動態と細菌数の知識研究と商業的な観点の両方から重要です。研究では、それはしばしばが、正確な同じ番号を持つ必要がある場合、実験を複製することができますので、サンプル中の細菌の数を知ることが重要。たとえば中実験土壌、土壌汚染された有毒な有機土壌の強化された生分解性など、目的の効果を得るための 1 グラムあたり追加する 10 の4 CFU 必要最低のプロットに細菌の乳酸菌を追加しました。別の例は、根粒菌 (植物の根と共生関係を結ぶ細菌) の不明の番号は泥炭系炭素媒体 (図 4) に含浸された市販根粒菌乳酸菌のケースです。媒体は、生物学的窒素固定 (すなわち、窒素分子の栄養素として有機体によって使用できる有機的な形態への変換) を強化するマメ科植物種子を接種するのには使用されます。

成長速度も細菌の菌の特定産業廃棄物や油汚染など、特定の基質の代謝に適応しているかどうかを評価するため便利です。たとえば、油流出をクリーンアップするため、遺伝子組み換え細菌は彼らの成長は、オイルの毒性によってない抑圧されるだろうように複雑な炭化水素の存在下で栽培できます。同様に、斜面と産業廃棄物の混合で増殖する細菌から作成される成長曲線の形状かどうかバクテリアが特定の物質と廃棄物の混合物で、細菌のどのように多くの潜在的なエネルギー源を見つけることができます科学者に通知できます。

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1. 細菌培養因数のコレクション

  1. 成長の時間ポイントのコレクションの前に 1 日トリプチ醤油スープ (TSB)大腸菌を 50 mL フラスコ中の 20 mL を接種します。
  2. 27 ° C で一晩インキュベートします。この比較的長い潜伏期間は、野生型大腸菌の約 10 の固定相の人口の結果9 CFU/mL。
  3. 次の日に (500 mL フラスコ) で TSB の 250 mL を接種するのに準備の文化の 100 μ L を使用します。ミックス徹底的。 5 mL の約数を削除、4 ° C ですぐに冷蔵庫で冷やしますこれは、T = 0 または T0時間ポイントと約 4 × 105 CFU/mL を含める必要があります。
  4. インキュベーターの振動、37 ° C で残りのエシェリヒア属大腸菌(245 mL) のフラスコを配置します。1 時間ごとの文化の 5 mL 因数を削除、8 h ストア 4 ° C で各因数T8を介してこれらの因数 T1を指定します。

2. シリアル希釈

  1. 冷蔵庫と氷を運ぶために場所からエシェリヒア属大腸菌の因数を削除します。使用するまで氷の上のすべての文化を維持します。
  2. 大腸菌文化 (図 3) の様々 な希薄を取得する希釈チューブのシリーズを設定します。Microfuge の管は、この機能のために便利です。各希釈チューブ 900 μ L の希釈液 (生理食塩水) が必要です。希釈系列がエシェリヒア属大腸菌カルチャ (T0 T8~); ごとに必要な表 2に従って各チューブにラベルを付けます。
    Figure 3
    図 3。大腸菌をめっきするための手順を示す模式図。
  3. チューブ ラベル T0からエシェリヒア属大腸菌の 100 μ L を追加することによって希釈を開始 (最初のエシェリヒア属大腸菌文化) 管 A、T010-1希釈します。渦管 5 s。
  4. その後、T010-2希釈である生理食塩水、管 B の次のチューブにチューブ A の 100 μ L を追加します。各時間ポイント因数に必要な希釈系列を続行します。忘れずに渦を転送する前に各チューブ。また、各転送の新しいピペット チップを使用することが重要です。
大腸菌文化 希釈に必要なチューブ #
A B C D E F G
T0 10-1 10-2
T1 10-1 10-2
T2 10-1 10-2 10-3
T3 10-1 10-2 10-3 10-4
T4 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
T5 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
T6 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7
T7 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
T8 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

