Bakterielle Wachstum Kurvenanalyse und seine Umweltanwendungen

Environmental Microbiology

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Overview

Quelle: Labors von Dr. Ian Pfeffer und Dr. Charles Gerba - Arizona University
Demonstrierende Autor: Luisa Ikner

Bakterien gehören zu den am häufigsten vorkommenden Lebensformen auf der Erde. Sie sind in jedem Ökosystem gefunden und sind von entscheidender Bedeutung für den Alltag. Zum Beispiel Bakterien beeinflussen, was die Leute Essen, trinken und atmen, und es gibt tatsächlich mehr bakterielle Zellen im Körper einer Person als Säugerzellen. Aufgrund der Bedeutung von Bakterien ist es vorzuziehen, bestimmte Arten von Bakterien im Labor zu untersuchen. Dazu werden Bakterien unter kontrollierten Bedingungen angebaut, in Reinkultur, was bedeutet, dass nur eine Art von Bakterium erwogen wird. Bakterien wachsen schnell in Reinkultur, und Zellzahlen in kurzer Zeit dramatisch zunehmen. Durch die Messung der Rate der Zellpopulation zu erhöhen, im Laufe der Zeit eine "Wachstumskurve" entwickelt werden. Dies ist wichtig, wenn mit dem Ziel, nutzen oder impfen bekannte Nummern des bakteriellen Isolats, zum Beispiel um Pflanzenwachstum zu verbessern, die biologischen Abbau giftiger organischer Stoffe oder Antibiotika oder andere natürliche Produkte im industriellen Maßstab zu produzieren.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Grundlagen der Umwelt-Mikrobiologie. Bakterielle Wachstum Kurvenanalyse und seine Umweltanwendungen. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Principles

Bakterielle Vermehrung erfolgt über binäre Spaltung, in der eine bakterielle Zelle teilt sich und wird von zwei Zellen (Abbildung 1). Der Zeitaufwand für die Zellteilung ist bekannt als die mittlere Generation Zeit oder Verdopplungszeit, ist der Zeitaufwand für die Anzahl der Zellen zu verdoppeln.

Figure 1
Abbildung 1: Exponentielle Zellteilung. Jeder Zellteilung führt zu einer Verdoppelung der Anzahl von Zellen. Bei niedrigen Zellzahlen ist die Erhöhung nicht sehr groß; aber nach ein paar Generationen Zelle Zahlen Erhöhung explosionsartig. Nach n Divisionen gibt es 2n Zellen.

Zu verstehen und das Wachstum von bestimmten Mikroorganismen zu definieren, werden sie in ein Auffanggefäß platziert, wo die Nährstoffversorgung und Umweltbedingungen gesteuert werden. Wenn das flüssige Medium alle Nährstoffe, die für Wachstum und Umweltparameter förderlich für Wachstum benötigt liefert, kann der Anstieg der Zahlen als Funktion der Zeit zu einer Wachstumskurve gemessen werden. Mehrere unterschiedliche Wachstumsphasen können innerhalb einer Wachstumskurve (Abbildung 2) beobachtet werden. Dazu gehören die Lag-Phase, die exponentielle oder Log-Phase, die stationäre Phase und der Tod-Phase, von denen jede spezifische physiologische Veränderungen (Tabelle 1) zugeordnet sind.

Phase Merkmale
Lag-Phase Langsames Wachstum oder Mangel an Wachstum durch physiologische Anpassung der Zellen, die Kulturbedingungen oder Verdünnung der Exoenzymes aufgrund der anfänglichen niedrigen Zelldichten.
Exponentielle oder Log-Phase Optimale Wachstumsraten, während die Zellzahlen Doppel in diskreten Zeitintervallen die mittlere Generationszeit genannt.
Stationäre Phase Wachstum (Zellteilung) und Absterben der Zellen untereinander, wodurch keine Nettozunahme Zellzahlen Gegengewicht. Das geringere Wachstum ist in der Regel durch einen Mangel an Nährstoffen und/oder eine Ansammlung von toxischen Abfällen Bestandteile.
Tod-Phase Sterberate übersteigt die Wachstumsrate, was zu einem Nettoverlust von entwicklungsfähigen Zellen.

Tabelle 1. Die vier Phasen des Bakterienwachstums.

Figure 2
Abbildung 2: Eine typische Wachstumskurve für eine Bakterienpopulation. Vergleichen Sie die Form der Kurven basierend auf koloniebildenden Einheiten (KBE) im Vergleich zu optischen Dichte, vor allem in den Tod-Phase. Der Unterschied ist, dass abgestorbene Zellen Ergebnis der Trübung noch, aber können nicht lebensfähige Kolonien in Kultur bilden.

Insgesamt ist es oft entscheidend für Bakterienwachstum Kinetik für einen bestimmten bakteriellen Isolat zu bestimmen, um die Anzahl der bakteriellen Zellen in das flüssige Medium kennen. Es gibt verschiedene Möglichkeiten, um Wachstum in einem flüssigen Medium, einschließlich Trübung Messungen mit einer kolorimetrischen Spektralphotometer und serielle Verdünnung Beschichtung zu messen. Trübung Messungen verlassen sich auf die Tatsache, dass je mehr Zellen in das flüssige Medium, das mehr trübe Flüssigkeit wird. Serielle Verdünnung Überzug beinhaltet prüfen die Anzahl der Zellen in das flüssige Medium, das tragfähige Kolonien auf solide Kultur, eine Messung, bekannt als die Kultur "Koloniebildenden Einheiten" bilden können. Beachten Sie jedoch, dass diese Beschichtung Assays nur für Bakterien verwendet werden können, sind in der Tat sind.

