RNA-Analyse von Umweltproben mittels RT-PCR

Environmental Microbiology

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Overview

Quelle: Labors von Dr. Ian Pfeffer und Dr. Charles Gerba - Arizona University
Demonstrierende Autor: Bradley Schmitz

Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) beinhaltet den gleichen Prozess wie konventionelle PCR-Radsport Temperatur um Nukleinsäuren. Jedoch während konventionelle PCR nur Deoxyribonucleic Säuren (DNA) verstärkt, ermöglicht RT-PCR die Verstärkung der Säuren Ribonukleinsäure (RNA) durch die Bildung von komplementären DNA (cDNA). Dies ermöglicht RNA-basierten Organismen gefunden in der Umgebung zu analysierten nutzt Methoden und Technologien, die für DNA bestimmt werden.

Viele in der Umgebung gefundenen Viren verwenden RNA als ihr genetisches Material. Verschiedene RNA-basierten virale Erreger, wie Norovirusund Indikator-Organismen, wie z. B. Paprika mild Mottle Virus (PMMoV), haben keine Kultur-basierte Nachweisverfahren für die Quantifizierung. Um auf das Vorhandensein dieser RNA-Viren in Umweltproben aus Erde, Wasser, Landwirtschaft, etc.zu erkennen, setzen molekulare Tests auf RT-PCR, RNA in DNA umzuwandeln. Ohne RT-PCR wäre Mikrobiologen nicht in der Lage, Tests und Forschung zahlreiche RNA-basierten Viren, die Risiken für die Gesundheit von Mensch und Umwelt darstellen.

RT-PCR kann auch als Werkzeug eingesetzt werden, um mikrobielle Aktivität in die Umwelt zu messen. Boten-RNA (mRNA) ist die einsträngige Vorlage für Protein Übersetzung, und messen die Höhe der verschiedenen mRNAs gibt an, welche Gene aus der Mikroben in der Umgebung zum Ausdruck gebracht werden. Analyse der Genexpression gibt Hinweise, welche biologischen Bahnen von Organismen verwendet werden, um unter verschiedenen Umweltbedingungen zu überleben. In einigen Fällen kann Genexpression genutzt werden, um festzustellen, welche Organismen können überleben unter widrigen Bedingungen am besten und haben Fähigkeiten für Bioremediation von kontaminiertem Erdreich oder Wasser.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Grundlagen der Umwelt-Mikrobiologie. RNA-Analyse von Umweltproben mittels RT-PCR. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Principles

PCR basiert auf die Verstärkung von DNA-Templates, die seine Nutzung bei der Aufdeckung von RNA aus Organismen beschränkt. RT-PCR bietet jedoch ein Mittel für die Verwendung von RNA, um cDNA mit Hilfe von spezialisierten Enzymen, bekannt als Reverse Transkriptase (RT) zu produzieren. Diese cDNA kann dann als Ausgangspunkt Vorlage für spätere Verstärkung mit konventionellen PCR (Abbildung 1) verwendet werden.

Reversen Transkription kann gesteuert werden, verstärken nur die gewünschten Produkte oder eine ganze Gemeinschaft von Nukleinsäuren, die innerhalb einer ökologischen Probe je nach die Primer, die zur Vorlage der cDNA-Synthesis. Dies ist wichtig, da Boden- und Wasserproben sind oft mit verschiedenen Nukleinsäuren, die für spezifische Auswertungen gewünscht sind nicht gesättigt. Zufällige Zündkapseln, die RNA-Sequenzen gefunden in jeder Art von Mikroben binden können, können in RT-PCR verwendet werden, um die meisten RNA zu erkennen, so dass die Probe für das Vorhandensein und die relative Häufigkeit von mehreren Organismen in der Umwelt analysiert werden kann. Auf der anderen Seite initiiert Sequenz-spezifische Primer cDNA Synthese für exakte Sequenzen in nur einem oder wenigen Organismen gefunden. Dies ermöglicht eine ökologische Probe für einen bestimmten Zweck, wie die Bestimmung getestet werden, ob Norovirus, die Magen-Darm-Erkrankungen beim Menschen verursachen können, im Wasser vorhanden ist.


Figure 1
Abbildung 1. Schritt für Schritt Prozess der RT-PCR-Analyse von Umweltproben RNA.

Procedure

<>

(1) Entnahme von Proben: Bodenprobe

  1. Suchen Sie eine Probe Position über GPS-Koordinaten oder aus den Augen.
  2. Wählen Sie für zufällige Stichproben Zufallspunkte innerhalb eines Bereichs um eine allgemeine Volkszählung mikrobielle Habitate zu erhalten. Transekt Sampling sammelt von Punkten entlang einer geraden Linie, z.B.neben einem Bachbett. Raster-Proben sind systematisch Punkte in regelmäßigen Abständen entnommen und eignen sich für Zuordnung mikrobieller Gemeinschaften in einem Gebiet, unbekannt oder variabel.
  3. Probenahme in einem 3 bis 6 Zoll (7,5-15 cm) bietet tiefe Zugriff auf die am häufigsten vorkommende mikrobielle Aktivität, die in der Nähe, aber nicht in der Rhizosphäre (die schmale Region des Bodens direkt betroffen von Pflanzenwurzeln und ihre damit verbundenen Mikroorganismen) ist.
  4. Um die Bodenprobe zu erfassen, drücken Sie und drehen Sie eine Hand-Schnecke in den Boden auf die vorgegebene Tiefe.
  5. Heben Sie die Schnecke. Der Boden wird innerhalb der hohlen Stiel der Schnecke gefunden.
  6. Kratzen Sie den Boden an der Unterseite der Schnecke in eine Boden-Fangsack. Achten Sie darauf, nicht zu berühren oder den Boden zu verunreinigen.
  7. Beschriften Sie die Tasche richtig mit Standort, Name, Datum und Uhrzeit.
  8. Durchlaufen Sie im Labor den Boden eine 2-mm-Sieb um Kies und Felsen zu entfernen.
  9. Einen Teil des Bodens für Bodenfeuchte zu analysieren. Einzelheiten zu diesem Schritt siehe Jupiter Science Education video auf Bodenfeuchte.

