Analyse de l’ARN d’échantillons environnementaux par RT-PCR

Environmental Microbiology

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Overview

Source : Laboratoires du Dr Ian poivre et Dr Charles Gerba - Université de l’Arizona
Auteur mettant en évidence : Bradley Schmitz

Réaction en chaîne polymérase transcription inverse (RT-PCR) implique le même processus que la PCR classique — cyclisme température d’amplification des acides nucléiques. Toutefois, alors que la PCR classique ne fait qu’amplifier acides désoxyribonucléiques (ADN), RT-PCR permet l’amplification des acides ribonucléiques (ARN) par le biais de la formation de l’ADN complémentaire (ADNc). Cela permet aux organismes de base d’ARN trouvées dans l’environnement d’être analysés utilisant méthodes et technologies qui sont conçus pour l’ADN.

Beaucoup de virus présents dans l’environnement utilise RNA comme leur matériel génétique. Plusieurs base d’ARN virus pathogènes, tels que les Noroviruset micro-organismes indicateurs, tels que les virus doux de marbrure de poivre (PMMoV), n’ont pas de méthodes de détection basée sur la culture de quantification. Afin de détecter la présence de ces virus à ARN dans des échantillons environnementaux de sol, eau, agriculture, etc., essais moléculaires dépendent de RT-PCR pour convertir RNA dans l’ADN. Sans la RT-PCR, microbiologistes ne serait pas en mesure de dosage et de nombreux virus à base d’ARN qui posent des risques pour la santé humaine et l’environnementale de recherche.

RT-PCR peut également être employé comme un outil pour mesurer l’activité microbienne dans l’environnement. ARN messager (ARNm) est le modèle simple brin pour la traduction des protéines, et la mesure des niveaux d’ARNm différents indique quels gènes dont les microbes sont exprimées au sein de l’environnement. Analyse de l’expression des gènes donne des indices à quelles voies biologiques sont utilisés par les organismes pour survivre dans des conditions environnementales différentes. Dans certains cas, l’expression des gènes peut être utilisée pour déterminer quels organismes peuvent survivent mieux dans des conditions difficiles et ont des capacités pour la biorestauration des sols contaminés ou d’eau.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Essentiels de la microbiologie environnementale. Analyse de l’ARN d’échantillons environnementaux par RT-PCR. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Principles

PCR est basé sur l’amplification des gabarits d’ADN, ce qui limite son utilisation dans la détection de RNA d’organismes. Toutefois, la RT-PCR fournit un moyen d’utilisant l’ARN pour produire le cDNA utilisant des enzymes spécialisées, appelées la transcriptase inverse (RT). Cet ADNc utilisable alors que le modèle de départ pour l’amplification ultérieure avec la PCR classique (Figure 1).

La transcription inverse peut être contrôlée pour amplifier uniquement les produits désirés ou une communauté entière d’acides nucléiques, trouvé dans un échantillon environnemental, selon les amorces qui sont utilisés pour modèle la synthèse de cDNA. C’est important, car les échantillons de sol et l’eau sont souvent saturées avec de divers acides nucléiques qui ne sont pas souhaitées pour des analyses spécifiques. Amorces aléatoires, ce qui peuvent lier des séquences d’ARN dans n’importe quel type de microbes, peuvent être utilisés par RT-PCR pour détecter l’ARN plus, donc l’échantillon peut être analysé pour la présence et l’abondance relative de plusieurs organismes dans l’environnement. En revanche, amorces spécifiques de séquence initient la synthèse de cDNA pour des séquences précises dans seulement un ou plusieurs organismes. Cela permet un échantillon environnemental à tester dans un but précis, par exemple déterminer si Norovirus, qui peuvent causer des maladies gastro-intestinales chez l’homme, est présent dans l’eau.


Figure 1
La figure 1. Étape par étape de l’analyse d’échantillons environnementaux de RNA RT-PCR.

Procedure

<>

1. prélèvement : Échantillon de sol

  1. Trouvez un emplacement échantillon via GPS, coordonnées ou vue.
  2. Pour l’échantillonnage aléatoire, choisir des points aléatoires au sein d’une région pour obtenir un recensement général des habitats microbiens. Transect d’échantillonnage perçoit des points le long de la ligne droite, par exemple, adjacent à un lit. Grille échantillons proviennent systématiquement des points à intervalles réguliers et sont utiles pour les communautés microbiennes de cartographie dans une région inconnue ou variable.
  3. Profondeur d’échantillonnage dans un 3-6 pouces (7,5 à 15 cm) permet d’accéder à l’activité microbienne plus abondante qui est proche, mais pas dans la rhizosphère (la région étroite du sol directement touché par les racines des plantes et les microorganismes associés).
  4. Recueillir l’échantillon de sol, pousser et tourner une tarière à main dans le sol à la profondeur prédéterminée.
  5. Soulevez la tarière. Le sol se trouve dans la tige creuse de la tarière.
  6. Racler le sol au bas de la vis sans fin dans un sac de ramassage de sol. Être sûr de ne pas toucher ou contaminer le sol.
  7. Le sac correctement avec l’emplacement, nom, date et heure de l’étiquette.
  8. Au laboratoire, passez le sol à travers un tamis de 2 mm pour éliminer tout gravier et la roche.
  9. Analyser une partie du sol pour la teneur en humidité du sol. Pour plus de détails de cette étape, consultez JoVE Science Education vidéo sur l’humidité du sol.