Procedure

<>

1. Erhebung der Bakterienkultur Aliquote

  1. Impfen Sie einen Tag vor der Abholung von Wachstum Zeitpunkten 20 mL Trypticase-Soja Brühe (TSB) Medium in eine 50-mL-Flasche mit E. Coli.
  2. Inkubation über Nacht bei 27 ° C. Diese relativ langen Inkubationszeit führt zu einer stationären Phase Bevölkerung von Wildtyp E. Coli von ca. 109 KBE/mL.
  3. Am nächsten Tag verwenden Sie 100 µL der vorbereiteten Kultur 250 mL TSB (in einen 500-mL-Kolben) zu impfen. Mischen Sie gründlich.  Eine 5-mL-aliquoten zu entfernen und in den Kühlschrank sofort bei 4 ° C. Dies ist T = 0 oder T0 Zeitpunkt, und sollte ca. 4 x 105 KBE/mL enthalten.
  4. Legen Sie den Kolben des verbleibenden E. Coli (245 mL) in einem 37 ° C Inkubator schütteln. 5-mL-aliquoten Kultur stündlich zu entfernen, bis zu 8 h. speichern jedes aliquoten bei 4 ° C. Benennen Sie diese Aliquote T1 bis T8.

2. serielle Verdünnung

  1. Aliquote von E. Coli aus dem Kühlschrank und auf Eis für den Transport zu entfernen. Halten Sie alle Kulturen auf Eis bis zur Verwendung.
  2. Richten Sie eine Reihe von Verdünnung Rohren zu verschiedenen Verdünnungen der jeweiligen E. Coli -Kultur (Abbildung 3). Microfuge Röhren eignen sich für diese Funktion. Jedes Rohr Verdünnung sollten 900 µL Verdünnung Flüssigkeit (sterile Kochsalzlösung) haben. Eine Verdünnungsreihe ist erforderlich für jede Kultur E. Coli (T0 bis T8); Beschriften Sie jedes Rohr nach Tabelle 2.
    Figure 3
    Abbildung 3. Schaltplan zeigt das Verfahren für die Beschichtung von E. Coli.
  3. Verdünnungen durch Zugabe von 100 µL von E. Coli aus der Tube mit der Bezeichnung T0 beginnen (die ursprüngliche E. Coli Kultur) Rohr A, die die 10-1 Verdünnung T0ist. Wirbel der Röhre für 5 s.
  4. Anschließend fügen Sie 100 µL Rohr A an das nächste Rohr der Saline, Rohr B hinzu, die die 10-2 Verdünnung T0. Die notwendige Verdünnung-Serie für jede Zeitpunkt aliquoten weiter. Denken Sie daran, Wirbel jedes Rohr vor der Übertragung. Es ist auch wichtig, eine neue Pipettenspitze für jede Übertragung zu verwenden.
E. Coli -Kultur Verdünnungen erforderlich und Tube #
A B C D E F G
T0 10-1 10-2
T1 10-1 10-2
T2 10-1 10-2 10-3
T-3 10-1 10-2 10-3 10-4
T4 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
T5 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
T6 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7
T-7 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
T-8 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

Tabelle 2. Verdünnungsreihen notwendig für jede E. Coli -Kultur.

3. Beschichtung

  1. Drei Verdünnungen für jedes E. Coli Kultur Zeitpunkt aliquoten werden gemäß Tabelle 3überzogen werden. Label-Platten mit der Zeitpunkt (T1 bis T-8), den Verdünnungsfaktor und Volumen hinzugefügt werden. Verwenden Sie dreifacher Platten für jede Verdünnung.
  2. Die Platte fügen Sie 100 µL jeder Verdünnung durch Pipettieren des Betrags in die Mitte der Agarplatte (Abbildung 3 hinzu). Sofort verbreiten sterilisiert die aliquoten durch den Einsatz einer Flamme "L"-förmige Glasstab. Wenn die aliquoten nicht sofort verteilt ist, Sorben es in Situ auf der Platte, wodurch bakterielle Überwucherung an der Stelle der ersten Impfung.
  3. Wiederholen Sie die Beschichtung für jedes Verdünnungsreihe zur Zeit Punkte T1 bis T8. Denken Sie daran, die Rute zwischen den Platten und vor allem zwischen verschiedenen Verdünnungen zu sterilisieren.
  4. Sobald Platten für ein paar Minuten getrocknet haben, umdrehen und über Nacht bei 37 ° C Inkubator legen. Invertieren der Platten Kondensation auf der Agarplatte fallen entgegen. Platten sollten nach Inkubation über Nacht im Kühlschrank gelagert werden.
E. coli Kultur Verdünnungen, beschichtet werden
T0 10-1 10-2 10-3
T1 10-1 10-2 10-3
T2 10-2 10-3 10-4
T-3 10-3 10-4 10-5
T4 10-4 10-5 10-6
T5 10-5 10-6 10-7
T6 10-6 10-7 10-8
T7 * 10-5 10-6 10-7
T8 * 10-4 10-5 10-6

* Niedrigere Verdünnungen berücksichtigen geringere Populationen durch Tod Phase.

Tabelle 3. Protokoll für E. Coli Kulturen plating.

4. zählen Kolonien und mittlere Generationszeit rechnen

  1. Platten für Einheitlichkeit der Kolonien und Mangel an Kontamination zu untersuchen.
  2. Wählen Sie für jeden Zeitpunkt (T0 bis T8) eine Verdünnung, die zwischen 30 und 300 Kolonien und Graf dreifacher Platten enthält.
  3. Berechnen Sie mit Hilfe den Verdünnungsfaktor, Rücken-die Anzahl der Zellen pro mL der ursprünglichen Kultur auf Zeit Punkte T0 bis T8. Zum Beispiel, wenn die Anzahl der Kolonien, die aus einer 10-4 Verdünnung 30, 28 und 32:
    Mittlere Anzahl der Kolonien = 30 Kolonien
    Diese entstand aus 0,1 mL einer 10-4 Verdünnung
    Anzahl der Kolonien pro mL = 30 x 104 = 3 x 106
  4. Plot-Log10 KBE/mL im Vergleich zur Zeit (in Stunden).
  5. Aus dem Diagramm ermitteln der exponentiellen Wachstumsphase. Mit 2 Zeitpunkten innerhalb der exponentiellen Wachstumsphase und die entsprechende Zelle Zahlen zu jedem Zeitpunkt, berechnen Sie die mittlere Generationszeit.