2. Beispiel-Sammlung: Wasserprobe

  1. Finden Sie den Probe-Standort per GPS, Koordinaten oder aus den Augen.
  2. Sammeln Sie das Wasser in einer Vorratsflasche. Das Volumen des aufgefangenen Wassers zu erfassen; Wenn Mikroben in der Probe quantitativ untersucht werden, kann die mikrobielle Konzentration basierend auf den gesammelten Volumen ermittelt werden.
  3. Testen Sie sofort das Wasser für alle Parameter erforderlich für das Experiment (Temperatur, pH-Wert, Leitfähigkeit, Salzgehalt, Stickstoff und Phosphor Inhalt, etc.) mit der entsprechenden elektronischen Sonden.
  4. Stellen Sie die Flasche mit der Wasserprobe in eine Kühlbox mit Eis. Übertragen Sie den Kühler an das Labor.

(3) RNA-Extraktion

  1. Zu sammeln und Mikroorganismen aus der Umwelt Probe zu konzentrieren, entnehmen Sie bitte dem Jupiter Science Education video-on-Gemeinschaft Nukleinsäure-Extraktion.
  2. Viren mit einem kommerziellen Extraktion-Kit nach Herstellerangaben extrahieren Sie RNA.
  3. Kurz, zunächst die Proben mit Lyse Puffer ergänzt mit Ethanol mischen, dann die Proben in Spin Spalten hinzufügen.
  4. Zentrifugieren Sie die Spalten bei ca. 12.000 x g, verwerfen Bestrahlungskammer. Die Spalten Waschpuffer hinzufügen und erneut zentrifugieren.
  5. RNase-freies Wasser hinzufügen, um die Spalten und die Zentrifuge für 30 s an RNA in sterilen 1,5 mL niedrigem Kraftschlußbeiwert Microfuge Röhren eluieren.

(4) reverse Transkription - PCR

  1. Die folgenden Reagenzien von-20 ° C-Gefrierschrank abrufen: dNTP, konzentriert (z.B. 10 X) reverse Transkription Puffer, Primer (in diesem Beispiel, zufällige Primer). Tauen Sie diese auf Eis oder bei Raumtemperatur innerhalb eine cleane Motorhaube, und halten sie auf dem Eis einmal aufgetaut. Auch abgerufen Sie die Reverse Transkriptase und RNase-Inhibitor und halten sie auf dem Eis.
  2. Die Reagenz Volumina erforderlich, um eine "master-Mix", die alle Reagenzien verbindet konstant unter jede Reaktion zu berechnen (siehe Tabelle 1 für eine Probe-Reaktion). Bereiten Sie genügend master-Mix für jede Probe sowie eine Positivkontrolle (mit einer bekannten Protokoll-Vorlage) und negative (z.B.ohne Reverse Transkriptase, mit nur Wasser als Vorlage, etc.) Reaktionen zu kontrollieren. Enthalten Sie 10 % extra Volumen.
  3. Montieren Sie den master-Mix in 1,5 mL niedrigem Kraftschlußbeiwert Microfuge Röhren. Dadurch wird die Bindung von Reagenz-Molekülen, die Rohre Kunststoffwände minimiert.
  4. Wenn Reagenzien aufgetaut sind, fügen Sie berechnete Volumen das Microfuge Rohr hinzu. Sanft Wirbel und Zentrifugieren jedes Röhrchen vor der Addition. Achten Sie darauf, die Pipette Spitzenwechsel zwischen dem Hinzufügen jedes Reagens um Verunreinigungen zu verhindern.
  5. Nachdem alle Reagenzien sind hinzugekommen, Wirbel und Zentrifuge der master-Mix um eine homogene Mischung zu gewährleisten. Reagenzien in Lagerung bei-20 ° c zurückgestellt
  6. Bereiten Sie vor und beschriften Sie 8-Röhre PCR-Streifen, eine Röhre für jede Probe oder Kontrolle Reaktion benannt.
  7. Aliquoten ein gleiches Volumen des master-Mix in jedes Rohr. Fügen Sie dann die Reaktion-spezifische Komponenten, wie z. B. die RNA-Extrakte.
  8. Legen Sie die Streifen Kappe sicher auf den PCR-Streifen und Zentrifugieren in einem Minicentrifuge mit einem Streifen-Rohr-Adapter um sicherzustellen, alle Flüssigkeit am unteren Rand jedes Rohr (Abbildung 2) gesammelt werden.
  9. Ort-PCR-Streifen sicher im Thermocycler. Drücken Sie, um sicherzustellen, dass die Rohre befestigt sind.
  10. Festlegen der Thermocycler zum Ausführen des Programms für die RT verwendet wird (siehe Tabelle 2 für ein Probe-Protokoll). Wenn das Programm abgeschlossen ist, werden die Rohre cDNA Produkte enthalten, die dann PCR Verstärkung unterworfen werden können. Bitte Einzelheiten Sie zu den Jupiter Science Education Videos auf PCR und quantitative PCR. CDNA bei-20 ° C bis zu seiner Verwendung zu speichern.

Figure 2
Abbildung 2. Angeschnittene Ärmel 8-Röhre Streifen mit master-Mix und Extrakt.

Reagenz Volumen pro 1 Reaktion (μL)
10 x RT Buffer 2.0
25 x dNTPs 0,8
10 x zufällige Primer 2.0
Multiscribe 1.0
RNase-Inhibitor 1.0
Molekularen Klasse H2O 3.2
Gesamtvolumen 10

Tabelle 1. RT-Master Mix Zutaten.

Schritt 1 Schritt 2 Schritt 3 Schritt 4
25 ° C, 10 min 37 ° C, 120 min. 85 ° C, 5 min 4 ° C, ∞

Tabelle 2. RT-Reaktion-Thermocycler-Programm.

Reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion oder RT-PCR, ermöglicht die Erkennung von RNA-Viren und Mikroben Genexpression in der Umgebung.

Im Gegensatz zu zellulären Organismen von den Menschen, Bakterien, die DNA als ihr genetisches Material zu verwenden, haben einige Viren Genome von RNS, einschließlich viele pathogene Viren wie Grippe, Ebola und HIV gemacht. Während einige Viren entdeckt werden können, durch die Beobachtung des pathogenen Phänotyps, der entsteht, wenn Zellen in Zellkultur infizieren verwendet, hat eine Mehrheit keine kulturbasierte Charakterisierungsmethoden. RT-PCR kann verwendet werden, um das Vorhandensein dieser Viren in der Umwelt mit hoher Empfindlichkeit zu erkennen.

Zur gleichen Zeit express"" Organismen mit DNA-basierte Genome die genetische Information in ihrem DNA-Genom kodiert, indem "Transkription" in Messenger oder "m" RNA, die dann "in Proteine enzymatische oder strukturelle Aufgabe in Zellen übersetzt werden kann". Wie Mikroben reagieren und zur Anpassung an Veränderungen in der Umwelt durch ein- oder Ausschalten der verschiedenen genetischen Wege, kann RT-PCR verwendet werden, um solche Veränderungen in der Genexpression als potenzielle Ökosystem Assessoren dienen zu überwachen.

Dieses Video geht über die Grundsätze der RT-PCR eine verallgemeinerte Verfahren um diese Technik zu skizzieren, und schließlich betrachten wir einige der Möglichkeiten, die diese Methode in der Umweltmikrobiologie heute angewendet wird.

Es gibt zwei wichtige Teile zu diesem Verfahren: die Gewinnung von RNA aus biologischen Proben, gefolgt von der reversen Transkription in DNA.

Die Isolation der RNA beinhaltet lyse der Zellen in der Probe durch Zugabe von Waschmittel, die Lipide und Proteine, gefolgt von mechanischen Störungen abbaut. Gewinnung von RNA aus Viren in der Regel erfordert die Zugabe von Proteinasen, die Protein zu verdauen sind Enzyme zum Abbau der Viren Capsids - die harte Protein-Mäntel, die die Viruspartikel zu bilden. Auf der anderen Seite kann bei der RNA aus zellulären Organismen zu erhalten, die lysate mit DNA-abbauenden Enzymen oder DNAases nachgeschalteten Ergebnisse wird durch die Anwesenheit von chemisch ähnlichen DNA verwechselt zu vermeiden behandelt werden müssen.

RNA kann dann von Lysaten in zwei Arten gereinigt werden. In einer Methode, bekannt als Säure Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion wird die lysate mit einer Bio-wässrige Mischung gemischt, die dann zentrifugiert, um die Phasen trennen. Proteine werden in die organische Phase lysierten Zellenrückstand in den bewölkten Interphase und Nukleinsäuren in der wässrigen Phase unterteilt werden. Die oberen wässrige Phase kann dann abgeholt werden, und RNA wird durch den Zusatz von Alkohol wie Isopropanol, das verringert die Nukleinsäure Löslichkeit in Wasser ausgefällt.

Spaltenbasierten RNA isoliert ist die lysate mit Alkohol vermischt und dann durch ein Gel-Filtration-Spalte mit einem negativ geladenen Harz, wie Kieselsäure. Die lysate ist vorbereitet, so dass positiv geladene Ionen in Puffer Form "Salz Brücken", die das negativ geladene Phosphat-Rückgrat der Nukleinsäuren binden an das Harz erlauben. Andere Verunreinigungen sind dann weggespült. Nukleinsäuren sind aus der Spalte mit einer salzarmen Puffer oder Wasser "eluiert". Da einsträngige RNA weniger negative Ladungen als doppelsträngige DNA hat, kann es bevorzugt mit Puffern von bestimmten Konzentrationen eluiert werden.

Einmal isoliert, chemisch stabilen DNA RNA verwandelt. Wissenschaftler haben ein Enzym, das natürlich von Retroviren, wie HIV kodiert genutzt. Dieses Enzym wird als Reverse Transkriptase oder "RT" bezeichnet.

RT synthetisiert ergänzende oder "C" DNA aus einem kurzen Stück von Nukleotiden bekannt als Grundierung. Diese Grundierung kann verschiedene Sequenzen, je nach Zweck des Experiments haben. Beispielsweise kann die Grundierung gestaltet werden, eine bestimmte Reihenfolge haben, um bestimmte Gene oder Organismen zu erkennen. Sobald synthetisiert, kann dieses "ersten Strang" cDNA durch regelmäßige PCR verstärkt werden.

Jetzt haben wir ein Verständnis der Prinzipien hinter RT-PCR, ein Protokoll für die Durchführung dieser Technik auf RNA-Proben aus der Umgebung betrachten.

Um den Vorgang zu starten, finden Sie ein Beispiel Abholort mit GPS-Koordinaten oder aus den Augen. Wählen Sie zufällige Punkte innerhalb eines Bereichs um einen allgemeinen Überblick über mikrobielle Habitate zu erhalten.

Um die festen Probe sammeln, drücken Sie und drehen Sie eine Hand-Schnecke in den Boden-Boden auf die vorgegebene Tiefe. Wenn die Schnecke aufgehoben wird, findet man Boden innerhalb der hohlen Stiel der Schnecke.

Dieser Boden ist direkt in einen Auffangbeutel Boden gekratzt und die Tasche ist beschriftet mit Standort, Name, Datum, Zeit der Sammlung und alle weiteren notwendigen Informationen.

Den Boden im Labor zu übertragen und ein 2-mm-Sieb, Kies und Fels zu entfernen den Boden durchlaufen. Analysieren Sie eine Probe des Bodens für den Feuchtigkeitsgehalt, die informativ über das Niveau der mikrobiellen Aktivität im Boden sein kann. Um dies zu tun, finden Sie diese Sammlung video "Bestimmung der Feuchtigkeit Content of Soil".