2. prélèvement : Échantillon de l’eau

  1. Recherchez l’emplacement de l’échantillon via GPS, coordonnées ou vue.
  2. Recueillez l’eau dans un flacon. Noter le volume d’eau recueillie ; Si les microbes dans l’échantillon sont quantitativement analysés, puis la concentration microbienne peut être déterminée compte tenu du volume collecté.
  3. Tester immédiatement l’eau pour tous les paramètres requis pour l’expérience (température, pH, conductivité, salinité, azote et phosphore contenu, etc) en utilisant les sondes électroniques appropriés.
  4. Placer le flacon contenant l’échantillon d’eau dans une glacière avec de la glace. Transférer la glacière au laboratoire.

3. Extraction de l’ARN

  1. Pour rassembler et concentrer les micro-organismes provenant de l’échantillon environnemental, veuillez vous reporter à la vidéo sur l’extraction des acides nucléiques communauté JoVE Science Education.
  2. Extrait RNA virus à l’aide d’un kit d’extraction commerciale conformément aux instructions du fabricant.
  3. En bref, tout d’abord mélanger les échantillons avec tampon de lyse complété avec de l’éthanol, puis ajoutez les échantillons dans les colonnes à centrifuger.
  4. Centrifuger les colonnes à environ 12 000 x g, redistribution de défausse. Tampon de lavage s’ajoute les colonnes et centrifuger à nouveau.
  5. Ajouter de l’eau exempte de RNase aux colonnes et centrifuger pendant 30 s à éluer l’ARN dans des tubes stériles microtubes de faible adhérence de 1,5 mL.

4. reverse Transcription - PCR

  1. Récupérer les réactifs suivants du congélateur-20 ° C : dNTP, concentré (par exemple, x 10) inverser un tampon transcription amorces (dans cet exemple, amorces aléatoires). Décongeler celles-ci sur la glace ou à température ambiante à l’intérieur d’une hotte propre et gardez-les sur la glace après décongelé. Aussi récupérer la transcriptase inverse et l’inhibiteur de RNase et mettez-les sur la glace.
  2. Calculer les volumes de réactifs nécessaires pour faire un « mix master » qui combine tous les réactifs constant entre chaque réaction (voir le tableau 1 pour une réaction de l’échantillon). Préparer suffisamment mélange principal pour chaque échantillon, comme un contrôle positif (à l’aide d’un modèle connu de transcription) et négatif (par exemple, sans la transcriptase inverse, avec seulement de l’eau comme modèle, etc.) des réactions de contrôle. Inclure une remise de 10 % en volume.
  3. Assembler le mélange maître dans des microtubes 1,5 mL faible adhérence. Cela minimise la liaison de molécules de réactifs sur les parois des tubes en plastique.
  4. Lorsque les réactifs sont décongelés, ajouter les volumes calculés pour le tube à centrifuger. Doucement de vortex et centrifuger chaque tube avant l’addition. Veillez à modifier les pointes de pipette entre l’ajout de chaque réactif pour empêcher la contamination.
  5. Après tous les réactifs ont été ajoutées, vortex et centrifuger master mix pour assurer un mélange homogène. Remettre les réactifs en conservation à-20 ° C.
  6. Préparer et étiqueter de 8 tubes PCR bandes, désignant un tube pour chaque réaction d’échantillon ou de contrôle.
  7. Aliquote un volume égal de mélange maître dans chaque tube. Ensuite, ajouter des composants de réaction spécifiques, tels que les extraits de RNA.
  8. Placez le couvercle de la bande sur la bande de PCR et centrifuger dans un minicentrifuge avec un adaptateur de tube de bande pour assurer tout le liquide est recueilli au bas de chaque tube (Figure 2).
  9. Bande de PCR place solidement dans le thermocycleur. Appuyez pour s’assurer que les tubes sont sécurisés.
  10. Définissez le thermocycleur pour exécuter le programme approprié pour le RT utilisé (voir le tableau 2 pour un protocole d’échantillonnage). Lorsque le programme est terminé, les tubes contiendra cDNA produits, qui peuvent alors être soumis à l’amplification par PCR. Pour plus de détails, veuillez consulter les vidéos de l’enseignement des sciences JoVE sur PCR et PCR quantitative. Stocker les ADNc à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.

Figure 2
La figure 2. Plafonné à bande de 8-tube contenant l’extrait et mélange principal.

Réactif Volume 1 (μL) de la réaction
mémoire tampon RT 10 x 2.0
25 x dNTPs 0,8
10 x amorce aléatoire 2.0
Multiscribe 1.0
Inhibiteur de RNase 1.0
Niveau moléculaire H2O 3.2
Volume total 10

Le tableau 1. Ingrédients de Mix Master RT.

Étape 1 Étape 2 Étape 3 Étape 4
25 ° C, 10 min 37 ° C, 120 min 85 ° C, 5 min 4 ° C, ∞

Le tableau 2. Programme RT réaction thermocycleur.

Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction ou RT-PCR, permet la détection des virus à ARN et de l’expression génétique microbienne dans l’environnement.

Contrairement aux organismes cellulaires provenant des humains aux bactéries, qui utilisent l’ADN comme leur matériel génétique, certains virus ont des génomes d’ARN, y compris de nombreux virus pathogènes tels que la grippe, virus Ebola et le VIH. Tandis que certains virus peuvent être détectées en observant le phénotype pathogène qui se développe lorsqu’il est utilisé pour infecter les cellules en culture cellulaire, une majorité n’a aucune méthode de caractérisation basée sur l’élevage. RT-PCR permet de détecter la présence de ces virus dans l’environnement avec la sensibilité élevée.

Dans le même temps, les organismes avec des génomes de base d’ADN « expriment » l’information génétique codée dans les génomes de leur ADN par « transcription » dans messenger ou « m » ARN, qui peut alors être « traduit » protéines aux fonctions enzymatiques ou structurels dans les cellules. Comme les microbes répondent et s’adapter aux changements dans l’environnement en tournant ou désactiver diverses voies génétiques, RT-PCR peut servir à surveiller les changements dans l’expression des gènes pour servir d’éventuels assesseurs écosystème.

Cette vidéo va sur les principes qui sous-tendent la RT-PCR, décrire une procédure généralisée pour effectuer cette technique et enfin, examiner quelques-unes des façons que cette méthode est appliquée aujourd'hui en microbiologie environnementale.

Il y a deux parties essentielles à cette procédure : l’extraction d’ARN à partir d’échantillons biologiques, suivie de sa transcription inverse dans l’ADN.

L’isolement du RNA consiste à lyser les cellules de l’échantillon en ajoutant un détergent qui décompose les lipides et les protéines, suivies de la rupture mécanique. Extraction de RNA de virus habituellement nécessite l’ajout des protéases, qui sont des protéines-digestion enzymes, pour briser les capsides le virus - les manteaux de protéine dure qui forment la particule virale. En revanche, lors de l’obtention RNA des organismes multicellulaires, le lysat peut doivent être traités avec des enzymes capables de dégrader l’ADN, ou DNAases, pour éviter des résultats en aval étant confondus par la présence de l’ADN chimiquement semblable.

RNA peut ensuite être purifié des lysats de deux manières. Dans une méthode, dite d’extraction de guanidinium acide de thiocyanate-phénol-chloroforme, le lysat est mélangé avec un mélange aqueux-organique qui est ensuite centrifugé pour séparer les phases. Les protéines seront être partitionnées dans la phase organique, débris de cellules lysées dans l’interphase nuageux et d’acides nucléiques dans la phase aqueuse. La phase aqueuse supérieure peut ensuite être collectée et RNA est précipité par l’addition d’alcool comme l’isopropanol, ce qui diminue la solubilité de l’acide nucléique dans l’eau.

Dans ARN basée sur les colonnes, le lysat est mélangé à l’alcool et ensuite passé à travers une colonne de gel filtration avec une résine chargée négativement, comme la silice. Le lysat est prêt pour que les ions chargés positivement sous la forme de tampon « ponts salins » qui permettent à la colonne vertébrale de phosphate chargé négativement des acides nucléiques pour lier à la résine. Tous les autres contaminants sont alors emportées. Les acides nucléiques sont « élués » de la colonne à l’aide d’un tampon de faible teneur en sel ou d’eau. ARN simple brin ayant moins de charges négatives que l’ADN double brin, il peut être préférentiellement éluée à l’aide de tampons de concentrations spécifiques.

Une fois isolés, l’ARN se transforme l’ADN plus chimiquement stable. Les scientifiques ont exploité une enzyme naturellement codée par des rétrovirus comme le VIH. Cette enzyme est connue comme la transcriptase inverse, ou « RT ».

RT synthétise l’ADN complémentaire ou « c » d’un court tronçon de nucléotides connue comme une amorce. Cette amorce peut avoir différentes séquences, selon le but de l’expérience. Par exemple, l’apprêt peut être conçu pour avoir une séquence spécifique, afin de détecter les gènes spécifiques ou des organismes. Une fois synthétisées, cet ADNc « premier volet » peut être amplifié par PCR ordinaire.

Maintenant que nous avons une compréhension des principes derrière la RT-PCR, nous allons étudier un protocole pour effectuer cette technique sur des échantillons d’ARN prélevés dans l’environnement.

Pour commencer la procédure, trouver un emplacement de collection d’échantillon en utilisant les coordonnées GPS ou la vue. Choisissez des points aléatoires au sein d’une région pour obtenir un aperçu général des habitats microbiens.

Recueillir l’échantillon solide, pousser et tourner une tarière à main dans le sol à la profondeur prédéterminée. En soulevant la tarière, sol se trouvent dans la tige creuse de la tarière.

Ce sol est gratté directement dans un sac de collection du sol et le sac est étiqueté avec le lieu, nom, date, temps de collecte et de toute autre information nécessaire.