Die Wachstumsrate der Bakterien zu messen ist eine grundlegende Technik, mikrobiologische und hat weit verbreiteten Einsatz in der Grundlagenforschung als auch landwirtschaftliche und industrielle Anwendungen.

Bakterien sind unter den am häufigsten vorkommenden Lebensformen auf der Erde anwesend in jedem Ökosystem des menschlichen Körpers inklusive. Bestimmte Bakterienarten sind auch genetisch sehr gefügig und haben als Forschungsmodelle oder natürlichen oder synthetischen Produkten im industriellen Maßstab genutzt wurde. Allerdings können nicht alle Bakterienarten im Labor kultiviert werden. Für diejenigen, die können, ist ein wichtiges Merkmal der Multiplikation oder "Wachstum Kinetik".

Messung eine Bakterienkultur Wachstumsrate kann informieren Wissenschaftler über ihre physiologische und metabolische Funktionen und ist auch nützlich, um eine exakte Zellzahl der Bakterien für downstream-Anwendungen.

Dieses Video wird einzuführen, die Prinzipien hinter Bakterienwachstum Rate Analyse, ein Protokoll zur Charakterisierung Wachstumsrate mit einer "Wachstumskurve" zu demonstrieren und schließlich beschäftigen mehrere Umweltwissenschaften Anwendungen zur Messung von Bakterienwachstum Kinetik.

Bakterien vermehren in der Regel ungeschlechtlich, Multiplikation mit einfachen binären Kernspaltung wo eine elterliche Zelle teilt sich in zwei identische Tochterzellen. Unter günstigen Wachstumsbedingungen, wo Nährstoffe in Hülle und Fülle und Umweltparametern vorhanden sind, wie z. B. Temperatur sind alle förderlich für Wachstum, übertrifft die Rate der Multiplikation die Sterberate. Dies führt zu exponentiellem Wachstum.

Durch die Messung der Menge der Bakterien in einer Kultur als Funktion der Zeit, erhalten Sie eine Wachstumskurve. Wachsenden Bakterien in einer flüssigen Kultur unter optimalen Bedingungen produziert eine Wachstumskurve mit eine charakteristische Form, die in verschiedene Phasen unterteilt werden kann. Die Kurve beginnt mit einer "Lag-Phase", als Wachstum langsam ist, während die Bakterien, die Kulturbedingungen eingewöhnt werden. Als nächstes ist die "Protokoll" oder "exponentielle Phase", wenn die Bakterien exponentielles Wachstum erleben. Wachstum Stände schließlich einmal Nährstoffe aufgebraucht werden und Schlacken ansammeln, was zu einer "stationären Phase". Schließlich, sobald die Rate der Multiplikation durch die Rate der Zelltod überholt ist, tritt die Kultur die "Tod-Phase".

Um einer Wachstumskurve zu konstruieren, sind bakterielle Zahlen in einem Kolben der Flüssigkultur über einen bestimmten Zeitraum der Kultivierung zu unterschiedlichen Zeitpunkten gezählt. Bakterielle Grafen erhalten Sie durch eine Reihe von verschiedenen Methoden. Ein gemeinsamer Ansatz ist zu messen optische Dichte- oder "OD" - 600, ist die bakterielle Lösung Absorption von Licht bei einer Wellenlänge von 600 nm.

Eine weitere Methode ist die "CFU" oder Kolonie Bildenden Einheiten pro Milliliter der Kultur bestimmen. Aufgrund der klonalen Bakterienwachstum kann ein Bakterium in einer Kultur theoretisch in einem beobachtbaren Kolonie auf einer Nährbodenplatte expandieren. Durch eine Reihe von Verdünnungen eine Bakterienkultur Ausplattieren um eine bakterielle Konzentration zu erreichen, wo einzelne, diskrete Kolonien werden beobachtet, eine Methode namens "serielle Verdünnung Plating", die Anzahl der Kolonie kann verwendet werden, um die Bakterienkonzentration im Hinblick auf die KBE pro mL zurück zu berechnen.

Nun, da Sie verstehen wie Bakterienwachstum analysiert werden kann, gehen wir durch ein Protokoll für die Durchführung von Wachstum Kurvenanalyse auf Reinkulturen eines etablierten bakterielle Modells, Escherichia coli, die serielle Verdünnung plating-Methode verwenden.

Einen Tag vor der Zeit Punkt Sammlung, 20 mL vorsterilisierten Trypticase-Soja-Bouillon oder TSB, Medium in eine 50-mL-Flasche mit einer einzigen Kolonie von E. Colizu impfen.

Inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 37 ° C mit schütteln. Für E. Coli, würde dadurch in einer stationären Phase-Population von etwa 109 KBE/mL.

Impfen Sie am nächsten Tag 100 μL der Übernacht-Kultur in 250 mL TSB in einen 500-mL-Kolben. Mischen Sie gründlich. Dadurch entsteht eine verdünnte Kultur von ca. 4 x 105 KBE/mL. 5 mL dieser verdünnten Kultur in ein Kultur-Rohr zu speichern. Dies ist die Aliquote vom Zeitpunkt 0 oder T0. Kühlen Sie sofort bei 4 ° C.

Inkubieren Sie das restliche Volumen der Kultur bei 37 ° C mit schütteln. Zu jeder Stunde danach für bis zu 8 h sammeln Sie 5-mL-aliquoten aus der Kultur. Benennen Sie diese Proben T1 bis T8, und speichern Sie alle von ihnen bei 4 ° C bis zur Verwendung.

Am Tag des Experiments nehmen Sie die E. Coli Zeitpunkt Aliquote aus dem Kühlschrank und halten sie auf dem Eis. Verwenden Sie sterile Microfuge Röhren, jeweils mit 900 μl steriler Kochsalzlösung zum Einrichten einer Verdünnungsreihe für jedes aliquoten gemäß der folgenden Tabelle.

