环境样品使用 RT-PCR RNA 分析

Environmental Microbiology

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Overview

资料来源: 实验室的博士伊恩胡椒和博士查尔斯称-亚利桑那大学
演示作者: 布拉德利施密茨

逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR) 涉及常规 PCR 相同的进程 — — 循环温度扩增核酸。然而,虽然常规 PCR 只放大脱氧核糖核酸 (DNA),RT-pcr 技术,使扩增的核糖核酸 (RNA) 形成的互补 DNA (cDNA)。这能使发现内环境要分析的利用方法和技术,为 DNA 设计的基于 RNA 的有机体。

发现环境中的很多病毒利用 RNA 作为它们的遗传物质。几种基于 RNA 病毒病原体,如诺沃克病毒感染,并指示生物,如胡椒轻 (斑驳),病毒并没有量化的文化为基础的检测方法。为了检测这些从土壤、 水、 农业等环境样品中的 RNA 病毒的存在,分子测定技术依靠 RT pcr 技术将 RNA DNA 转化。没有 RT-PCR,微生物学家不能进行分析和研究对人类和环境健康构成威胁的许多基于 RNA 病毒。

RT-pcr 技术也可以作为一种工具用于测量环境中的微生物活动。信使 RNA (mRNA) 是用于蛋白质翻译的单链模板和测量的不同基因水平指示从中微生物被表达在环境中的基因。基因表达分析提供线索于有机体用于什么生物途径在不同环境条件下生存。在某些情况下,可以利用基因表达,以确定的有机体可存活最好的苛刻条件,并有能力为修复被污染的土壤或水。

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JoVE Science Education Database. 环境微生物学精要. 环境样品使用 RT-PCR RNA 分析. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Principles

PCR 基于扩增的 DNA 模板,这会限制其使用在从生物检测 RNA。然而,RT-pcr 技术提供一种手段如何使用 RNA 产生 cDNA 使用专门的酶,称为逆转录酶 (RT)。这 cDNA 然后被用作后续放大与常规 PCR (图 1) 的起始模板。

可以控制反向转录来放大只所需的产品或核酸内环境样品,根据引物,发现整个社会习惯模板 cDNA 合成。这是重要的是,不理想的具体分析的各种核酸与经常饱和土壤和水的样本。随机引物,可以绑定到任何类型的微生物中发现的 RNA 序列,可用于在 RT-PCR 检测大多数 RNA,所以可以进行试样的存在和在环境中的多个有机体的相对丰度。另一方面,序列特异性引物启动只有一个或几个生物中发现的精确序列的 cDNA 合成。这允许环境样品要测试一个特定的目的,例如确定是否诺沃克病毒感染,从而导致胃肠道疾病的人,是目前在水中。


Figure 1
图 1。RT-PCR 分析环境的 RNA 样品的分步过程。

Procedure

<>

1.样品采集: 土壤样品

  1. 发现通过 GPS、 坐标或看到的样品位置。
  2. 对于随机取样,选择去普查的微生物栖息地范围内的随机点。断面采样收集从点沿一条直线,例如,毗邻的河床。网格样品取自点按固定时间间隔,有系统地和可用于映射未知或变量的区域中的微生物群落。
  3. 在 3-6 英寸 (7.5-15 厘米) 内采样深度提供访问是附近,而不是在根际 (土壤直接受植物的根和他们相关的微生物的狭窄区域) 的最丰富的微生物活动。
  4. 若要收集土壤样本,推和手螺旋扭到地面到预定的深度。
  5. 电梯的螺旋。土壤是在螺旋的空心茎内发现的。
  6. 刮进土壤收集袋底部螺旋的土壤。一定不能触摸或污染土壤。
  7. 袋子上贴上正确的位置、 名称、 日期和时间。
  8. 在实验室里,通过一个 2 毫米筛子来删除任何砾石和岩石土壤。
  9. 分析土壤水分含量的土壤的一部分。有关此步骤的详细信息,请参阅朱庇特科学教育视频对土壤水分。