表 2。各エシェリヒア属大腸菌の培養に必要な希釈系列。

3. めっき

  1. 大腸菌培養時間ポイント因数の 3 つの希釈は、表 3によるとメッキされます。希釈倍率と追加するボリューム ラベルの時点 (T1 T8~) とプレートします。各希釈用帳票プレートを使用します。
  2. 寒天プレート (図 3) の中央に金額をピペッティングによる各希釈の 100 μ L をプレートに追加します。すぐに広がる炎を用いた因数は滅菌ガラス棒の形をした"L"です。因数はすぐに広がらない場合それ sorbsその場で最初の接種の場所で細菌の増殖の結果、皿の上。
  3. 時間ポイント T1 T8の希釈系列ごとにメッキを繰り返します。板間と特に異なる希釈率との間のロッドを消毒してください。
  4. プレートは、数分間乾燥した後、反転し、37 ° C のインキュベーターで一晩します。寒天プレート上に落ちるから結露を排除、板を反転します。一晩インキュベート後プレートは冷蔵庫に格納する必要があります。
エシェリヒア属大腸菌文化 めっきされる希釈
T0 10-1 10-2 10-3
T1 10-1 10-2 10-3
T2 10-2 10-3 10-4
T3 10-3 10-4 10-5
T4 10-4 10-5 10-6
T5 10-5 10-6 10-7
T6 10-6 10-7 10-8
T7 * 10-5 10-6 10-7
T8 * 10-4 10-5 10-6

*低い希釈は、死の段階のための低い人口を考慮しています。

表 3.大腸菌文化のためのプロトコルをめっきします

4 コロニーのカウントと平均世代時間を計算します。

  1. コロニーの均一性と汚染の欠如プレートを確認します。
  2. 各時点 (T0 T8~)、30 と 300 のコロニー カウント帳票プレートとが含まれている 1 つの希釈を選ぶ。
  3. T8時間ポイント T0で元の文化の mL あたりのセル数をバック-計算希釈倍率を使用して、します。たとえば、10-4希釈によるコロニー数は 30、28、32。
    コロニーの数を意味する 30 の植民地を =
    これらは 10 の-4希釈の 0.1 mL から生まれた
    1 mL あたりのコロニー数 = 30 x 104 = 3 x 106
  4. ログ10 CFU/mL と (単位は時間) 時間をプロットします。
  5. グラフから、指数関数的成長の段階を識別します。たびに指数的な成長段階と対応するセル番号内 2 時間ポイントを使用して、平均世代時間を計算します。

細菌の成長率を測定基礎微生物学的手法は、広範な使用は、基礎研究だけでなく農業および産業用アプリケーションのように。

細菌は地球の全ての生態系に存在することの最も豊富な生命体の中で人間の体を含んでいます。特定の細菌種はまた遺伝的非常に扱いやすい、工業規模での天然または合成の製品を生産、研究モデルとして利用されました。ただし、ラボでない全ての菌種を培養することができます。これらは、ことができます、重要な特徴は乗算、または「成長カイネティクス」の割合です。

細菌文化の成長率を測定する知らせることができます科学者の生理・代謝機能、また、下流用細菌のセルの正確な数を取得するために役立ちます。

このビデオは細菌の増殖率の分析の背後にある原則を導入するが、「成長曲線」の成長率を評価するためプロトコル示すし、最後に、細菌の増殖動態を測定するためのいくつかの環境の科学アプリケーションを探索。

細菌は一般的に 1 つの親細胞が同じ 2 つの娘細胞に分割単純な裂を掛ける、無性別します。栄養素が豊かさと環境パラメーターで使用可能な温度は、すべての成長を促すなど、良好な成長条件下で乗算の速度はこれまで死亡率を超えています。急激な成長でこの結果します。