Mix T0 Kultur gut durch sanft aufschütteln, fügen 100 μL Rohr A seine Verdünnungsreihen, machen eine 1-in-10 oder 10-1 Verdünnung. Vortex Rohr A zu mischen und mit einem frischen Pipettenspitze 100 μL der Schlauch A hinzufügen Rohr B, so dass die 1 100 oder 10-2 Verdünnung.

Wiederholen Sie den Vorgang für jede Kultur aliquoten und stellen Sie die entsprechenden Verdünnungsreihen nach Tabelle 2. Sobald der Verdünnungsreihe für alle Zeitpunkt Proben vorgenommen wurden, müssen Sie die entsprechende Anzahl von sterilen Trypticase-Soja Agarplatten für bakterielle Beschichtung vorbereitet.

3 Verdünnungen der jeweiligen Zeit-Punkt-Kultur werden in dreifacher Ausfertigung gemäß der folgenden Tabelle überzogen. Beschriften Sie die Platten entsprechend. Dann pipette 100 μL jeder entsprechend verdünnten Kultur in die Mitte des jeweiligen Nährbodenplatte. Flamme-sterilisieren "L"-förmige Glasstab kühl durch die Rute auf dem Agar entfernt das Inokulum berühren und sofort die Flüssigkeit über die Agar-Oberfläche verteilt. Bitte beachten Sie, dass eine Verzögerung bei der Verbreitung von bakterielle Überwucherung an der Stelle der Inokulation führen könnte.

Weiter Beschichtung jeder Verdünnungsreihen für alle 9 Zeit Punkt Kulturen, Flamme-Sterilisierung des Glases, die Rute zwischen den einzelnen Serien Verdünnung zu verbreiten.

Sobald die Platten erlaubt haben, ein paar Minuten trocknen lassen, drehen Sie und legen Sie sie über Nacht in den Inkubator 37 ° C. Nach dieser Zeit des Wachstums können Platten bei 4 ° c gelagert werden

Untersuchen sie nach der Übernachtung Inkubation der Verdünnung Platten für Verunreinigungen und Einheitlichkeit der Kolonien. Punkt für jedes Mal Kultur, wählen Sie eine Verdünnung für die gibt es zwischen 30-300 Kolonien pro Platte. Die Anzahl der Kolonien auf jedem der dreifacher Platten für die Verdünnung.

Berechnen Sie die mittlere Anzahl der Kolonien für jede Verdünnung und den Verdünnungsfaktor verwenden, die Konzentration von Bakterien in der ursprünglichen Kultur zu jedem Zeitpunkt in KBE/mL. Beispielsweise würde gibt es im Durchschnitt 30 Kolonien aus der dreifacher Platte Satz von 0,1 mL 10-4oder 1 in 10.000, Verdünnung, dann es 30 von 0,1 mL multipliziert mit 10.000 oder 3 Millionen KBE/mL aufgeteilt werden.

Mit Hilfe der Bakterienkonzentration berechnet für jeden Zeitpunkt, zeichnen ein Diagramm der Logarithmus Base-10 die Bakterienkonzentration in KBE/mL, gegen die Zeit in Stunden. Aus dem Diagramm die Log-Phase des Wachstums von der ursprünglichen Bakterienkultur identifizieren und wählen Sie zwei von den Zeitpunkten innerhalb der Log-Phase, Benennung der ersteres der diese Zeitpunkte als t = 0. Berechnen Sie die mittlere Generationszeit unter Verwendung der Gleichung X ist gleich 2 hoch n multipliziert mit X0 , wobei X die Bakterienkonzentration zum Zeitpunkt t, X0 ist, ist die Ausgangskonzentration bei t = 0, und n ist die Anzahl von Generationen, die zwischen den beiden vergangen ist Zeit Punkte.

Z. B. angenommen, X0 1.000 KBE/mL ist, und bei t = 6 h, die Konzentration beträgt 16.000 KBE/mL. Unter Verwendung der Gleichung, erhalten wir, dass innerhalb von 6 h 4 Generationen aufgetreten sind, verleiht eine Generationszeit von 6 geteilt durch 4 oder 1,5 h pro Generation.

Messung von Bakterienwachstum Kinetik ist grundlegend für viele Anwendungen für Forschung, Landwirtschaft oder Bioingenieurwesen Zwecke.

Eine Verwendung für das bakterielle Wachstum wissen ist erlauben eine genaue Menge an eine Bakterienkultur eingeholt werden, um eine andere Kultur oder Medium zu impfen. Beispielsweise müssen bestimmte Kulturen, wie Hülsenfrüchte, mit symbiontischen Bakterien bekannt als Rhizobien angebaut werden, die die Pflanzen Wurzeln in Form Knötchen zu kolonisieren und "fix" Stickstoff - Umwandlung von atmosphärischem Stickstoff in Ammoniak, die von der Pflanze genutzt werden können. Für landwirtschaftliche Anwendungen wird eine bekannte Menge von Rhizobien Torf-basierten Carbon Medium, hinzugefügt, die dann verwendet wird, Leguminosen-Samen um die Pflanze-bakterielle Symbiose herzustellen zu impfen.

Wachstum Analyse kann auch zur bakteriellen Spezies zu identifizieren, die erniedrigen Industrieabfälle und möglicherweise wertvolle Nebenprodukte erzeugen können. In diesem Beispiel untersuchten Forscher, wie Wachstumsmedien ergänzt mit Schwarzlauge, ein Abfallprodukt aus Holz zerdrücken und Papierherstellung, das Wachstum der Umwelt mikrobielle Isolat betroffen.

Die Bakterien nicht nur verbesserte Wachstum mit Schwarzlauge gezeigt, sondern zeigte auch ein "zweiphasigen" Wachstumsmuster, auf das Vorhandensein von mehr als einer Kohlenstoffquelle in Schwarzlauge, die die Bakterien verstoffwechseln können. Einzelne Komponenten der Schwarzlauge könnte dann ausführlichere Wachstum Analyse extrahiert wurden.

