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Enumeración de las algas mediante metodología cultivable
 
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Enumeración de las algas mediante metodología cultivable

Overview

Fuente: Laboratorios del Dr. Ian Pepper y el Dr. Charles Gerba - Universidad de Arizona
Demostrando autor: Bradley Schmitz

Las algas son un grupo muy heterogéneo de microorganismos que tienen un rasgo común, es decir, la posesión de pigmentos fotosintéticos. En el ambiente, las algas pueden causar problemas para los propietarios de la piscina por el aumento en el agua. Las algas también pueden causar problemas en las aguas superficiales, como lagos y embalses, debido a que liberan toxinas algales. Más recientemente, las algas están siendo evaluadas como nuevas fuentes de energía a través biocombustibles algas. Algas son realmente las bacterias clasificadas como cianobacterias. Cyanobacteria no sólo producir, sino que también tiene la capacidad para fijar nitrógeno de la atmósfera. Otras algas son eucariotas, desde organismos unicelulares hasta organismos multicelulares complejos, como algas. Estos incluyen las algas verdes, los euglenoides, los dinoflagelados, las doradas Algas marrones, diatomeas, las algas marrones y las algas rojas. En los suelos, las poblaciones de algas son frecuentemente 106 por gramo. Estos números son menores que los números correspondientes para bacterias, actinomicetos y hongos, sobre todo porque la luz solar necesaria para la fotosíntesis no puede penetrar bajo la superficie del suelo.

Porque las algas son fototróficas, obtención de energía de la fotosíntesis y el carbono de la biomasa a partir de dióxido de carbono, pueden cultivarse en medios de cultivo que consiste en la totalidad de nutrientes inorgánicos y sin un sustrato de carbono orgánico. La falta de sustrato orgánico impide el crecimiento de bacterias heterotróficas. Utilizando un medio de crecimiento inorgánico, algas originalmente presentan en suelo o agua puede ser cuantificado por el método del número más probable para el (MPN). El método MPN se basa en diluir sucesivamente una muestra, tal que las algas se se diluyen a la extinción. La presencia de algas en cualquier dilución es determinada por un signo positivo de crecimiento en el medio, que suele ser una baba verde de algas que resulta de la fotosíntesis. Uso de tubos de replicar a cada dilución y una evaluación estadística del número de tubos positivos para el crecimiento en cualquier dilución determinada permiten el número de algas presentes en la muestra original para calcular. Tablas MPN se han desarrollado y publicado específico para un diseño particular de la MPN, incluyendo el número de repeticiones en cada dilución.

Procedure

  1. Pesar una muestra de 10 g de suelo que ha sido recogida húmeda del campo, o había agua agregado a él para que permanezca húmedo durante 2-3 días. Tenga en cuenta que el suelo debe ser húmedo pero no saturado.
  2. Preparar una serie de diluciones 10 veces mediante la adición de 10 g de suelo en 95 mL de solución de Bristol modificado (figura 1). Para crear solución de Bristol modificado, disolver las siguientes en 1.000 mL de agua: 0.25 g de NaNO3, 0,025 g CaCl2, 0,075 g de MgSO4 · 7H2O, 0,075 g de K2HPO4, 0,018 g KH2PO4, 0,025 g NaCl y 0,5 mg FECLAS3.
  3. Seguir con la serie de la dilución por la adición de 1 mL de suspensión A 9 mL de la solución y más diluciones secuenciales de Bristol.
  4. Inocular los 5 tubos de replicar cada que contiene 9 mL de solución de Bristol modificado con 1 mL de las diluciones 10-2 a 10-6 (tabla 1).
  5. Incubar los tubos cerrados hasta por 4 semanas en un área expuesta a la luz solar.
  6. Observar los tubos para el crecimiento de las algas una vez cada 7 días. Tubos con crecimiento de las algas aparecen verdes.

Figure 1
Figura 1. Cómo hacer una serie de diluciones 10 veces.

Tubo Dilución
B 10-2
C 10-3
D 10-4
E 10-5
F 10-6

Tabla 1. Tubos y diluciones.

Las algas son organismos fotosintetizadores que viven en una variedad de ambientes. Suelo vivienda algas puede cultivarse en el laboratorio y su concentración enumerados mediante cálculos sencillos.

Las algas son un grupo muy heterogéneo de organismos que tienen un rasgo común, es decir, la posesión de pigmentos fotosintéticos, clorofila comúnmente. La gran mayoría de las algas es microscópica, sin embargo, la definición exacta del grupo es controvertida y también incluye algas marinas, que son típicamente macroscópicos.

En el entorno de las algas pueden causar problemas en las aguas superficiales como lagos o embalses, formando floraciones algales que agotan los nutrientes del agua, bloqueando la luz pasando más allá de la superficie del agua y liberación de toxinas. La capacidad de enumerar las algas en muestras permite a los científicos evaluar la salud de un ecosistema y el potencial riesgo de crecimiento excesivo de algas.

Las poblaciones de algas en los suelos ocurren con frecuencia en unos 10 mil células por gramo. Estos números son generalmente inferiores a las correspondientes concentraciones de bacterias, hongos o actinomicetos, como las algas necesitan luz solar para la fotosíntesis, que no pueden penetrar por debajo de la superficie del suelo.

Este video ilustra cómo algas del suelo en el laboratorio de la cultura y cómo la concentración de algas en la muestra de suelo a partir de enumerar.