文化の中の細菌の量を時間の関数として測定することにより成長曲線が得られます。最適な条件下で液体培養で細菌の成長のさまざまなフェーズに分けることが特徴的な形状と成長曲線を生成します。カーブは細菌培養条件に慣れながら成長が遅いとき「ラグ フェーズ」に始まります。次に、「ログ」または「指数段階」、細菌が急激な成長を経験するときです。成長には、栄養素が枯渇になるし、老廃物がたまり、「静止した段階」の結果最終的に失速します。最後に、細胞死の率の積率を抜いて、一度文化は「死の段階」を入力します。

成長曲線を構築するには、液体培養のフラスコの中の細菌の数が一定期間培養の異なる時点でカウントされます。細菌数は、いくつかの異なる方法で取得できます。一般的な方法の 1 つは光学密度または"OD"- 600、600 の波長の光の細菌の解決の吸光度は測定する nm。

別の方法は、「CFU」、または文化の 1 ミリリットルあたりのコロニー形成単位を決定することです。細菌の増殖のクローンの性質のため文化の 1 つの細菌を寒天版の 1 つのオブザーバブル コロニーに理論的に展開できます。細菌文化の希薄のシリーズをメッキすることによって、「シリアル希釈めっき」と呼ばれるメソッドを観察個々 で独立したコロニーをすることができます細菌濃度に到達する、コロニー数は 1 mL あたり CFU の面で細菌濃度をバック計算することが使用できます。

今、あなたが理解して細菌の増殖を分析できる老舗細菌エシェリヒア属大腸菌モデルの純粋な文化の成長曲線の分析を行うためのプロトコルを行ってみましょうどのようにシリアル希薄をめっき法を使用して。

ポイント コレクションに時間の前に 1 日、殺菌済みトリプチ醤油スープや TSB、エシェリヒア属大腸菌の単一コロニーを 50 mL のフラスコで培地 20 mL を接種します。

揺れで 37 ° C で一晩文化を孵化させなさい。エシェリヒア属大腸菌、これは約 10 の固定相の人口になる9 CFU/mL。

次の日は、500 mL のフラスコで TSB の 250 mL に一晩かけて培養の 100 μ L を接種します。ミックス徹底的。これは約 4 x 105 CFU/mL の希釈文化を生成します。カルチャ チューブにこの希釈文化の 5 mL を格納します。これは、時点 0 または T0から因数です。4 ° C ですぐに冷蔵庫で冷やします

揺れで 37 ° C で文化の残りのボリュームを孵化させなさい。8 h までの後のすべての時間、文化から 5 ml を収集します。これらサンプル T1 T8を指定し、使用するまで 4 ° C でそれらのすべてを格納します。

実験の日、冷蔵庫から大腸菌時間ポイント因数を削除し、氷のそれらを保ちます。それぞれ 900 μ L の滅菌生理食塩水、滅菌 microfuge の管を使用して、次の表に従って各因数の希釈系列を設定します。

ミックス軽くボルテックスでよく T0文化は、その希釈系列の 1-で-10、または 10-1希釈を作るチューブ A に 100 μ L を追加します。渦管 A、ミックスし、新鮮なピペット チップを使用して管 b、100 で 1 または 10-2希釈を作るチューブ A の 100 μ L を追加します。

表 2 に従って適切な希釈系列をして因数カルチャごとにプロセスを繰り返します。一度すべての時間ポイントのサンプルの希釈系列が行われている無菌トリプチ大豆寒天版の細菌のめっきの準備の適切な数であります。

各時間ポイント文化の 3 希釈液は次の表に従って 3 通でメッキされます。それに応じてプレートをラベル付けします。その後、それぞれ寒天プレートの中央に適切に希釈したカルチャごとの 100 μ L をピペットします。炎-滅菌"L"型のガラス棒、クール、接種から寒天をロッドに触れるとすぐに液を寒天培地の表面に 。接種の場所で細菌の増殖、拡散の遅延が生じるのでご注意ください。