Transférer le sol au laboratoire et passez le sol à travers un tamis de 2 mm pour enlever le gravier et la roche. Analyser un échantillon du sol pour la teneur en eau, qui peut être instructive quant au niveau de l’activité microbienne dans le sol. Pour ce faire, consulter vidéo « détermination de l’humidité contenu du sol » de cette collection.

Pour le prélèvement d’échantillons de l’eau, choisir un site d’intérêt similaire à la collection de sol et recueillir de l’eau dans un flacon stérile en plastique à parois épaisses. Prendre note du volume d’eau recueilli. Test de l’eau immédiatement pour les paramètres comme la température, du pH et salinité, qui peut fournir des informations importantes concernant les niveaux microbiens prévus dans l’échantillon. Ensuite, placez la bouteille dans le refroidisseur et le transfert au laboratoire.

Micro-organismes tels que les virus sont collectés et concentrés à partir de l’échantillon environnemental.

RNA peut être extraites des virus prélevés par la méthode de colonne de spin à l’aide de kits commerciaux de RNA extraction conformément aux instructions du fabricant. Tampon de lyse, complété avec de l’éthanol, est d’abord mélangée avec l’échantillon. Placer le nombre approprié de colonnes de spin dans les tubes de prélèvement, puis appliquez les échantillons sur la matrice colonne. Centrifuger les colonnes à environ 12 000 x g pendant 1-2 min laisser les acides nucléiques lier à la colonne et jeter le liquide accréditives.

Tampon de lavage s’ajoute les colonnes et centrifuger à nouveau. Placer les colonnes dans des microtubes nouvelle, stérile 1,5 mL faible adhérence. Ensuite, ajoutez de l’eau qui est libre de ribonucléases, qui sont des enzymes qui dégradent les ARN, aux colonnes et centrifuger pendant 30 s pour Éluer la RNA. L’ARN éluée peut être conservée à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.

Avant l’expérience, des amorces appropriées devraient être conçues pour détecter les séquences d’intérêt, qui peuvent servir de marqueurs pour la présence de microorganismes spécifiques.

Sortez les réactifs de RT conservés à-20 ° C et décongeler les réactifs congelés sur la glace (ou à température ambiante). Il s’agit de nucléotides, tampon de transcription inverse et amorces. Une fois décongelé, garder les réactifs sur la glace ; l’enzyme transcriptase inverse et inhibiteur de RNase doivent toujours être bien sur la glace.

Alors que les réactifs sont en fonte, calculer les volumes et les concentrations des composantes de la réaction. Une fois que les réactifs sont décongelés, doucement vortex et un essorage chaque tube pour s’assurer que le contenu sont bien mélangés.

Travaillant dans une hotte à flux laminaire pour éviter toute contamination, assembler les composants d’un mélange maître à ajouter dans chaque tube PCR. Lors de l’assemblage master mix dans un tube Eppendorf, veillez à modifier les pointes de pipette entre chaque réactif pour éviter la contamination. Après que tous les réactifs ont été ajoutés au tube Eppendorf, vortex et la Centrifuger le capitaine mélangent doucement le tube pour assurer un mélange homogène.

Étiqueter un ensemble de tubes PCR, en veillant à inclure les contrôles. Aliquote un volume égal de master mix dans chaque tube. Ensuite, ajouter des composants de réaction spécifiques, tels que les extraits de RNA ou eau pour contrôle négatif.

Une fois que tous les composants sont ajoutés, placer les tubes dans un thermocycleur et définir le programme de transcription inverse d’exécuter. L’ADNc peut alors être soumis à l’amplification par PCR. Pour une description détaillée de cette étape, reportez-vous à la vidéo de cette collection sur la PCR.

Lors de la PCR est terminée, certains des produits PCR peuvent être séparés et visualisés sur gel d’agarose. Par exemple, une amorce de gène-spécifique a été utilisée ici pour détecter la présence d’un virus à ARN. Bandes de la taille attendue sont obtenus par la réaction de RT-PCR, mais pas des contrôles négatifs, indiquant la présence de ce virus dans l’échantillon testé.

L’identification des micro-organismes base d’ARN par RT-PCR permet l’analyse de la santé écologique, des risques pour l’environnement et la conservation de la biodiversité.

L’utilisation de micro-organismes pour nettoyer des hydrocarbures et de solvants de l’eau et des sols pollués représente une alternative de remédiation Écodurables. Compréhension de l’expression génétique microbienne indigène peut mettre en évidence les voies microbiennes spécifiques qui décomposent les contaminants dans ces conditions. RT-PCR est souvent utilisée pour amplifier l’ADN messagère de ces échantillons environnementaux.

Mesures de santé publique exigent souvent une surveillance rapide des sources virales de l’infection dans l’environnement. La grippe aviaire, par exemple, est très contagieuse et peut se propager rapidement à la volaille, le bétail et même des humains. Dans cet exemple, les chercheurs ont étudié la menace de la grippe aviaire, propagé par les oiseaux sauvages.

En utilisant une configuration portable de RT-PCR et l’appareil, ils ont projeté un éventail d’oiseaux sauvages, même dans des régions éloignées, à déceler rapidement les infections et prévenir la transmission.