2.样品采集: 水样本

  1. 发现通过 GPS、 坐标或看到的样品位置。
  2. 收集存储瓶里的水。水的体积收集记录;如果定量测定样品中的微生物,然后可以基于收集的体积确定微生物浓度。
  3. 立即测试实验 (温度、 ph 值、 电导率、 盐度、 氮和磷含量等) 所需的任何参数水使用适当的电子探针。
  4. 入加冰冷却器包含水样品瓶的地方。将冷却器转移到实验室。

3.RNA 提取

  1. 收集和集中微生物从环境样品,请参阅向朱庇特科学教育视频社区核酸提取。
  2. 病毒使用按照制造商的说明商业提取工具包中提取 RNA。
  3. 简单地说,首先将样品混合与裂解缓冲液含有酒精,然后加进自旋列的样品。
  4. 离心机在大约 12,000 x g,丢弃通气列。添加到列的洗涤缓冲液和再次离心。
  5. 核糖核酸酶无水添加列和离心机为 30 s 洗脱 RNA 进入无菌 1.5 毫升低附着力微量离心管。

4.反转录-聚合酶链反应

  1. 从-20 ° C 冰箱中检索以下试剂: dNTP,集中 (,10 x) 反向转录缓冲区,引物 (在此示例中,随机引物)。解冻这些冰上或在室温内清洁的罩,并保持他们一次解冻的冰上。也检索的逆转录酶和核糖核酸酶抑制剂,然后放在冰上。
  2. 计算所需,使"主组合"相结合的全部试剂常数之间每个反应的试剂卷 (样品反应见表 1 )。准备足够掌握组合每个样品为阳性对照 (使用已知的成绩单模板) 和消极的控制 (例如,没有逆转录酶,与只有水作为模板,等等) 的反应。在卷中包含额外的 10%。
  3. 组装的主混合 1.5 毫升低附着力微量离心管中。这最小化试剂分子到管的塑料墙的绑定。
  4. 当试剂解冻时,则将计算的卷添加到微量离心管。轻轻地涡和离心前增加每个管。请确保更改吸液管之间添加每个试剂,防止污染。
  5. 所有试剂后已添加,涡和离心机的主的组合,以确保均匀的混合物。试剂把存储在-20 ° c。
  6. 准备和标记 8 管 PCR 条,指定一个管每个样本或控制的反应。
  7. 分装主掺入每个管等体积。然后,添加反应特定组件,如 RNA 提取物。
  8. 安全地到 PCR 地带,带盖,离心机在 minicentrifuge 带管接头,以确保所有液体都收集底部的每个管 (图 2)。
  9. 在热循环仪上安全地地方 PCR 地带。按下,确保管。
  10. 设置热循环仪以运行该程序适合正在使用 RT (样本协议见表 2 )。该程序完成后,管将包含然后可以遭受 PCR 扩增的基因产品。有关详细信息,请参阅在定量 pcr 的朱庇特科学教育视频。直到使用存储 cDNA 在-20 ° C。

Figure 2
图 2。上限的 8 管板条内含主混合和提取物。

试剂 每个 1 反应 (μ L) 卷
10 x RT 缓冲区 2.0
25 x dNTPs 0.8
10 x 随机引物 2.0
Multiscribe 1.0
核糖核酸酶抑制剂 1.0
分子级 H2O 3.2
总容积 10

表 1。RT 主混合成分。

第 1 步 第 2 步 第 3 步 第 4 步
25 ° C,10 分钟 37 ° C,120 分钟 85 ° C,5 分钟 4 ° C ∞

表 2。RT 反应热循环仪程序。

逆转录聚合酶链反应或 RT-pcr 技术,使 RNA 病毒和在环境中的微生物的基因表达检测。

不同细胞生物体从人类细菌,用作它们的遗传物质 DNA,某些病毒会有由 rna 组成,包括许多致病性病毒如流感、 埃博拉病毒和艾滋病病毒的基因组。虽然某些病毒可以通过观察致病性表型开发时,用来感染细胞在细胞培养中的发现,大多数有没有基于文化的表征方法.RT-pcr 技术可以用于高灵敏度检测为这些病毒在环境中的存在。

同时,基于 DNA 基因组的生物"快车"由"转录"他们到信使或"m"RNA,可以然后被"翻译"成蛋白质在细胞中执行酶或构造函数在它们的 DNA 基因组编码的遗传信息。由于微生物应付和适应变化环境下打开或关闭各种遗传通路,RT-pcr 技术可以用来监测这种改变基因的表达可作为潜在的生态系统评估员。