Wachstum Messungen eignen sich schließlich auch für die Charakterisierung von Bakterien, die für bestimmte industrielle Zwecke, z. B. für Sanierung der Ölverschmutzung entwickelt haben. Hier entstehen Wissenschaftler gentechnisch Bakterienstämme, die Enzyme um die Kohlenwasserstoff-Komponenten des Öls erniedrigen enthalten. Z. B. wurde Wachstum Analyse durchgeführt, um sicherzustellen, dass die veränderten Bakterien gestiegen Wachstumsrate als normalen Bakterien im Beisein der giftige Kohlenwasserstoffe, verbesserte Toleranz, mit denen die veränderten Bakterien ihre Verschmutzung Bereinigung Aufgabe angibt.

Sie haben nur Jupiters Video auf die Analyse bakterieller Wachstumsraten mit Wachstumskurven angesehen. Sie sollten jetzt verstehen die unterschiedlichen Wachstumsphasen der Bakterienkulturen, gewusst wie: führen Sie ein Experiment, um einer Wachstumskurve mit Punkt Zeitgebühr und serielle Verdünnung Überzug zu erhalten und wie Wachstum Analyse, Forschung und industrielle Zwecke angewendet werden kann. Wie immer vielen Dank für das ansehen!

Results

Im Anschluss an eine serielle Verdünnung plating-Experiment wurde folgenden Daten erhalten. Zu Beginn des exponentiellen Wachstums bezeichnet hier als Zeitpunkt t = 0, die Ausgangskonzentration von Bakterienzellen ist 1.000 KBE/mL. Zum Zeitpunkt t = 6 h, die Konzentration der Zellen ist 16.000 KBE/mL.

Nun, X = 2n X X0

Wo: X0 = Anfangskonzentration der Zellen = 1.000 KBE/mL
X = Konzentration der Zellen nach der Zeit t = 16.000 KBE/mL
n = Anzahl der Generationen
16.000 = 2n X 1,000
2n = 16
Melden Sie sich10 2n = Log10 16
n x 0.301 = 1.204
n = 1.204 = 4
0.301

Vier Generationen für 6 h, also abgelaufen

Meine Generationszeit = 6/4 = 1.5 h.

Figure 4
Abbildung 4. Ein Stamm-Knötchen, die Stickstoff-fixierenden Bakterien enthält.

Applications and Summary

Kenntnisse von Bakterienwachstum Kinetik und bakterielle Zahlen in einem Nährmedium ist aus einer Forschungs- und kommerzieller Sicht wichtig. In der Forschung ist es oft wichtig zu wissen, die Anzahl der Bakterien in einer Probe, also Experiments kann, repliziert werden wenn nötig, mit den exakten gleichen Zahlen. Zum Beispiel während der Experimente in denen bakterielle Impfkulturen auf einem Grundstück von Boden, ein Minimum von 104 KBE pro Gramm Boden um den gewünschten Effekt, wie verstärkten Abbau von Schadstoffen im giftigen organischen Boden hinzugefügt werden muss hinzugefügt werden. Ein weiteres Beispiel ist der Fall des kommerziell produzierten rhizobial Inokula, wo bekannte Rufnummern der Rhizobien (Bakterien, die symbiotische Beziehungen mit den Wurzeln der Pflanzen eingehen) in ein Torf-basierten Carbon Medium (Abbildung 4) imprägniert sind. Das Medium wird dann verwendet, um Leguminosen-Samen zur Verbesserung der biologischen Stickstofffixierung (d.h. die Umwandlung von molekularem Stickstoff in organischen Formen, die von Organismen als Nährstoffe verwendet werden können) zu impfen.

Wachstum-Kinetik ist auch nützlich für die Beurteilung, ob bestimmte Bakterienstämme angepasst werden, um bestimmten Substraten, wie z. B. Industrieabfälle oder Ölverschmutzung zu metabolisieren. Bakterien, die gentechnisch, zur Reinigung von Ölverschmutzungen verändert sind, können beispielsweise angebaut werden, im Beisein von komplexen Kohlenwasserstoffen um sicherzustellen, dass ihr Wachstum durch die toxische Wirkung des Öls nicht unterdrückt werden würde. Ebenso können die Neigung und die Form der Wachstumskurven aus Bakterien gewachsen mit einer Mischung aus industriellen Abfallprodukten produziert Wissenschaftler informieren, ob die Bakterien enthaltenen Substanz verstoffwechseln können, und wie viele potentielle Energie-Quellen für die Bakterien in der Abfall-Mischung zu finden.

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1. Erhebung der Bakterienkultur Aliquote

  1. Impfen Sie einen Tag vor der Abholung von Wachstum Zeitpunkten 20 mL Trypticase-Soja Brühe (TSB) Medium in eine 50-mL-Flasche mit E. Coli.
  2. Inkubation über Nacht bei 27 ° C. Diese relativ langen Inkubationszeit führt zu einer stationären Phase Bevölkerung von Wildtyp E. Coli von ca. 109 KBE/mL.
  3. Am nächsten Tag verwenden Sie 100 µL der vorbereiteten Kultur 250 mL TSB (in einen 500-mL-Kolben) zu impfen. Mischen Sie gründlich.  Eine 5-mL-aliquoten zu entfernen und in den Kühlschrank sofort bei 4 ° C. Dies ist T = 0 oder T0 Zeitpunkt, und sollte ca. 4 x 105 KBE/mL enthalten.
  4. Legen Sie den Kolben des verbleibenden E. Coli (245 mL) in einem 37 ° C Inkubator schütteln. 5-mL-aliquoten Kultur stündlich zu entfernen, bis zu 8 h. speichern jedes aliquoten bei 4 ° C. Benennen Sie diese Aliquote T1 bis T8.