Enfin, RT-PCR peut servir à caractériser « biopesticides » en cours d’élaboration pour nuisibles telles que le tireur d’élite à ailes vitreux, Homalodisca vitripennis, l’hôte pour une maladie qui endommage gravement les vignes en Amérique du Nord. Un roman simple brin-virus à ARN est développé comme un agent pour infecter de cet insecte. En utilisant une combinaison de culture cellulaire Homalodisca et confirmation de RT-PCR de la charge virale, ces auteurs ont réussi à propager une forte concentration de virus pour utilisation comme agent de lutte biologique.

Vous avez juste regardé introduction de JoVE pour Analyzing RNA-Based les organismes environnementaux par RT-PCR. Vous devez maintenant comprendre la théorie derrière le protocole, comment appliquer la technique à vos recherches et certaines des manières dont il est utilisé dans le domaine aujourd'hui. Merci de regarder !

Results

Lorsque RT - PCR est terminée, certains des produits PCR peuvent être séparés et visualisés sur gel d’agarose (Figure 3). Dans cet exemple, une amorce de gène-spécifique a été utilisée pour détecter la présence d’un virus à ARN. Bandes de la taille attendue sont obtenus de deux des échantillons et la réaction de contrôle positif, mais pas de contrôle négatif, indiquant la présence de ce virus chez deux des échantillons d’eau mis à l’essai.

Figure 3
Figure 3. Électrophorèse sur gel des produits RT-PCR. M: marqueur de taille ADN ; P: contrôle positif ; N : contrôle négatif. Les réactions utilisant l’ARN de quatre échantillons d’eau ont été exécutées dans les voies 1, 2, 3 et 5.

Applications and Summary

RT-PCR est nécessaire pour la création d’ADNc d’un descripteur d’ARN. Cela permet à base d’ARN des micro-organismes pour être analysés utilisant essais moléculaires mis au point pour l’ADN. Une fois que l’ADNc est synthétisé, tests de PCR peuvent déterminer la présence ou l’absence de base d’ARN de micro-organismes dans un échantillon environnemental. Cette mesure plus loin en aval analyse afin de déterminer l’écologie microbienne, risques pour la santé et les risques environnementaux.

RT-PCR peut également être utilisé pour doser les ARNm comme un moyen d’observer quels gènes sont exprimés dans un environnement. Il fournit des informations dont les microbes les protéines et les voies dépendent pour survivre à des conditions environnementales en particulier. Analyses d’expression génique peuvent identifier des voies microbiennes que contaminants environnementaux de ventilation tels que des hydrocarbures ou des solvants chlorés, et microbes avec ces voies peuvent être exploitées pour la biorestauration.

Évaluation des risques intègre la RT-PCR afin d’analyser les risques pour la santé humaine et l’environnement. Combinant la RT avec PCR quantitative permet de virus à ARN soit énumérée dans les échantillons, afin que l’exposition humaine et environnementale peut être calculée aux fins quantitatives microbienne risque évaluation (AMCQ).

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1. prélèvement : Échantillon de sol

  1. Trouvez un emplacement échantillon via GPS, coordonnées ou vue.
  2. Pour l’échantillonnage aléatoire, choisir des points aléatoires au sein d’une région pour obtenir un recensement général des habitats microbiens. Transect d’échantillonnage perçoit des points le long de la ligne droite, par exemple, adjacent à un lit. Grille échantillons proviennent systématiquement des points à intervalles réguliers et sont utiles pour les communautés microbiennes de cartographie dans une région inconnue ou variable.
  3. Profondeur d’échantillonnage dans un 3-6 pouces (7,5 à 15 cm) permet d’accéder à l’activité microbienne plus abondante qui est proche, mais pas dans la rhizosphère (la région étroite du sol directement touché par les racines des plantes et les microorganismes associés).
  4. Recueillir l’échantillon de sol, pousser et tourner une tarière à main dans le sol à la profondeur prédéterminée.
  5. Soulevez la tarière. Le sol se trouve dans la tige creuse de la tarière.
  6. Racler le sol au bas de la vis sans fin dans un sac de ramassage de sol. Être sûr de ne pas toucher ou contaminer le sol.
  7. Le sac correctement avec l’emplacement, nom, date et heure de l’étiquette.
  8. Au laboratoire, passez le sol à travers un tamis de 2 mm pour éliminer tout gravier et la roche.
  9. Analyser une partie du sol pour la teneur en humidité du sol. Pour plus de détails de cette étape, consultez JoVE Science Education vidéo sur l’humidité du sol.

2. prélèvement : Échantillon de l’eau

  1. Recherchez l’emplacement de l’échantillon via GPS, coordonnées ou vue.
  2. Recueillez l’eau dans un flacon. Noter le volume d’eau recueillie ; Si les microbes dans l’échantillon sont quantitativement analysés, puis la concentration microbienne peut être déterminée compte tenu du volume collecté.
  3. Tester immédiatement l’eau pour tous les paramètres requis pour l’expérience (température, pH, conductivité, salinité, azote et phosphore contenu, etc) en utilisant les sondes électroniques appropriés.
  4. Placer le flacon contenant l’échantillon d’eau dans une glacière avec de la glace. Transférer la glacière au laboratoire.