这个视频会在背后 RT-pcr 技术的原则,概述广义的过程来执行这项技术,和最后,检查一些今天在环境微生物学中应用此方法的方法。

有到此过程的两个关键部分: RNA 提取生物样品,其次是其反向转录成 DNA。

RNA 分离涉及通过添加分解脂类和蛋白质,其次是机械破碎洗涤剂的溶胞样品中的细胞。通常从病毒中提取 RNA,则需要添加的蛋白酶,是消化蛋白质的酶,来分解病毒衣壳-形成病毒粒子的外衣艰难的蛋白质。另一方面,当从细胞生物获得 RNA,裂解可能需要处理 DNA 降解酶或 DNAases,以避免下游结果被迷惑的化学结构相似的 DNA 的存在。

然后可以从裂解物中两种方式之一提纯 RNA。在一个方法中,称为酸胍硫氰酸盐-酚-氯仿提取,裂解与混合有机水溶液的混合物,然后离心分离阶段。蛋白质会分成有机相,成云相间,裂解的细胞碎片和核酸进入水相。然后可以收集上层水相,和 RNA 由加法酒精,比如降低核酸的溶解度在水中的异丙醇沉淀。

在基于列的 rna,裂解是与酒精混合,然后通过带有负电荷的树脂,如二氧化硅凝胶过滤列。裂解制备,带正电的离子缓冲形式"盐桥",允许将绑定到树脂的核酸的负电荷的磷酸骨干。所有其他污染物然后被冲走了。核酸是"洗脱"从列使用低盐缓冲或水。由于单链 RNA 具有较少比双链 DNA 的负电荷,它可以被优先洗脱使用的特定浓度的缓冲区。

一旦分离,RNA 被变成更化学稳定的 DNA。科学家利用一种自然由类似艾滋病毒的逆转录病毒编码的酶。这种酶被称为逆转录酶或"RT"。

RT 综合互补或"c"DNA 的核苷酸称为底漆一小段。这底漆可以具有不同的序列,根据实验的目的。例如,可以设计引物有一个特定的序列,以检测特定基因或生物。一旦合成,可以定期 pcr 扩增这"第一股"的 cDNA。

现在,我们已了解的 RT-pcr 技术背后的原则,让我们看看在 RNA 样本,从环境上执行这种技术的协议。

开始执行程序,找到使用 GPS 坐标或视力的样本集合位置。选择区域得到概况的微生物栖息地内随机点。

若要收集固体样品,推和手螺旋扭曲成地面土壤到预定的深度。螺旋吊起后,可以在螺旋的空心茎内发现土壤。

这种土壤刮直接进入土壤收集袋,袋标有位置、 名称、 日期、 时间的收集和任何其他必要的资料。

转移到实验室土壤和土壤通过 2 毫米筛子用删除砾石和岩石。分析样品的土壤水分含量,可以丰富对土壤微生物活性的水平。要执行此操作,请参阅此集合的视频"测定水分含量的土壤"。

水样采集,选择类似于土壤集合,感兴趣的站点和收集到壁增厚的无菌塑料瓶的水。注意收集的水的体积。参数的试验水立即喜欢温度、 ph 值、 盐度,可以提供有关预期微生物级别样品中的重要信息。然后,将瓶子放在冷却器和转移到实验室。

病毒等微生物是收集和集中从环境样品。

可以从收集到的病毒提取 RNA,使用商业 RNA 提取试剂盒根据制造商的指示旋转柱法。裂解缓冲液,辅以乙醇,首先被混合样品。将相应数量的自旋列放入集合管,然后应用到列矩阵样品。离心机在大约 12,000 x g 1-2 分钟让核酸绑定到列中,并丢弃液体流通过列。

添加到列的洗涤缓冲液和再次离心。将列放入新的无菌 1.5 毫升低附着微量离心管。然后,添加水是免费的核酸酶,是一种酶降解 RNA,为列和离心机为 30 s,以洗脱 RNA。洗脱的 RNA 可以直到使用存储在-80 ° C。