Wählen Sie für Wasser-Musterkollektion einen Ort von Interesse, die ähnlich wie Boden-Sammlung, und sammeln Sie Wasser in eine sterile dickwandigen Plastikflasche. Achten Sie auf das Volumen des Wassers gesammelt. Test das Wasser sofort für Parameter wie Temperatur, pH-Wert und Salzgehalt, die wichtige über erwartete mikrobielle Niveau in der Probe Informationen. Dann stellen Sie die Flasche in den Kühler und Transfer ins Labor.

Mikroorganismen wie Viren werden gesammelt und von der Umwelt Probe konzentriert.

RNA kann aus den gesammelten Viren durch die Spin-Spalte-Methode mit kommerziellen RNA-Extraktion-Kits nach Anweisungen des Herstellers extrahiert werden. Lyse Puffer, ergänzt mit Ethanol, ist zunächst mit der Probe gemischt. Legen Sie die entsprechende Anzahl an Spalten Spin in Röhrchen, dann gelten Sie die Proben auf die Spalte Matrix. Zentrifugieren Sie die Spalten bei ca. 12.000 x g für 1 – 2 min., die Nukleinsäuren binden an die Spalte, und die Flüssigkeit durchströmten entsorgen zu lassen.

Die Spalten Waschpuffer hinzufügen und erneut zentrifugieren. Legen Sie die Spalten in neue, sterile 1,5 mL geringe Haftung Microfuge Röhren. Fügen Sie Wasser, das frei von RNases, sind Enzyme, die RNA, zu Spalten und Zentrifuge für 30 abgebaut s, um die RNA zu eluieren. Die eluierten RNA kann bei-80 ° C bis zum Gebrauch gespeichert werden.

Vor dem Experiment sollte entsprechende Primer entworfen werden, um die Sequenzen von Interesse, zu erkennen, die als Marker für das Vorhandensein von bestimmten Mikroorganismen dienen kann.

Nehmen Sie die RT-Reagenzien bei-20 ° C gelagert und tauen Sie die gefrorenen Reagenzien auf Eis (oder bei Raumtemperatur). Dazu gehören Nukleotide, reverse Transkription Puffer und Grundierungen. Einmal aufgetaut, halten Sie die Reagenzien auf Eis; das Enzym Reverse Transkriptase und RNase-Inhibitor sollte immer auf Eis gehalten werden.

Während die Reagenzien Auftauen sind, berechnen der Mengen und Konzentrationen der Komponenten der Reaktion. Sobald die Reagenzien aufgetaut sind, sanft Wirbel und Spin jedes Rohr um den Inhalt zu gewährleisten sind gut gemischt.

Arbeiten in einem Laminar-Flow-Abzug auf Kontamination zu vermeiden, montieren Sie die Komponenten in einer master-Mix hinzufügen zu jedem PCR-Röhrchen. Bei der Montage der master-Mix in ein Eppendorf-Röhrchen unbedingt ändern Pipettenspitzen zwischen jedes Reagens um Kontaminationen zu vermeiden. Nachdem alle Reagenzien zu Eppendorf Tube hinzugekommen sind, mischen vorsichtig Vortex und Spin-down der Meister Röhre um eine homogene Mischung zu gewährleisten.

Beschriften Sie eine Reihe von PCR-Röhrchen, und achten Sie auf Steuerelemente enthalten. Aliquoten ein gleiches Volumen an den master-Mix in jedes Rohr. Fügen Sie dann die Reaktion-spezifische Komponenten, wie z. B. die RNA-Extrakte oder Wasser für die negativ-Kontrolle.

Sobald alle Komponenten hinzugefügt werden, legen Sie die Rohre in einem Thermocycler und reversen Transkription auszuführenden Programms eingestellt. Die cDNA kann dann PCR Verstärkung unterworfen werden. Eine ausführliche Beschreibung dieses Schrittes finden Sie in dieser Sammlung Video-on-PCR.

Wenn die PCR abgeschlossen ist, können einige das PCR-Produkt getrennt und auf ein Agarosegel visualisiert. Zum Beispiel diente eine Gen-spezifische Primer hier auf das Vorhandensein eines RNA-Virus zu erkennen. Bands die erwartete Größe ergeben sich aus der RT-PCR-Reaktion aber nicht aus den Negativkontrollen, auf das Vorhandensein des Virus in der Wasserprobe getestet.

Die Identifizierung von RNA-basierten Mikroorganismen mittels RT-PCR ermöglicht Analyse der ökologischen Gesundheit, Risiken für die Umwelt und die Erhaltung der Biodiversität.

Die Verwendung von Mikroorganismen zu bereinigen, Kohlenwasserstoffe und Lösungsmittel aus verschmutzten Boden und Wasser stellt eine umweltfreundliches Sanierung Alternative dar. Native mikrobielle Genexpression zu verstehen kann spezifische mikrobielle Wege hervorheben, die Verunreinigungen unter diesen Bedingungen brechen. RT-PCR wird oft genutzt, um mRNA aus solchen Umweltproben zu verstärken.

Gesundheitspolitische Maßnahmen erfordern oft schnelle Überwachung der viralen Quellen der Infektion in der Umgebung. Vogelgrippe, beispielsweise ist hoch ansteckend und kann sich schnell ausbreiten, Geflügel, Vieh und sogar Menschen. In diesem speziellen Beispiel suchten Forscher die Gefahr der Vogelgrippe durch Wildvögel zu verbreiten.

Mit einem tragbaren RT-PCR Setup und Apparat, untersucht sie eine Reihe von Wildvögeln, auch in abgelegenen Gegenden, um Infektionen frühzeitig zu erkennen und verhindern die Übertragung.