3. Extraction de l’ARN

  1. Pour rassembler et concentrer les micro-organismes provenant de l’échantillon environnemental, veuillez vous reporter à la vidéo sur l’extraction des acides nucléiques communauté JoVE Science Education.
  2. Extrait RNA virus à l’aide d’un kit d’extraction commerciale conformément aux instructions du fabricant.
  3. En bref, tout d’abord mélanger les échantillons avec tampon de lyse complété avec de l’éthanol, puis ajoutez les échantillons dans les colonnes à centrifuger.
  4. Centrifuger les colonnes à environ 12 000 x g, redistribution de défausse. Tampon de lavage s’ajoute les colonnes et centrifuger à nouveau.
  5. Ajouter de l’eau exempte de RNase aux colonnes et centrifuger pendant 30 s à éluer l’ARN dans des tubes stériles microtubes de faible adhérence de 1,5 mL.

4. reverse Transcription - PCR

  1. Récupérer les réactifs suivants du congélateur-20 ° C : dNTP, concentré (par exemple, x 10) inverser un tampon transcription amorces (dans cet exemple, amorces aléatoires). Décongeler celles-ci sur la glace ou à température ambiante à l’intérieur d’une hotte propre et gardez-les sur la glace après décongelé. Aussi récupérer la transcriptase inverse et l’inhibiteur de RNase et mettez-les sur la glace.
  2. Calculer les volumes de réactifs nécessaires pour faire un « mix master » qui combine tous les réactifs constant entre chaque réaction (voir le tableau 1 pour une réaction de l’échantillon). Préparer suffisamment mélange principal pour chaque échantillon, comme un contrôle positif (à l’aide d’un modèle connu de transcription) et négatif (par exemple, sans la transcriptase inverse, avec seulement de l’eau comme modèle, etc.) des réactions de contrôle. Inclure une remise de 10 % en volume.
  3. Assembler le mélange maître dans des microtubes 1,5 mL faible adhérence. Cela minimise la liaison de molécules de réactifs sur les parois des tubes en plastique.
  4. Lorsque les réactifs sont décongelés, ajouter les volumes calculés pour le tube à centrifuger. Doucement de vortex et centrifuger chaque tube avant l’addition. Veillez à modifier les pointes de pipette entre l’ajout de chaque réactif pour empêcher la contamination.
  5. Après tous les réactifs ont été ajoutées, vortex et centrifuger master mix pour assurer un mélange homogène. Remettre les réactifs en conservation à-20 ° C.
  6. Préparer et étiqueter de 8 tubes PCR bandes, désignant un tube pour chaque réaction d’échantillon ou de contrôle.
  7. Aliquote un volume égal de mélange maître dans chaque tube. Ensuite, ajouter des composants de réaction spécifiques, tels que les extraits de RNA.
  8. Placez le couvercle de la bande sur la bande de PCR et centrifuger dans un minicentrifuge avec un adaptateur de tube de bande pour assurer tout le liquide est recueilli au bas de chaque tube (Figure 2).
  9. Bande de PCR place solidement dans le thermocycleur. Appuyez pour s’assurer que les tubes sont sécurisés.
  10. Définissez le thermocycleur pour exécuter le programme approprié pour le RT utilisé (voir le tableau 2 pour un protocole d’échantillonnage). Lorsque le programme est terminé, les tubes contiendra cDNA produits, qui peuvent alors être soumis à l’amplification par PCR. Pour plus de détails, veuillez consulter les vidéos de l’enseignement des sciences JoVE sur PCR et PCR quantitative. Stocker les ADNc à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.

Figure 2
La figure 2. Plafonné à bande de 8-tube contenant l’extrait et mélange principal.

Réactif Volume 1 (μL) de la réaction
mémoire tampon RT 10 x 2.0
25 x dNTPs 0,8
10 x amorce aléatoire 2.0
Multiscribe 1.0
Inhibiteur de RNase 1.0
Niveau moléculaire H2O 3.2
Volume total 10

Le tableau 1. Ingrédients de Mix Master RT.

Étape 1 Étape 2 Étape 3 Étape 4
25 ° C, 10 min 37 ° C, 120 min 85 ° C, 5 min 4 ° C, ∞

Le tableau 2. Programme RT réaction thermocycleur.

Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction ou RT-PCR, permet la détection des virus à ARN et de l’expression génétique microbienne dans l’environnement.

Contrairement aux organismes cellulaires provenant des humains aux bactéries, qui utilisent l’ADN comme leur matériel génétique, certains virus ont des génomes d’ARN, y compris de nombreux virus pathogènes tels que la grippe, virus Ebola et le VIH. Tandis que certains virus peuvent être détectées en observant le phénotype pathogène qui se développe lorsqu’il est utilisé pour infecter les cellules en culture cellulaire, une majorité n’a aucune méthode de caractérisation basée sur l’élevage. RT-PCR permet de détecter la présence de ces virus dans l’environnement avec la sensibilité élevée.