在实验开始之前应以便发现感兴趣,可以作为标记物的特定微生物存在的序列设计适当的引。

拿出 RT 试剂储存在-20 ° C,和解冻冷冻的试剂在冰上 (或在室温)。这些包括核苷酸、 反向转录缓冲区和引物。一旦解冻,保持试剂对冰;核糖核酸酶抑制剂与逆转录酶,应始终保持在冰上。

虽然试剂正在解冻,计算量和反应的组分浓度。一旦融解试剂,轻轻涡和自旋每个管,以确保内容是混合均匀。

在层流罩,以避免污染,将在主的混合将添加到每个 PCR 管组件组装工作。装配时混合在离心管中的,请确保更改吸液管之间每个试剂,防止污染。所有试剂已都添加到离心管后,轻轻地涡和主人降速混合管以确保均匀的混合物。

标记一组 PCR 管,确保使其包含控件。分装主掺入每个管等体积。然后,添加反应特定组件,如 RNA 提取物或水为阴性对照。

一旦添加的所有组件,管置于热循环仪中,设置要运行的反向转录程序。CDNA 然后可以受到 PCR 扩增。此步骤的详细说明,请参阅此集合的视频聚合酶链反应。

聚合酶链反应完成后,PCR 产物的一些可以被分离并可视化在琼脂糖凝胶上。例如,基因特异性引物在这里用于检测存在的一种 RNA 病毒。从 RT-PCR 反应,但不是能从阴性对照,表明存在这种病毒在被测水样品,得到预期大小的乐队。

基于 RNA 的微生物 RT pcr 鉴定可以分析的生态健康、 环境风险和保护生物多样性。

微生物,清理烃和溶剂从被污染的土壤和水的使用表示基础修复替代。了解本机微生物基因的表达,可以突出显示分解污染物在这些条件下的特定微生物途径。RT-pcr 技术经常被用来放大这种环境样品中的 mRNA。

公共卫生措施往往需要快速监视的环境中感染的病毒来源。禽流感,例如,具有高度传染性,可以迅速蔓延到家禽、 牲畜、 和甚至人类。在此特定示例中,研究人员寻找由野生鸟类传播禽流感的威胁。

他们使用一种便携式 RT-pcr 技术安装程序和设备,筛选出野生鸟类,即使在偏远的地区,早期检测感染和防止传输范围。

最后,RT-pcr 技术可以用于表征"生物农药"正在制定目标害虫如玻璃翅的神枪手, Homalodisca 蛹,主机为一种疾病,严重损害了在北美地区的葡萄藤。作为一个代理来感染这种昆虫正在制定新颖的单链 RNA 病毒。使用Homalodisca细胞培养和 RT-pcr 技术确认的病毒载量的组合,这些作者们能够传播病毒用作生物控制剂的浓度高。

你刚看了朱庇特的简介 Analyzing RNA-Based 环境生物 RT-PCR 法检测。你现在应该明白议定书 》,背后的理论如何将技术应用于您的研究,和一些它被用在字段中今天的方法。谢谢观赏 !

Results

逆转录-聚合酶链反应完成后,PCR 产物的一些可以被分离并可视化在琼脂糖凝胶 (图 3)。在此示例中,基因特异性引物进行检测的一种 RNA 病毒存在。从两个样品和阳性对照反应,但不是能从阴性对照,表明存在这种病毒在两个水样本,得到预期大小的乐队。

Figure 3
图 3。RT-PCR 产物电泳。M: DNA 大小标记;P: 阳性对照;诺拉: 阴性对照。利用 RNA 从四个水样本的反应被运行在 1、 2、 3 和 5 的车道。

Applications and Summary

RT-pcr 技术是从 RNA 模板创建 cDNA 的必要条件。这使基于 RNA 的微生物是针对 DNA 的分析利用分子检测方法。一旦为原料合成 cDNA,pcr 可以确定基于 RNA 的微生物在环境样品中的存在与否。这进一步使下游的分析,以确定微生物生态学、 健康风险和环境风险。

RT-pcr 技术也可以用于测定 mRNA 作为观察哪些基因在环境中被表达的手段。本文提供有关哪些蛋白质和途径微生物生存靠特别是环境条件的信息。基因表达分析可以找出那击穿的环境污染物,如碳氢化合物或氯化的溶剂,微生物通路,这些通路的微生物可以用于生物修复。