Zu guter Letzt kann RT-PCR verwendet werden, zu charakterisieren "Biopestizide" entwickelt Ziel Schädlinge wie die glasig-winged Sharpshooter, Homalodisca Vitripennis, des Hosts für eine Krankheit, die Weinreben in Nordamerika stark schädigt. Ein neuartiger einsträngige RNA-Virus wird als Vermittler, dieses Insekt zu infizieren entwickelt. Mit einer Kombination der Homalodisca Zellkultur und RT-PCR-Bestätigung der Viruslast, konnten diese Autoren eine hohe Konzentration des Virus für den Einsatz als eine biologische Schädlingsbekämpfungsmittel zu propagieren.

Sie sah nur Jupiters Einführung in Analyzing RNA-Based Umweltorganismen durch RT-PCR. Sie sollten jetzt die Theorie hinter dem Protokoll verstehen wie man die Technik für Ihre Forschung, und einige der Möglichkeiten, in denen es im Bereich heute dient, gelten. Danke fürs Zuschauen!

Results

Wenn die RT - PCR abgeschlossen ist, können einige das PCR-Produkt getrennt und visualisiert auf einer Agarosegel (Abbildung 3). In diesem Beispiel wurde eine Gen-spezifische Primer verwendet, um auf das Vorhandensein eines RNA-Virus zu erkennen. Bands die erwartete Größe werden von zwei der Proben und die Positivkontrolle Reaktion, aber nicht von der negativen Kontrolle, auf das Vorhandensein des Virus in zwei der getesteten Wasserproben gewonnen.

Figure 3
Abbildung 3. Gelelektrophorese von RT-PCR-Produkten. M: DNA Größe Marker; P: Positivkontrolle; N: Negativkontrolle. Reaktionen mit RNA aus vier Wasserproben wurden in Bahnen 1, 2, 3 und 5 laufen.

Applications and Summary

RT-PCR ist notwendig für die Erstellung von cDNA aus einer RNA-Vorlage. Dies ermöglicht RNA-basierten Mikroorganismen analysierten Nutzung molekularer Assays für DNA entwickelt werden. Sobald die cDNA synthetisiert wird, bestimmen das Vorhandensein oder Fehlen von RNA-basierten Mikroorganismen innerhalb einer ökologischen Probe PCR-Assays. Dies ermöglicht weitere nachgelagerte Analyse zur Bestimmung der mikrobiellen Ökologie, Gesundheitsrisiken und Umweltrisiken.

RT-PCR kann auch genutzt werden, um assay mRNA als Mittel zu beobachten, welche Gene in einer Umgebung zum Ausdruck gebracht werden. Dies gibt Aufschluss darüber, welche Proteine und Wege Mikroben auf verlassen, um insbesondere Umweltbedingungen zu überleben. Genexpressionsanalysen können mikrobielle Wege dieser Aufschlüsselung Umweltkontaminanten wie Kohlenwasserstoffe oder chlorierten identifizieren und Mikroben mit diese Wege können für Bioremediation nutzbar gemacht werden.

Risikobewertung beinhaltet RT-PCR um Risiken für die Gesundheit von Mensch und Umwelt zu analysieren. Kombination von RT mit quantitativer PCR ermöglicht RNA-Viren innerhalb von Proben, aufgelistet werden sollen, so dass Exposition von Mensch und Umwelt für die Zwecke der quantitativen mikrobielle Risiko Bewertung (QMRA) berechnet werden kann.

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(1) Entnahme von Proben: Bodenprobe

  1. Suchen Sie eine Probe Position über GPS-Koordinaten oder aus den Augen.
  2. Wählen Sie für zufällige Stichproben Zufallspunkte innerhalb eines Bereichs um eine allgemeine Volkszählung mikrobielle Habitate zu erhalten. Transekt Sampling sammelt von Punkten entlang einer geraden Linie, z.B.neben einem Bachbett. Raster-Proben sind systematisch Punkte in regelmäßigen Abständen entnommen und eignen sich für Zuordnung mikrobieller Gemeinschaften in einem Gebiet, unbekannt oder variabel.
  3. Probenahme in einem 3 bis 6 Zoll (7,5-15 cm) bietet tiefe Zugriff auf die am häufigsten vorkommende mikrobielle Aktivität, die in der Nähe, aber nicht in der Rhizosphäre (die schmale Region des Bodens direkt betroffen von Pflanzenwurzeln und ihre damit verbundenen Mikroorganismen) ist.
  4. Um die Bodenprobe zu erfassen, drücken Sie und drehen Sie eine Hand-Schnecke in den Boden auf die vorgegebene Tiefe.
  5. Heben Sie die Schnecke. Der Boden wird innerhalb der hohlen Stiel der Schnecke gefunden.
  6. Kratzen Sie den Boden an der Unterseite der Schnecke in eine Boden-Fangsack. Achten Sie darauf, nicht zu berühren oder den Boden zu verunreinigen.
  7. Beschriften Sie die Tasche richtig mit Standort, Name, Datum und Uhrzeit.
  8. Durchlaufen Sie im Labor den Boden eine 2-mm-Sieb um Kies und Felsen zu entfernen.
  9. Einen Teil des Bodens für Bodenfeuchte zu analysieren. Einzelheiten zu diesem Schritt siehe Jupiter Science Education video auf Bodenfeuchte.

2. Beispiel-Sammlung: Wasserprobe

  1. Finden Sie den Probe-Standort per GPS, Koordinaten oder aus den Augen.
  2. Sammeln Sie das Wasser in einer Vorratsflasche. Das Volumen des aufgefangenen Wassers zu erfassen; Wenn Mikroben in der Probe quantitativ untersucht werden, kann die mikrobielle Konzentration basierend auf den gesammelten Volumen ermittelt werden.
  3. Testen Sie sofort das Wasser für alle Parameter erforderlich für das Experiment (Temperatur, pH-Wert, Leitfähigkeit, Salzgehalt, Stickstoff und Phosphor Inhalt, etc.) mit der entsprechenden elektronischen Sonden.
  4. Stellen Sie die Flasche mit der Wasserprobe in eine Kühlbox mit Eis. Übertragen Sie den Kühler an das Labor.