2. serielle Verdünnung

  1. Aliquote von E. Coli aus dem Kühlschrank und auf Eis für den Transport zu entfernen. Halten Sie alle Kulturen auf Eis bis zur Verwendung.
  2. Richten Sie eine Reihe von Verdünnung Rohren zu verschiedenen Verdünnungen der jeweiligen E. Coli -Kultur (Abbildung 3). Microfuge Röhren eignen sich für diese Funktion. Jedes Rohr Verdünnung sollten 900 µL Verdünnung Flüssigkeit (sterile Kochsalzlösung) haben. Eine Verdünnungsreihe ist erforderlich für jede Kultur E. Coli (T0 bis T8); Beschriften Sie jedes Rohr nach Tabelle 2.
    Figure 3
    Abbildung 3. Schaltplan zeigt das Verfahren für die Beschichtung von E. Coli.
  3. Verdünnungen durch Zugabe von 100 µL von E. Coli aus der Tube mit der Bezeichnung T0 beginnen (die ursprüngliche E. Coli Kultur) Rohr A, die die 10-1 Verdünnung T0ist. Wirbel der Röhre für 5 s.
  4. Anschließend fügen Sie 100 µL Rohr A an das nächste Rohr der Saline, Rohr B hinzu, die die 10-2 Verdünnung T0. Die notwendige Verdünnung-Serie für jede Zeitpunkt aliquoten weiter. Denken Sie daran, Wirbel jedes Rohr vor der Übertragung. Es ist auch wichtig, eine neue Pipettenspitze für jede Übertragung zu verwenden.
E. Coli -Kultur Verdünnungen erforderlich und Tube #
A B C D E F G
T0 10-1 10-2
T1 10-1 10-2
T2 10-1 10-2 10-3
T-3 10-1 10-2 10-3 10-4
T4 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
T5 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
T6 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7
T-7 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
T-8 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

Tabelle 2. Verdünnungsreihen notwendig für jede E. Coli -Kultur.

3. Beschichtung

  1. Drei Verdünnungen für jedes E. Coli Kultur Zeitpunkt aliquoten werden gemäß Tabelle 3überzogen werden. Label-Platten mit der Zeitpunkt (T1 bis T-8), den Verdünnungsfaktor und Volumen hinzugefügt werden. Verwenden Sie dreifacher Platten für jede Verdünnung.
  2. Die Platte fügen Sie 100 µL jeder Verdünnung durch Pipettieren des Betrags in die Mitte der Agarplatte (Abbildung 3 hinzu). Sofort verbreiten sterilisiert die aliquoten durch den Einsatz einer Flamme "L"-förmige Glasstab. Wenn die aliquoten nicht sofort verteilt ist, Sorben es in Situ auf der Platte, wodurch bakterielle Überwucherung an der Stelle der ersten Impfung.
  3. Wiederholen Sie die Beschichtung für jedes Verdünnungsreihe zur Zeit Punkte T1 bis T8. Denken Sie daran, die Rute zwischen den Platten und vor allem zwischen verschiedenen Verdünnungen zu sterilisieren.
  4. Sobald Platten für ein paar Minuten getrocknet haben, umdrehen und über Nacht bei 37 ° C Inkubator legen. Invertieren der Platten Kondensation auf der Agarplatte fallen entgegen. Platten sollten nach Inkubation über Nacht im Kühlschrank gelagert werden.
E. coli Kultur Verdünnungen, beschichtet werden
T0 10-1 10-2 10-3
T1 10-1 10-2 10-3
T2 10-2 10-3 10-4
T-3 10-3 10-4 10-5
T4 10-4 10-5 10-6
T5 10-5 10-6 10-7
T6 10-6 10-7 10-8
T7 * 10-5 10-6 10-7
T8 * 10-4 10-5 10-6

* Niedrigere Verdünnungen berücksichtigen geringere Populationen durch Tod Phase.

Tabelle 3. Protokoll für E. Coli Kulturen plating.

4. zählen Kolonien und mittlere Generationszeit rechnen

  1. Platten für Einheitlichkeit der Kolonien und Mangel an Kontamination zu untersuchen.
  2. Wählen Sie für jeden Zeitpunkt (T0 bis T8) eine Verdünnung, die zwischen 30 und 300 Kolonien und Graf dreifacher Platten enthält.
  3. Berechnen Sie mit Hilfe den Verdünnungsfaktor, Rücken-die Anzahl der Zellen pro mL der ursprünglichen Kultur auf Zeit Punkte T0 bis T8. Zum Beispiel, wenn die Anzahl der Kolonien, die aus einer 10-4 Verdünnung 30, 28 und 32:
    Mittlere Anzahl der Kolonien = 30 Kolonien
    Diese entstand aus 0,1 mL einer 10-4 Verdünnung
    Anzahl der Kolonien pro mL = 30 x 104 = 3 x 106
  4. Plot-Log10 KBE/mL im Vergleich zur Zeit (in Stunden).
  5. Aus dem Diagramm ermitteln der exponentiellen Wachstumsphase. Mit 2 Zeitpunkten innerhalb der exponentiellen Wachstumsphase und die entsprechende Zelle Zahlen zu jedem Zeitpunkt, berechnen Sie die mittlere Generationszeit.

Die Wachstumsrate der Bakterien zu messen ist eine grundlegende Technik, mikrobiologische und hat weit verbreiteten Einsatz in der Grundlagenforschung als auch landwirtschaftliche und industrielle Anwendungen.

Bakterien sind unter den am häufigsten vorkommenden Lebensformen auf der Erde anwesend in jedem Ökosystem des menschlichen Körpers inklusive. Bestimmte Bakterienarten sind auch genetisch sehr gefügig und haben als Forschungsmodelle oder natürlichen oder synthetischen Produkten im industriellen Maßstab genutzt wurde. Allerdings können nicht alle Bakterienarten im Labor kultiviert werden. Für diejenigen, die können, ist ein wichtiges Merkmal der Multiplikation oder "Wachstum Kinetik".

Messung eine Bakterienkultur Wachstumsrate kann informieren Wissenschaftler über ihre physiologische und metabolische Funktionen und ist auch nützlich, um eine exakte Zellzahl der Bakterien für downstream-Anwendungen.