风险评估纳入 RT-PCR 分析人类和环境健康风险。结合定量 pcr 法 RT 允许 RNA 病毒要枚举内样品,这样人类和环境暴露可以计算为定量微生物风险评估 (QMRA)。

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1.样品采集: 土壤样品

  1. 发现通过 GPS、 坐标或看到的样品位置。
  2. 对于随机取样,选择去普查的微生物栖息地范围内的随机点。断面采样收集从点沿一条直线,例如,毗邻的河床。网格样品取自点按固定时间间隔,有系统地和可用于映射未知或变量的区域中的微生物群落。
  3. 在 3-6 英寸 (7.5-15 厘米) 内采样深度提供访问是附近,而不是在根际 (土壤直接受植物的根和他们相关的微生物的狭窄区域) 的最丰富的微生物活动。
  4. 若要收集土壤样本,推和手螺旋扭到地面到预定的深度。
  5. 电梯的螺旋。土壤是在螺旋的空心茎内发现的。
  6. 刮进土壤收集袋底部螺旋的土壤。一定不能触摸或污染土壤。
  7. 袋子上贴上正确的位置、 名称、 日期和时间。
  8. 在实验室里,通过一个 2 毫米筛子来删除任何砾石和岩石土壤。
  9. 分析土壤水分含量的土壤的一部分。有关此步骤的详细信息,请参阅朱庇特科学教育视频对土壤水分。

2.样品采集: 水样本

  1. 发现通过 GPS、 坐标或看到的样品位置。
  2. 收集存储瓶里的水。水的体积收集记录;如果定量测定样品中的微生物,然后可以基于收集的体积确定微生物浓度。
  3. 立即测试实验 (温度、 ph 值、 电导率、 盐度、 氮和磷含量等) 所需的任何参数水使用适当的电子探针。
  4. 入加冰冷却器包含水样品瓶的地方。将冷却器转移到实验室。

3.RNA 提取

  1. 收集和集中微生物从环境样品,请参阅向朱庇特科学教育视频社区核酸提取。
  2. 病毒使用按照制造商的说明商业提取工具包中提取 RNA。
  3. 简单地说,首先将样品混合与裂解缓冲液含有酒精,然后加进自旋列的样品。
  4. 离心机在大约 12,000 x g,丢弃通气列。添加到列的洗涤缓冲液和再次离心。
  5. 核糖核酸酶无水添加列和离心机为 30 s 洗脱 RNA 进入无菌 1.5 毫升低附着力微量离心管。

4.反转录-聚合酶链反应

  1. 从-20 ° C 冰箱中检索以下试剂: dNTP,集中 (,10 x) 反向转录缓冲区,引物 (在此示例中,随机引物)。解冻这些冰上或在室温内清洁的罩,并保持他们一次解冻的冰上。也检索的逆转录酶和核糖核酸酶抑制剂,然后放在冰上。
  2. 计算所需,使"主组合"相结合的全部试剂常数之间每个反应的试剂卷 (样品反应见表 1 )。准备足够掌握组合每个样品为阳性对照 (使用已知的成绩单模板) 和消极的控制 (例如,没有逆转录酶,与只有水作为模板,等等) 的反应。在卷中包含额外的 10%。
  3. 组装的主混合 1.5 毫升低附着力微量离心管中。这最小化试剂分子到管的塑料墙的绑定。
  4. 当试剂解冻时,则将计算的卷添加到微量离心管。轻轻地涡和离心前增加每个管。请确保更改吸液管之间添加每个试剂,防止污染。
  5. 所有试剂后已添加,涡和离心机的主的组合,以确保均匀的混合物。试剂把存储在-20 ° c。
  6. 准备和标记 8 管 PCR 条,指定一个管每个样本或控制的反应。
  7. 分装主掺入每个管等体积。然后,添加反应特定组件,如 RNA 提取物。
  8. 安全地到 PCR 地带,带盖,离心机在 minicentrifuge 带管接头,以确保所有液体都收集底部的每个管 (图 2)。
  9. 在热循环仪上安全地地方 PCR 地带。按下,确保管。
  10. 设置热循环仪以运行该程序适合正在使用 RT (样本协议见表 2 )。该程序完成后,管将包含然后可以遭受 PCR 扩增的基因产品。有关详细信息,请参阅在定量 pcr 的朱庇特科学教育视频。直到使用存储 cDNA 在-20 ° C。