(3) RNA-Extraktion

  1. Zu sammeln und Mikroorganismen aus der Umwelt Probe zu konzentrieren, entnehmen Sie bitte dem Jupiter Science Education video-on-Gemeinschaft Nukleinsäure-Extraktion.
  2. Viren mit einem kommerziellen Extraktion-Kit nach Herstellerangaben extrahieren Sie RNA.
  3. Kurz, zunächst die Proben mit Lyse Puffer ergänzt mit Ethanol mischen, dann die Proben in Spin Spalten hinzufügen.
  4. Zentrifugieren Sie die Spalten bei ca. 12.000 x g, verwerfen Bestrahlungskammer. Die Spalten Waschpuffer hinzufügen und erneut zentrifugieren.
  5. RNase-freies Wasser hinzufügen, um die Spalten und die Zentrifuge für 30 s an RNA in sterilen 1,5 mL niedrigem Kraftschlußbeiwert Microfuge Röhren eluieren.

(4) reverse Transkription - PCR

  1. Die folgenden Reagenzien von-20 ° C-Gefrierschrank abrufen: dNTP, konzentriert (z.B. 10 X) reverse Transkription Puffer, Primer (in diesem Beispiel, zufällige Primer). Tauen Sie diese auf Eis oder bei Raumtemperatur innerhalb eine cleane Motorhaube, und halten sie auf dem Eis einmal aufgetaut. Auch abgerufen Sie die Reverse Transkriptase und RNase-Inhibitor und halten sie auf dem Eis.
  2. Die Reagenz Volumina erforderlich, um eine "master-Mix", die alle Reagenzien verbindet konstant unter jede Reaktion zu berechnen (siehe Tabelle 1 für eine Probe-Reaktion). Bereiten Sie genügend master-Mix für jede Probe sowie eine Positivkontrolle (mit einer bekannten Protokoll-Vorlage) und negative (z.B.ohne Reverse Transkriptase, mit nur Wasser als Vorlage, etc.) Reaktionen zu kontrollieren. Enthalten Sie 10 % extra Volumen.
  3. Montieren Sie den master-Mix in 1,5 mL niedrigem Kraftschlußbeiwert Microfuge Röhren. Dadurch wird die Bindung von Reagenz-Molekülen, die Rohre Kunststoffwände minimiert.
  4. Wenn Reagenzien aufgetaut sind, fügen Sie berechnete Volumen das Microfuge Rohr hinzu. Sanft Wirbel und Zentrifugieren jedes Röhrchen vor der Addition. Achten Sie darauf, die Pipette Spitzenwechsel zwischen dem Hinzufügen jedes Reagens um Verunreinigungen zu verhindern.
  5. Nachdem alle Reagenzien sind hinzugekommen, Wirbel und Zentrifuge der master-Mix um eine homogene Mischung zu gewährleisten. Reagenzien in Lagerung bei-20 ° c zurückgestellt
  6. Bereiten Sie vor und beschriften Sie 8-Röhre PCR-Streifen, eine Röhre für jede Probe oder Kontrolle Reaktion benannt.
  7. Aliquoten ein gleiches Volumen des master-Mix in jedes Rohr. Fügen Sie dann die Reaktion-spezifische Komponenten, wie z. B. die RNA-Extrakte.
  8. Legen Sie die Streifen Kappe sicher auf den PCR-Streifen und Zentrifugieren in einem Minicentrifuge mit einem Streifen-Rohr-Adapter um sicherzustellen, alle Flüssigkeit am unteren Rand jedes Rohr (Abbildung 2) gesammelt werden.
  9. Ort-PCR-Streifen sicher im Thermocycler. Drücken Sie, um sicherzustellen, dass die Rohre befestigt sind.
  10. Festlegen der Thermocycler zum Ausführen des Programms für die RT verwendet wird (siehe Tabelle 2 für ein Probe-Protokoll). Wenn das Programm abgeschlossen ist, werden die Rohre cDNA Produkte enthalten, die dann PCR Verstärkung unterworfen werden können. Bitte Einzelheiten Sie zu den Jupiter Science Education Videos auf PCR und quantitative PCR. CDNA bei-20 ° C bis zu seiner Verwendung zu speichern.

Figure 2
Abbildung 2. Angeschnittene Ärmel 8-Röhre Streifen mit master-Mix und Extrakt.

Reagenz Volumen pro 1 Reaktion (μL)
10 x RT Buffer 2.0
25 x dNTPs 0,8
10 x zufällige Primer 2.0
Multiscribe 1.0
RNase-Inhibitor 1.0
Molekularen Klasse H2O 3.2
Gesamtvolumen 10

Tabelle 1. RT-Master Mix Zutaten.

Schritt 1 Schritt 2 Schritt 3 Schritt 4
25 ° C, 10 min 37 ° C, 120 min. 85 ° C, 5 min 4 ° C, ∞

Tabelle 2. RT-Reaktion-Thermocycler-Programm.

Reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion oder RT-PCR, ermöglicht die Erkennung von RNA-Viren und Mikroben Genexpression in der Umgebung.

Im Gegensatz zu zellulären Organismen von den Menschen, Bakterien, die DNA als ihr genetisches Material zu verwenden, haben einige Viren Genome von RNS, einschließlich viele pathogene Viren wie Grippe, Ebola und HIV gemacht. Während einige Viren entdeckt werden können, durch die Beobachtung des pathogenen Phänotyps, der entsteht, wenn Zellen in Zellkultur infizieren verwendet, hat eine Mehrheit keine kulturbasierte Charakterisierungsmethoden. RT-PCR kann verwendet werden, um das Vorhandensein dieser Viren in der Umwelt mit hoher Empfindlichkeit zu erkennen.