Dieses Video wird einzuführen, die Prinzipien hinter Bakterienwachstum Rate Analyse, ein Protokoll zur Charakterisierung Wachstumsrate mit einer "Wachstumskurve" zu demonstrieren und schließlich beschäftigen mehrere Umweltwissenschaften Anwendungen zur Messung von Bakterienwachstum Kinetik.

Bakterien vermehren in der Regel ungeschlechtlich, Multiplikation mit einfachen binären Kernspaltung wo eine elterliche Zelle teilt sich in zwei identische Tochterzellen. Unter günstigen Wachstumsbedingungen, wo Nährstoffe in Hülle und Fülle und Umweltparametern vorhanden sind, wie z. B. Temperatur sind alle förderlich für Wachstum, übertrifft die Rate der Multiplikation die Sterberate. Dies führt zu exponentiellem Wachstum.

Durch die Messung der Menge der Bakterien in einer Kultur als Funktion der Zeit, erhalten Sie eine Wachstumskurve. Wachsenden Bakterien in einer flüssigen Kultur unter optimalen Bedingungen produziert eine Wachstumskurve mit eine charakteristische Form, die in verschiedene Phasen unterteilt werden kann. Die Kurve beginnt mit einer "Lag-Phase", als Wachstum langsam ist, während die Bakterien, die Kulturbedingungen eingewöhnt werden. Als nächstes ist die "Protokoll" oder "exponentielle Phase", wenn die Bakterien exponentielles Wachstum erleben. Wachstum Stände schließlich einmal Nährstoffe aufgebraucht werden und Schlacken ansammeln, was zu einer "stationären Phase". Schließlich, sobald die Rate der Multiplikation durch die Rate der Zelltod überholt ist, tritt die Kultur die "Tod-Phase".

Um einer Wachstumskurve zu konstruieren, sind bakterielle Zahlen in einem Kolben der Flüssigkultur über einen bestimmten Zeitraum der Kultivierung zu unterschiedlichen Zeitpunkten gezählt. Bakterielle Grafen erhalten Sie durch eine Reihe von verschiedenen Methoden. Ein gemeinsamer Ansatz ist zu messen optische Dichte- oder "OD" - 600, ist die bakterielle Lösung Absorption von Licht bei einer Wellenlänge von 600 nm.

Eine weitere Methode ist die "CFU" oder Kolonie Bildenden Einheiten pro Milliliter der Kultur bestimmen. Aufgrund der klonalen Bakterienwachstum kann ein Bakterium in einer Kultur theoretisch in einem beobachtbaren Kolonie auf einer Nährbodenplatte expandieren. Durch eine Reihe von Verdünnungen eine Bakterienkultur Ausplattieren um eine bakterielle Konzentration zu erreichen, wo einzelne, diskrete Kolonien werden beobachtet, eine Methode namens "serielle Verdünnung Plating", die Anzahl der Kolonie kann verwendet werden, um die Bakterienkonzentration im Hinblick auf die KBE pro mL zurück zu berechnen.

Nun, da Sie verstehen wie Bakterienwachstum analysiert werden kann, gehen wir durch ein Protokoll für die Durchführung von Wachstum Kurvenanalyse auf Reinkulturen eines etablierten bakterielle Modells, Escherichia coli, die serielle Verdünnung plating-Methode verwenden.

Einen Tag vor der Zeit Punkt Sammlung, 20 mL vorsterilisierten Trypticase-Soja-Bouillon oder TSB, Medium in eine 50-mL-Flasche mit einer einzigen Kolonie von E. Colizu impfen.

Inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 37 ° C mit schütteln. Für E. Coli, würde dadurch in einer stationären Phase-Population von etwa 109 KBE/mL.

Impfen Sie am nächsten Tag 100 μL der Übernacht-Kultur in 250 mL TSB in einen 500-mL-Kolben. Mischen Sie gründlich. Dadurch entsteht eine verdünnte Kultur von ca. 4 x 105 KBE/mL. 5 mL dieser verdünnten Kultur in ein Kultur-Rohr zu speichern. Dies ist die Aliquote vom Zeitpunkt 0 oder T0. Kühlen Sie sofort bei 4 ° C.

Inkubieren Sie das restliche Volumen der Kultur bei 37 ° C mit schütteln. Zu jeder Stunde danach für bis zu 8 h sammeln Sie 5-mL-aliquoten aus der Kultur. Benennen Sie diese Proben T1 bis T8, und speichern Sie alle von ihnen bei 4 ° C bis zur Verwendung.

Am Tag des Experiments nehmen Sie die E. Coli Zeitpunkt Aliquote aus dem Kühlschrank und halten sie auf dem Eis. Verwenden Sie sterile Microfuge Röhren, jeweils mit 900 μl steriler Kochsalzlösung zum Einrichten einer Verdünnungsreihe für jedes aliquoten gemäß der folgenden Tabelle.

Mix T0 Kultur gut durch sanft aufschütteln, fügen 100 μL Rohr A seine Verdünnungsreihen, machen eine 1-in-10 oder 10-1 Verdünnung. Vortex Rohr A zu mischen und mit einem frischen Pipettenspitze 100 μL der Schlauch A hinzufügen Rohr B, so dass die 1 100 oder 10-2 Verdünnung.

Wiederholen Sie den Vorgang für jede Kultur aliquoten und stellen Sie die entsprechenden Verdünnungsreihen nach Tabelle 2. Sobald der Verdünnungsreihe für alle Zeitpunkt Proben vorgenommen wurden, müssen Sie die entsprechende Anzahl von sterilen Trypticase-Soja Agarplatten für bakterielle Beschichtung vorbereitet.

3 Verdünnungen der jeweiligen Zeit-Punkt-Kultur werden in dreifacher Ausfertigung gemäß der folgenden Tabelle überzogen. Beschriften Sie die Platten entsprechend. Dann pipette 100 μL jeder entsprechend verdünnten Kultur in die Mitte des jeweiligen Nährbodenplatte. Flamme-sterilisieren "L"-förmige Glasstab kühl durch die Rute auf dem Agar entfernt das Inokulum berühren und sofort die Flüssigkeit über die Agar-Oberfläche verteilt. Bitte beachten Sie, dass eine Verzögerung bei der Verbreitung von bakterielle Überwucherung an der Stelle der Inokulation führen könnte.