Figure 2
图 2。上限的 8 管板条内含主混合和提取物。

试剂 每个 1 反应 (μ L) 卷
10 x RT 缓冲区 2.0
25 x dNTPs 0.8
10 x 随机引物 2.0
Multiscribe 1.0
核糖核酸酶抑制剂 1.0
分子级 H2O 3.2
总容积 10

表 1。RT 主混合成分。

第 1 步 第 2 步 第 3 步 第 4 步
25 ° C,10 分钟 37 ° C,120 分钟 85 ° C,5 分钟 4 ° C ∞

表 2。RT 反应热循环仪程序。

逆转录聚合酶链反应或 RT-pcr 技术,使 RNA 病毒和在环境中的微生物的基因表达检测。

不同细胞生物体从人类细菌,用作它们的遗传物质 DNA,某些病毒会有由 rna 组成,包括许多致病性病毒如流感、 埃博拉病毒和艾滋病病毒的基因组。虽然某些病毒可以通过观察致病性表型开发时,用来感染细胞在细胞培养中的发现,大多数有没有基于文化的表征方法.RT-pcr 技术可以用于高灵敏度检测为这些病毒在环境中的存在。

同时,基于 DNA 基因组的生物"快车"由"转录"他们到信使或"m"RNA,可以然后被"翻译"成蛋白质在细胞中执行酶或构造函数在它们的 DNA 基因组编码的遗传信息。由于微生物应付和适应变化环境下打开或关闭各种遗传通路,RT-pcr 技术可以用来监测这种改变基因的表达可作为潜在的生态系统评估员。

这个视频会在背后 RT-pcr 技术的原则,概述广义的过程来执行这项技术,和最后,检查一些今天在环境微生物学中应用此方法的方法。

有到此过程的两个关键部分: RNA 提取生物样品,其次是其反向转录成 DNA。

RNA 分离涉及通过添加分解脂类和蛋白质,其次是机械破碎洗涤剂的溶胞样品中的细胞。通常从病毒中提取 RNA,则需要添加的蛋白酶,是消化蛋白质的酶,来分解病毒衣壳-形成病毒粒子的外衣艰难的蛋白质。另一方面,当从细胞生物获得 RNA,裂解可能需要处理 DNA 降解酶或 DNAases,以避免下游结果被迷惑的化学结构相似的 DNA 的存在。

然后可以从裂解物中两种方式之一提纯 RNA。在一个方法中,称为酸胍硫氰酸盐-酚-氯仿提取,裂解与混合有机水溶液的混合物,然后离心分离阶段。蛋白质会分成有机相,成云相间,裂解的细胞碎片和核酸进入水相。然后可以收集上层水相,和 RNA 由加法酒精,比如降低核酸的溶解度在水中的异丙醇沉淀。

在基于列的 rna,裂解是与酒精混合,然后通过带有负电荷的树脂,如二氧化硅凝胶过滤列。裂解制备,带正电的离子缓冲形式"盐桥",允许将绑定到树脂的核酸的负电荷的磷酸骨干。所有其他污染物然后被冲走了。核酸是"洗脱"从列使用低盐缓冲或水。由于单链 RNA 具有较少比双链 DNA 的负电荷,它可以被优先洗脱使用的特定浓度的缓冲区。

一旦分离,RNA 被变成更化学稳定的 DNA。科学家利用一种自然由类似艾滋病毒的逆转录病毒编码的酶。这种酶被称为逆转录酶或"RT"。

RT 综合互补或"c"DNA 的核苷酸称为底漆一小段。这底漆可以具有不同的序列,根据实验的目的。例如,可以设计引物有一个特定的序列,以检测特定基因或生物。一旦合成,可以定期 pcr 扩增这"第一股"的 cDNA。