Dans le même temps, les organismes avec des génomes de base d’ADN « expriment » l’information génétique codée dans les génomes de leur ADN par « transcription » dans messenger ou « m » ARN, qui peut alors être « traduit » protéines aux fonctions enzymatiques ou structurels dans les cellules. Comme les microbes répondent et s’adapter aux changements dans l’environnement en tournant ou désactiver diverses voies génétiques, RT-PCR peut servir à surveiller les changements dans l’expression des gènes pour servir d’éventuels assesseurs écosystème.

Cette vidéo va sur les principes qui sous-tendent la RT-PCR, décrire une procédure généralisée pour effectuer cette technique et enfin, examiner quelques-unes des façons que cette méthode est appliquée aujourd'hui en microbiologie environnementale.

Il y a deux parties essentielles à cette procédure : l’extraction d’ARN à partir d’échantillons biologiques, suivie de sa transcription inverse dans l’ADN.

L’isolement du RNA consiste à lyser les cellules de l’échantillon en ajoutant un détergent qui décompose les lipides et les protéines, suivies de la rupture mécanique. Extraction de RNA de virus habituellement nécessite l’ajout des protéases, qui sont des protéines-digestion enzymes, pour briser les capsides le virus - les manteaux de protéine dure qui forment la particule virale. En revanche, lors de l’obtention RNA des organismes multicellulaires, le lysat peut doivent être traités avec des enzymes capables de dégrader l’ADN, ou DNAases, pour éviter des résultats en aval étant confondus par la présence de l’ADN chimiquement semblable.

RNA peut ensuite être purifié des lysats de deux manières. Dans une méthode, dite d’extraction de guanidinium acide de thiocyanate-phénol-chloroforme, le lysat est mélangé avec un mélange aqueux-organique qui est ensuite centrifugé pour séparer les phases. Les protéines seront être partitionnées dans la phase organique, débris de cellules lysées dans l’interphase nuageux et d’acides nucléiques dans la phase aqueuse. La phase aqueuse supérieure peut ensuite être collectée et RNA est précipité par l’addition d’alcool comme l’isopropanol, ce qui diminue la solubilité de l’acide nucléique dans l’eau.

Dans ARN basée sur les colonnes, le lysat est mélangé à l’alcool et ensuite passé à travers une colonne de gel filtration avec une résine chargée négativement, comme la silice. Le lysat est prêt pour que les ions chargés positivement sous la forme de tampon « ponts salins » qui permettent à la colonne vertébrale de phosphate chargé négativement des acides nucléiques pour lier à la résine. Tous les autres contaminants sont alors emportées. Les acides nucléiques sont « élués » de la colonne à l’aide d’un tampon de faible teneur en sel ou d’eau. ARN simple brin ayant moins de charges négatives que l’ADN double brin, il peut être préférentiellement éluée à l’aide de tampons de concentrations spécifiques.

Une fois isolés, l’ARN se transforme l’ADN plus chimiquement stable. Les scientifiques ont exploité une enzyme naturellement codée par des rétrovirus comme le VIH. Cette enzyme est connue comme la transcriptase inverse, ou « RT ».

RT synthétise l’ADN complémentaire ou « c » d’un court tronçon de nucléotides connue comme une amorce. Cette amorce peut avoir différentes séquences, selon le but de l’expérience. Par exemple, l’apprêt peut être conçu pour avoir une séquence spécifique, afin de détecter les gènes spécifiques ou des organismes. Une fois synthétisées, cet ADNc « premier volet » peut être amplifié par PCR ordinaire.

Maintenant que nous avons une compréhension des principes derrière la RT-PCR, nous allons étudier un protocole pour effectuer cette technique sur des échantillons d’ARN prélevés dans l’environnement.

Pour commencer la procédure, trouver un emplacement de collection d’échantillon en utilisant les coordonnées GPS ou la vue. Choisissez des points aléatoires au sein d’une région pour obtenir un aperçu général des habitats microbiens.

Recueillir l’échantillon solide, pousser et tourner une tarière à main dans le sol à la profondeur prédéterminée. En soulevant la tarière, sol se trouvent dans la tige creuse de la tarière.

Ce sol est gratté directement dans un sac de collection du sol et le sac est étiqueté avec le lieu, nom, date, temps de collecte et de toute autre information nécessaire.

Transférer le sol au laboratoire et passez le sol à travers un tamis de 2 mm pour enlever le gravier et la roche. Analyser un échantillon du sol pour la teneur en eau, qui peut être instructive quant au niveau de l’activité microbienne dans le sol. Pour ce faire, consulter vidéo « détermination de l’humidité contenu du sol » de cette collection.

Pour le prélèvement d’échantillons de l’eau, choisir un site d’intérêt similaire à la collection de sol et recueillir de l’eau dans un flacon stérile en plastique à parois épaisses. Prendre note du volume d’eau recueilli. Test de l’eau immédiatement pour les paramètres comme la température, du pH et salinité, qui peut fournir des informations importantes concernant les niveaux microbiens prévus dans l’échantillon. Ensuite, placez la bouteille dans le refroidisseur et le transfert au laboratoire.

Micro-organismes tels que les virus sont collectés et concentrés à partir de l’échantillon environnemental.