Zur gleichen Zeit express"" Organismen mit DNA-basierte Genome die genetische Information in ihrem DNA-Genom kodiert, indem "Transkription" in Messenger oder "m" RNA, die dann "in Proteine enzymatische oder strukturelle Aufgabe in Zellen übersetzt werden kann". Wie Mikroben reagieren und zur Anpassung an Veränderungen in der Umwelt durch ein- oder Ausschalten der verschiedenen genetischen Wege, kann RT-PCR verwendet werden, um solche Veränderungen in der Genexpression als potenzielle Ökosystem Assessoren dienen zu überwachen.

Dieses Video geht über die Grundsätze der RT-PCR eine verallgemeinerte Verfahren um diese Technik zu skizzieren, und schließlich betrachten wir einige der Möglichkeiten, die diese Methode in der Umweltmikrobiologie heute angewendet wird.

Es gibt zwei wichtige Teile zu diesem Verfahren: die Gewinnung von RNA aus biologischen Proben, gefolgt von der reversen Transkription in DNA.

Die Isolation der RNA beinhaltet lyse der Zellen in der Probe durch Zugabe von Waschmittel, die Lipide und Proteine, gefolgt von mechanischen Störungen abbaut. Gewinnung von RNA aus Viren in der Regel erfordert die Zugabe von Proteinasen, die Protein zu verdauen sind Enzyme zum Abbau der Viren Capsids - die harte Protein-Mäntel, die die Viruspartikel zu bilden. Auf der anderen Seite kann bei der RNA aus zellulären Organismen zu erhalten, die lysate mit DNA-abbauenden Enzymen oder DNAases nachgeschalteten Ergebnisse wird durch die Anwesenheit von chemisch ähnlichen DNA verwechselt zu vermeiden behandelt werden müssen.

RNA kann dann von Lysaten in zwei Arten gereinigt werden. In einer Methode, bekannt als Säure Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion wird die lysate mit einer Bio-wässrige Mischung gemischt, die dann zentrifugiert, um die Phasen trennen. Proteine werden in die organische Phase lysierten Zellenrückstand in den bewölkten Interphase und Nukleinsäuren in der wässrigen Phase unterteilt werden. Die oberen wässrige Phase kann dann abgeholt werden, und RNA wird durch den Zusatz von Alkohol wie Isopropanol, das verringert die Nukleinsäure Löslichkeit in Wasser ausgefällt.

Spaltenbasierten RNA isoliert ist die lysate mit Alkohol vermischt und dann durch ein Gel-Filtration-Spalte mit einem negativ geladenen Harz, wie Kieselsäure. Die lysate ist vorbereitet, so dass positiv geladene Ionen in Puffer Form "Salz Brücken", die das negativ geladene Phosphat-Rückgrat der Nukleinsäuren binden an das Harz erlauben. Andere Verunreinigungen sind dann weggespült. Nukleinsäuren sind aus der Spalte mit einer salzarmen Puffer oder Wasser "eluiert". Da einsträngige RNA weniger negative Ladungen als doppelsträngige DNA hat, kann es bevorzugt mit Puffern von bestimmten Konzentrationen eluiert werden.

Einmal isoliert, chemisch stabilen DNA RNA verwandelt. Wissenschaftler haben ein Enzym, das natürlich von Retroviren, wie HIV kodiert genutzt. Dieses Enzym wird als Reverse Transkriptase oder "RT" bezeichnet.

RT synthetisiert ergänzende oder "C" DNA aus einem kurzen Stück von Nukleotiden bekannt als Grundierung. Diese Grundierung kann verschiedene Sequenzen, je nach Zweck des Experiments haben. Beispielsweise kann die Grundierung gestaltet werden, eine bestimmte Reihenfolge haben, um bestimmte Gene oder Organismen zu erkennen. Sobald synthetisiert, kann dieses "ersten Strang" cDNA durch regelmäßige PCR verstärkt werden.

Jetzt haben wir ein Verständnis der Prinzipien hinter RT-PCR, ein Protokoll für die Durchführung dieser Technik auf RNA-Proben aus der Umgebung betrachten.

Um den Vorgang zu starten, finden Sie ein Beispiel Abholort mit GPS-Koordinaten oder aus den Augen. Wählen Sie zufällige Punkte innerhalb eines Bereichs um einen allgemeinen Überblick über mikrobielle Habitate zu erhalten.

Um die festen Probe sammeln, drücken Sie und drehen Sie eine Hand-Schnecke in den Boden-Boden auf die vorgegebene Tiefe. Wenn die Schnecke aufgehoben wird, findet man Boden innerhalb der hohlen Stiel der Schnecke.

Dieser Boden ist direkt in einen Auffangbeutel Boden gekratzt und die Tasche ist beschriftet mit Standort, Name, Datum, Zeit der Sammlung und alle weiteren notwendigen Informationen.

Den Boden im Labor zu übertragen und ein 2-mm-Sieb, Kies und Fels zu entfernen den Boden durchlaufen. Analysieren Sie eine Probe des Bodens für den Feuchtigkeitsgehalt, die informativ über das Niveau der mikrobiellen Aktivität im Boden sein kann. Um dies zu tun, finden Sie diese Sammlung video "Bestimmung der Feuchtigkeit Content of Soil".

Wählen Sie für Wasser-Musterkollektion einen Ort von Interesse, die ähnlich wie Boden-Sammlung, und sammeln Sie Wasser in eine sterile dickwandigen Plastikflasche. Achten Sie auf das Volumen des Wassers gesammelt. Test das Wasser sofort für Parameter wie Temperatur, pH-Wert und Salzgehalt, die wichtige über erwartete mikrobielle Niveau in der Probe Informationen. Dann stellen Sie die Flasche in den Kühler und Transfer ins Labor.

Mikroorganismen wie Viren werden gesammelt und von der Umwelt Probe konzentriert.