现在,我们已了解的 RT-pcr 技术背后的原则,让我们看看在 RNA 样本,从环境上执行这种技术的协议。

开始执行程序,找到使用 GPS 坐标或视力的样本集合位置。选择区域得到概况的微生物栖息地内随机点。

若要收集固体样品,推和手螺旋扭曲成地面土壤到预定的深度。螺旋吊起后,可以在螺旋的空心茎内发现土壤。

这种土壤刮直接进入土壤收集袋,袋标有位置、 名称、 日期、 时间的收集和任何其他必要的资料。

转移到实验室土壤和土壤通过 2 毫米筛子用删除砾石和岩石。分析样品的土壤水分含量,可以丰富对土壤微生物活性的水平。要执行此操作,请参阅此集合的视频"测定水分含量的土壤"。

水样采集,选择类似于土壤集合,感兴趣的站点和收集到壁增厚的无菌塑料瓶的水。注意收集的水的体积。参数的试验水立即喜欢温度、 ph 值、 盐度,可以提供有关预期微生物级别样品中的重要信息。然后,将瓶子放在冷却器和转移到实验室。

病毒等微生物是收集和集中从环境样品。

可以从收集到的病毒提取 RNA,使用商业 RNA 提取试剂盒根据制造商的指示旋转柱法。裂解缓冲液,辅以乙醇,首先被混合样品。将相应数量的自旋列放入集合管,然后应用到列矩阵样品。离心机在大约 12,000 x g 1-2 分钟让核酸绑定到列中,并丢弃液体流通过列。

添加到列的洗涤缓冲液和再次离心。将列放入新的无菌 1.5 毫升低附着微量离心管。然后,添加水是免费的核酸酶,是一种酶降解 RNA,为列和离心机为 30 s,以洗脱 RNA。洗脱的 RNA 可以直到使用存储在-80 ° C。

在实验开始之前应以便发现感兴趣,可以作为标记物的特定微生物存在的序列设计适当的引。

拿出 RT 试剂储存在-20 ° C,和解冻冷冻的试剂在冰上 (或在室温)。这些包括核苷酸、 反向转录缓冲区和引物。一旦解冻,保持试剂对冰;核糖核酸酶抑制剂与逆转录酶,应始终保持在冰上。

虽然试剂正在解冻,计算量和反应的组分浓度。一旦融解试剂,轻轻涡和自旋每个管,以确保内容是混合均匀。

在层流罩,以避免污染,将在主的混合将添加到每个 PCR 管组件组装工作。装配时混合在离心管中的,请确保更改吸液管之间每个试剂,防止污染。所有试剂已都添加到离心管后,轻轻地涡和主人降速混合管以确保均匀的混合物。

标记一组 PCR 管,确保使其包含控件。分装主掺入每个管等体积。然后,添加反应特定组件,如 RNA 提取物或水为阴性对照。

一旦添加的所有组件,管置于热循环仪中,设置要运行的反向转录程序。CDNA 然后可以受到 PCR 扩增。此步骤的详细说明,请参阅此集合的视频聚合酶链反应。

聚合酶链反应完成后,PCR 产物的一些可以被分离并可视化在琼脂糖凝胶上。例如,基因特异性引物在这里用于检测存在的一种 RNA 病毒。从 RT-PCR 反应,但不是能从阴性对照,表明存在这种病毒在被测水样品,得到预期大小的乐队。

基于 RNA 的微生物 RT pcr 鉴定可以分析的生态健康、 环境风险和保护生物多样性。

微生物,清理烃和溶剂从被污染的土壤和水的使用表示基础修复替代。了解本机微生物基因的表达,可以突出显示分解污染物在这些条件下的特定微生物途径。RT-pcr 技术经常被用来放大这种环境样品中的 mRNA。

公共卫生措施往往需要快速监视的环境中感染的病毒来源。禽流感,例如,具有高度传染性,可以迅速蔓延到家禽、 牲畜、 和甚至人类。在此特定示例中,研究人员寻找由野生鸟类传播禽流感的威胁。

他们使用一种便携式 RT-pcr 技术安装程序和设备,筛选出野生鸟类,即使在偏远的地区,早期检测感染和防止传输范围。

最后,RT-pcr 技术可以用于表征"生物农药"正在制定目标害虫如玻璃翅的神枪手, Homalodisca 蛹,主机为一种疾病,严重损害了在北美地区的葡萄藤。作为一个代理来感染这种昆虫正在制定新颖的单链 RNA 病毒。使用Homalodisca细胞培养和 RT-pcr 技术确认的病毒载量的组合,这些作者们能够传播病毒用作生物控制剂的浓度高。

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