RNA peut être extraites des virus prélevés par la méthode de colonne de spin à l’aide de kits commerciaux de RNA extraction conformément aux instructions du fabricant. Tampon de lyse, complété avec de l’éthanol, est d’abord mélangée avec l’échantillon. Placer le nombre approprié de colonnes de spin dans les tubes de prélèvement, puis appliquez les échantillons sur la matrice colonne. Centrifuger les colonnes à environ 12 000 x g pendant 1-2 min laisser les acides nucléiques lier à la colonne et jeter le liquide accréditives.

Tampon de lavage s’ajoute les colonnes et centrifuger à nouveau. Placer les colonnes dans des microtubes nouvelle, stérile 1,5 mL faible adhérence. Ensuite, ajoutez de l’eau qui est libre de ribonucléases, qui sont des enzymes qui dégradent les ARN, aux colonnes et centrifuger pendant 30 s pour Éluer la RNA. L’ARN éluée peut être conservée à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.

Avant l’expérience, des amorces appropriées devraient être conçues pour détecter les séquences d’intérêt, qui peuvent servir de marqueurs pour la présence de microorganismes spécifiques.

Sortez les réactifs de RT conservés à-20 ° C et décongeler les réactifs congelés sur la glace (ou à température ambiante). Il s’agit de nucléotides, tampon de transcription inverse et amorces. Une fois décongelé, garder les réactifs sur la glace ; l’enzyme transcriptase inverse et inhibiteur de RNase doivent toujours être bien sur la glace.

Alors que les réactifs sont en fonte, calculer les volumes et les concentrations des composantes de la réaction. Une fois que les réactifs sont décongelés, doucement vortex et un essorage chaque tube pour s’assurer que le contenu sont bien mélangés.

Travaillant dans une hotte à flux laminaire pour éviter toute contamination, assembler les composants d’un mélange maître à ajouter dans chaque tube PCR. Lors de l’assemblage master mix dans un tube Eppendorf, veillez à modifier les pointes de pipette entre chaque réactif pour éviter la contamination. Après que tous les réactifs ont été ajoutés au tube Eppendorf, vortex et la Centrifuger le capitaine mélangent doucement le tube pour assurer un mélange homogène.

Étiqueter un ensemble de tubes PCR, en veillant à inclure les contrôles. Aliquote un volume égal de master mix dans chaque tube. Ensuite, ajouter des composants de réaction spécifiques, tels que les extraits de RNA ou eau pour contrôle négatif.

Une fois que tous les composants sont ajoutés, placer les tubes dans un thermocycleur et définir le programme de transcription inverse d’exécuter. L’ADNc peut alors être soumis à l’amplification par PCR. Pour une description détaillée de cette étape, reportez-vous à la vidéo de cette collection sur la PCR.

Lors de la PCR est terminée, certains des produits PCR peuvent être séparés et visualisés sur gel d’agarose. Par exemple, une amorce de gène-spécifique a été utilisée ici pour détecter la présence d’un virus à ARN. Bandes de la taille attendue sont obtenus par la réaction de RT-PCR, mais pas des contrôles négatifs, indiquant la présence de ce virus dans l’échantillon testé.

L’identification des micro-organismes base d’ARN par RT-PCR permet l’analyse de la santé écologique, des risques pour l’environnement et la conservation de la biodiversité.

L’utilisation de micro-organismes pour nettoyer des hydrocarbures et de solvants de l’eau et des sols pollués représente une alternative de remédiation Écodurables. Compréhension de l’expression génétique microbienne indigène peut mettre en évidence les voies microbiennes spécifiques qui décomposent les contaminants dans ces conditions. RT-PCR est souvent utilisée pour amplifier l’ADN messagère de ces échantillons environnementaux.

Mesures de santé publique exigent souvent une surveillance rapide des sources virales de l’infection dans l’environnement. La grippe aviaire, par exemple, est très contagieuse et peut se propager rapidement à la volaille, le bétail et même des humains. Dans cet exemple, les chercheurs ont étudié la menace de la grippe aviaire, propagé par les oiseaux sauvages.

En utilisant une configuration portable de RT-PCR et l’appareil, ils ont projeté un éventail d’oiseaux sauvages, même dans des régions éloignées, à déceler rapidement les infections et prévenir la transmission.

Enfin, RT-PCR peut servir à caractériser « biopesticides » en cours d’élaboration pour nuisibles telles que le tireur d’élite à ailes vitreux, Homalodisca vitripennis, l’hôte pour une maladie qui endommage gravement les vignes en Amérique du Nord. Un roman simple brin-virus à ARN est développé comme un agent pour infecter de cet insecte. En utilisant une combinaison de culture cellulaire Homalodisca et confirmation de RT-PCR de la charge virale, ces auteurs ont réussi à propager une forte concentration de virus pour utilisation comme agent de lutte biologique.

Vous avez juste regardé introduction de JoVE pour Analyzing RNA-Based les organismes environnementaux par RT-PCR. Vous devez maintenant comprendre la théorie derrière le protocole, comment appliquer la technique à vos recherches et certaines des manières dont il est utilisé dans le domaine aujourd'hui. Merci de regarder !

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