RNA kann aus den gesammelten Viren durch die Spin-Spalte-Methode mit kommerziellen RNA-Extraktion-Kits nach Anweisungen des Herstellers extrahiert werden. Lyse Puffer, ergänzt mit Ethanol, ist zunächst mit der Probe gemischt. Legen Sie die entsprechende Anzahl an Spalten Spin in Röhrchen, dann gelten Sie die Proben auf die Spalte Matrix. Zentrifugieren Sie die Spalten bei ca. 12.000 x g für 1 – 2 min., die Nukleinsäuren binden an die Spalte, und die Flüssigkeit durchströmten entsorgen zu lassen.

Die Spalten Waschpuffer hinzufügen und erneut zentrifugieren. Legen Sie die Spalten in neue, sterile 1,5 mL geringe Haftung Microfuge Röhren. Fügen Sie Wasser, das frei von RNases, sind Enzyme, die RNA, zu Spalten und Zentrifuge für 30 abgebaut s, um die RNA zu eluieren. Die eluierten RNA kann bei-80 ° C bis zum Gebrauch gespeichert werden.

Vor dem Experiment sollte entsprechende Primer entworfen werden, um die Sequenzen von Interesse, zu erkennen, die als Marker für das Vorhandensein von bestimmten Mikroorganismen dienen kann.

Nehmen Sie die RT-Reagenzien bei-20 ° C gelagert und tauen Sie die gefrorenen Reagenzien auf Eis (oder bei Raumtemperatur). Dazu gehören Nukleotide, reverse Transkription Puffer und Grundierungen. Einmal aufgetaut, halten Sie die Reagenzien auf Eis; das Enzym Reverse Transkriptase und RNase-Inhibitor sollte immer auf Eis gehalten werden.

Während die Reagenzien Auftauen sind, berechnen der Mengen und Konzentrationen der Komponenten der Reaktion. Sobald die Reagenzien aufgetaut sind, sanft Wirbel und Spin jedes Rohr um den Inhalt zu gewährleisten sind gut gemischt.

Arbeiten in einem Laminar-Flow-Abzug auf Kontamination zu vermeiden, montieren Sie die Komponenten in einer master-Mix hinzufügen zu jedem PCR-Röhrchen. Bei der Montage der master-Mix in ein Eppendorf-Röhrchen unbedingt ändern Pipettenspitzen zwischen jedes Reagens um Kontaminationen zu vermeiden. Nachdem alle Reagenzien zu Eppendorf Tube hinzugekommen sind, mischen vorsichtig Vortex und Spin-down der Meister Röhre um eine homogene Mischung zu gewährleisten.

Beschriften Sie eine Reihe von PCR-Röhrchen, und achten Sie auf Steuerelemente enthalten. Aliquoten ein gleiches Volumen an den master-Mix in jedes Rohr. Fügen Sie dann die Reaktion-spezifische Komponenten, wie z. B. die RNA-Extrakte oder Wasser für die negativ-Kontrolle.

Sobald alle Komponenten hinzugefügt werden, legen Sie die Rohre in einem Thermocycler und reversen Transkription auszuführenden Programms eingestellt. Die cDNA kann dann PCR Verstärkung unterworfen werden. Eine ausführliche Beschreibung dieses Schrittes finden Sie in dieser Sammlung Video-on-PCR.

Wenn die PCR abgeschlossen ist, können einige das PCR-Produkt getrennt und auf ein Agarosegel visualisiert. Zum Beispiel diente eine Gen-spezifische Primer hier auf das Vorhandensein eines RNA-Virus zu erkennen. Bands die erwartete Größe ergeben sich aus der RT-PCR-Reaktion aber nicht aus den Negativkontrollen, auf das Vorhandensein des Virus in der Wasserprobe getestet.

Die Identifizierung von RNA-basierten Mikroorganismen mittels RT-PCR ermöglicht Analyse der ökologischen Gesundheit, Risiken für die Umwelt und die Erhaltung der Biodiversität.

Die Verwendung von Mikroorganismen zu bereinigen, Kohlenwasserstoffe und Lösungsmittel aus verschmutzten Boden und Wasser stellt eine umweltfreundliches Sanierung Alternative dar. Native mikrobielle Genexpression zu verstehen kann spezifische mikrobielle Wege hervorheben, die Verunreinigungen unter diesen Bedingungen brechen. RT-PCR wird oft genutzt, um mRNA aus solchen Umweltproben zu verstärken.

Gesundheitspolitische Maßnahmen erfordern oft schnelle Überwachung der viralen Quellen der Infektion in der Umgebung. Vogelgrippe, beispielsweise ist hoch ansteckend und kann sich schnell ausbreiten, Geflügel, Vieh und sogar Menschen. In diesem speziellen Beispiel suchten Forscher die Gefahr der Vogelgrippe durch Wildvögel zu verbreiten.

Mit einem tragbaren RT-PCR Setup und Apparat, untersucht sie eine Reihe von Wildvögeln, auch in abgelegenen Gegenden, um Infektionen frühzeitig zu erkennen und verhindern die Übertragung.

Zu guter Letzt kann RT-PCR verwendet werden, zu charakterisieren "Biopestizide" entwickelt Ziel Schädlinge wie die glasig-winged Sharpshooter, Homalodisca Vitripennis, des Hosts für eine Krankheit, die Weinreben in Nordamerika stark schädigt. Ein neuartiger einsträngige RNA-Virus wird als Vermittler, dieses Insekt zu infizieren entwickelt. Mit einer Kombination der Homalodisca Zellkultur und RT-PCR-Bestätigung der Viruslast, konnten diese Autoren eine hohe Konzentration des Virus für den Einsatz als eine biologische Schädlingsbekämpfungsmittel zu propagieren.

Sie sah nur Jupiters Einführung in Analyzing RNA-Based Umweltorganismen durch RT-PCR. Sie sollten jetzt die Theorie hinter dem Protokoll verstehen wie man die Technik für Ihre Forschung, und einige der Möglichkeiten, in denen es im Bereich heute dient, gelten. Danke fürs Zuschauen!

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