Weiter Beschichtung jeder Verdünnungsreihen für alle 9 Zeit Punkt Kulturen, Flamme-Sterilisierung des Glases, die Rute zwischen den einzelnen Serien Verdünnung zu verbreiten.

Sobald die Platten erlaubt haben, ein paar Minuten trocknen lassen, drehen Sie und legen Sie sie über Nacht in den Inkubator 37 ° C. Nach dieser Zeit des Wachstums können Platten bei 4 ° c gelagert werden

Untersuchen sie nach der Übernachtung Inkubation der Verdünnung Platten für Verunreinigungen und Einheitlichkeit der Kolonien. Punkt für jedes Mal Kultur, wählen Sie eine Verdünnung für die gibt es zwischen 30-300 Kolonien pro Platte. Die Anzahl der Kolonien auf jedem der dreifacher Platten für die Verdünnung.

Berechnen Sie die mittlere Anzahl der Kolonien für jede Verdünnung und den Verdünnungsfaktor verwenden, die Konzentration von Bakterien in der ursprünglichen Kultur zu jedem Zeitpunkt in KBE/mL. Beispielsweise würde gibt es im Durchschnitt 30 Kolonien aus der dreifacher Platte Satz von 0,1 mL 10-4oder 1 in 10.000, Verdünnung, dann es 30 von 0,1 mL multipliziert mit 10.000 oder 3 Millionen KBE/mL aufgeteilt werden.

Mit Hilfe der Bakterienkonzentration berechnet für jeden Zeitpunkt, zeichnen ein Diagramm der Logarithmus Base-10 die Bakterienkonzentration in KBE/mL, gegen die Zeit in Stunden. Aus dem Diagramm die Log-Phase des Wachstums von der ursprünglichen Bakterienkultur identifizieren und wählen Sie zwei von den Zeitpunkten innerhalb der Log-Phase, Benennung der ersteres der diese Zeitpunkte als t = 0. Berechnen Sie die mittlere Generationszeit unter Verwendung der Gleichung X ist gleich 2 hoch n multipliziert mit X0 , wobei X die Bakterienkonzentration zum Zeitpunkt t, X0 ist, ist die Ausgangskonzentration bei t = 0, und n ist die Anzahl von Generationen, die zwischen den beiden vergangen ist Zeit Punkte.

Z. B. angenommen, X0 1.000 KBE/mL ist, und bei t = 6 h, die Konzentration beträgt 16.000 KBE/mL. Unter Verwendung der Gleichung, erhalten wir, dass innerhalb von 6 h 4 Generationen aufgetreten sind, verleiht eine Generationszeit von 6 geteilt durch 4 oder 1,5 h pro Generation.

Messung von Bakterienwachstum Kinetik ist grundlegend für viele Anwendungen für Forschung, Landwirtschaft oder Bioingenieurwesen Zwecke.

Eine Verwendung für das bakterielle Wachstum wissen ist erlauben eine genaue Menge an eine Bakterienkultur eingeholt werden, um eine andere Kultur oder Medium zu impfen. Beispielsweise müssen bestimmte Kulturen, wie Hülsenfrüchte, mit symbiontischen Bakterien bekannt als Rhizobien angebaut werden, die die Pflanzen Wurzeln in Form Knötchen zu kolonisieren und "fix" Stickstoff - Umwandlung von atmosphärischem Stickstoff in Ammoniak, die von der Pflanze genutzt werden können. Für landwirtschaftliche Anwendungen wird eine bekannte Menge von Rhizobien Torf-basierten Carbon Medium, hinzugefügt, die dann verwendet wird, Leguminosen-Samen um die Pflanze-bakterielle Symbiose herzustellen zu impfen.

Wachstum Analyse kann auch zur bakteriellen Spezies zu identifizieren, die erniedrigen Industrieabfälle und möglicherweise wertvolle Nebenprodukte erzeugen können. In diesem Beispiel untersuchten Forscher, wie Wachstumsmedien ergänzt mit Schwarzlauge, ein Abfallprodukt aus Holz zerdrücken und Papierherstellung, das Wachstum der Umwelt mikrobielle Isolat betroffen.

Die Bakterien nicht nur verbesserte Wachstum mit Schwarzlauge gezeigt, sondern zeigte auch ein "zweiphasigen" Wachstumsmuster, auf das Vorhandensein von mehr als einer Kohlenstoffquelle in Schwarzlauge, die die Bakterien verstoffwechseln können. Einzelne Komponenten der Schwarzlauge könnte dann ausführlichere Wachstum Analyse extrahiert wurden.

Wachstum Messungen eignen sich schließlich auch für die Charakterisierung von Bakterien, die für bestimmte industrielle Zwecke, z. B. für Sanierung der Ölverschmutzung entwickelt haben. Hier entstehen Wissenschaftler gentechnisch Bakterienstämme, die Enzyme um die Kohlenwasserstoff-Komponenten des Öls erniedrigen enthalten. Z. B. wurde Wachstum Analyse durchgeführt, um sicherzustellen, dass die veränderten Bakterien gestiegen Wachstumsrate als normalen Bakterien im Beisein der giftige Kohlenwasserstoffe, verbesserte Toleranz, mit denen die veränderten Bakterien ihre Verschmutzung Bereinigung Aufgabe angibt.

Sie haben nur Jupiters Video auf die Analyse bakterieller Wachstumsraten mit Wachstumskurven angesehen. Sie sollten jetzt verstehen die unterschiedlichen Wachstumsphasen der Bakterienkulturen, gewusst wie: führen Sie ein Experiment, um einer Wachstumskurve mit Punkt Zeitgebühr und serielle Verdünnung Überzug zu erhalten und wie Wachstum Analyse, Forschung und industrielle Zwecke angewendet werden kann. Wie immer vielen Dank für das ansehen!

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