すべての 9 の各希釈系列をめっきを続けるポイント文化、各希釈系列間ロッドを拡散ガラスを火炎滅菌の時間します。

プレートは、数分間乾燥するために許可されている、一度反転し、37 ° C の定温器に一晩置いてください。成長のこの期間の後、プレートは 4 ° C で格納できます。

希釈平板の一晩インキュベートした後汚染とコロニーの均一性にそれらを確認します。たびにポイントの文化のプレートごと 30 300 コロニー間ある希釈を選ぶ。その希釈用帳票のプレートのそれぞれのコロニーの数をカウントします。

各希釈し、希釈倍率のコロニー数の平均を使用して、CFU/mL の各時点で元のカルチャにおける細菌の濃度を計算します。たとえば、平均 30 植民地、3 通からプレート セット 10-4、0.1 mL から得られたまたは 10,000 の 1、希釈しそこがある場合 30 で割ること 0.1 mL 10,000、または 300 万 CFU/mL を掛けた。

各時点の計算細菌濃度を使用して、時間の時間に対して CFU/mL に、細菌の濃度の基本 10 ログのグラフをプロットします。グラフから元の細菌文化の成長のログ段階を識別し、t としてこれらの時間ポイントの最初を指定するログ段階の時間ポイントの 2 つを選んで 0 を =。計算式 X を使用して平均世代時間に等しい 2 n倍を乗じた力0 X は0 X の時間 t における細菌の濃度は t 初期濃度 = 0、n は 2 つの間に経過した世代数とタイム ポイント。

たとえば、X0は 1,000 CFU/mL と仮定します、t = 6 h で、濃度は 16,000 CFU/mL。式を使用して、我々 は 4 世代が 6 h、6 世代あたり 4 または 1.5 h で割った値の生成時間を与えるに行われていることを取得します。

細菌の増殖速度の測定は研究、農林やバイオ エンジニア リングの目的のための多くのアプリケーションに不可欠です。

細菌の増殖速度を知るための 1 つの使用は、別のカルチャまたは培地に接種を取得して細菌培養の正確な量を許可することです。たとえば、特定の作物, マメ科植物などはフォーム結節に植物の根を植民地化し、「修正」窒素 - 大気中の窒素を植物によって利用することができますアンモニアに変換する根粒菌と呼ばれる共生細菌に成長する必要があります。農業用には、根粒菌の既知量は植物細菌の共生を確立するマメ科植物種子を接種するものですし、泥炭基づく炭素中に追加されます。

生長解析は、産業廃棄物が低下し、必要な貴重な副産物を生成する細菌の種を識別するためにも使用できます。この例では、研究者は、成長培地黒液、木材パルプおよびペーパー生産から廃棄物が環境微生物分離株の成長に影響を検討しました。

細菌だけでなく、黒液と強化された成長を示したこと、また細菌の代謝することができます黒の液で 1 つ以上の炭素源の存在を示す「ダイフェーズ」成長パターンを示した。黒液の個々 のコンポーネントがその成長解析の詳細に抽出されています。

最後に、成長率測定もたとえば、油汚染の浄化として特定工業用設計されている細菌の特性評価に役立ちます。ここでは、科学者たちは、石油の炭化水素成分を低下させる酵素を含む遺伝子組み換え細菌の緊張を作成しました。生長解析は組み換え細菌組み換え細菌汚染クリーンアップ機能を行うようになります改善の公差を示す有害な炭化水素の存在下での正常な細菌よりも成長率が増加していることを確認するために実行されます。

成長曲線と細菌の増殖率の分析にゼウスのビデオを見てきただけ。今細菌文化、時間ポイント コレクションとシリアル希釈めっきを使用して成長曲線を取得する実験を実行する方法および研究および産業目的のための成長分析の適用方法の異なる成長段階を理解する必要があります。いつも見てくれてありがとう!

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