Las algas tienen efectos beneficiosos sobre los ecosistemas. Algas verde-azules o cianobacterias, tienen la capacidad de fijar nitrógeno de la atmósfera, haciéndolos útiles en el aumento de nitrógeno del suelo en ambientes semiáridos y también como una herramienta potencial para la producción de biocombustibles.

Otras algas son eucariotas y van desde unicelulares hasta organismos multicelulares complejos, como algas. Estos incluyen algas, euglenoides, dinoflagelados y diatomeas, algas pardas y algas rojas.

Las algas son fototróficas, obtención de energía de la fotosíntesis y el carbono de la biomasa a partir de dióxido de carbono. Como resultado, se puede cultivar en medios constituidos totalmente de nutrientes inorgánicos, sin un sustrato de carbono orgánico añadido. Esta falta de sustrato orgánico evita el crecimiento de bacterias heterotróficas, que dependen del exterior carbono orgánico para el crecimiento.

A las algas de la cultura para la enumeración, suelo en serie se diluyen las muestras diez veces a 10-6 g suelo / mL, cultivadas en medios de crecimiento. Se hacen varias repeticiones para cada dilución. Luego se incuban en un área bien iluminada durante 4 semanas permitir el crecimiento de las algas.

La presencia de algas en cualquier dilución es determinada por un signo positivo de crecimiento en el medio, que normalmente aparecerá como una baba verde. Por último, se consultan las tablas MPN empíricamente desarrolladas diseñadas para el crecimiento de las algas, lo que permite al usuario determinar la concentración de algas original basada en el crecimiento en dilución repeticiones. El método MPN se basa en la dilución seriada de muestras tal que las algas se diluyen a la extinción, lo que significa que a cierta dilución, no crecimiento de las algas sobreviene.

Ahora que estamos familiarizados con los conceptos de crecimiento y enumeración de las algas de las muestras, vamos a echar un vistazo a cómo esto se lleva a cabo en el laboratorio.

Para empezar el experimento, primero peso 10 g de suelo húmedo o bien han recogido húmedos del campo, o rehidratado y permanecía húmedo durante 2 a 3 días. El suelo debe pero no saturados.

A continuación, preparar una serie de dilución multiplicado agregando 10 gramos de suelo a 95 mL de solución de Bristol modificado, o MBS. Esta etiqueta como suspensión A.

Después de agitar vigorosamente, seguir con la serie de dilución mediante la adición de 1 mL de la suspensión A 9 mL de MBS en un tubo de ensayo. Seguir esta serie de diluciones multiplicado otra 4 veces dando diluciones hasta 10-6 g / mL.

A continuación, inocular 5 tubos replicados, cada que contiene 9 mL de MBS con 1 mL de cada una de las diluciones 10-1 a 10-5. Esto resulta en 5 tubos de repeticiones para cada dilución de 10-2 a 10-6. Tapa los tubos libremente.

Por último, incubar los tubos por un completo 4 semanas en un área expuesta a la luz solar. Observar los tubos para el crecimiento de las algas una vez cada 7 días. Tubos de exponer el crecimiento de las algas aparecerá verdes.

Análisis número Probable o MPN, la mayoría es un método matemático utilizado para enumerar microorganismos cultivados de dilución de un sustrato inicial concentrado. Teniendo en cuenta los factores de dilución de las soluciones y el número de tubos que muestran signos positivos de crecimiento en cada dilución, el número más probable de organismos por gramo de muestra de suelo original puede calcularse mediante una fórmula simple y tabla MPN.

Para calcular el MPN, la dilución más alta con el mayor número de tubos positivos de la replicación se asigna la etiqueta de p1, en este caso, las repeticiones del tubo C. En contraste, algunos de los tubos de D & E son negativos sin signos de crecimiento de las algas.

El número de tubos en las dos diluciones mayores que muestran un crecimiento positivo se etiqueta como p2 y p3. Aquí, p2 = D y p3 = E.

El valor de p1 puede encontrarse mirando hacia abajo de la primera columna de la tabla de la MPN. El mismo debe realizarse con la columna p2 . Finalmente, el valor de p3, en la parte superior, se utiliza para intersectar dos definido por p1 y p2, para dar un valor del número más probable de organismos por mL.

A continuación, para calcular la concentración de organismos por gramo de la muestra original de suelo, este valor es dividido por la concentración del suelo en la dilución a la que fue asignada p2 . La siguiente ecuación se utiliza para definir el número de organismos por gramo de suelo.

MPN análisis y enumeración de algas tienen una amplia gama de aplicaciones, algunas de las cuales son exploradas aquí.

Este método de cultivo de algas enumeración puede utilizarse en una variedad de ajustes. Se puede aplicar a ríos o lagos para determinar niveles de algas y evaluar los riesgos de las floraciones de algas nocivas. Alternativamente, puede utilizarse para evaluar la limpieza y la seguridad de las aguas más directamente utilizados por los seres humanos, incluyendo piscinas, fuentes de agua u otras fuentes de agua potable. Idealmente, en muestras de agua potable y piscinas, no hay algas presentes.

El análisis de la MPN para enumeración puede aplicarse también a otros microorganismos no algas. Por ejemplo, calidad del agua puede ser evaluada utilizando organismos indicadores tales como coliformes o e. coli. Aquí, las muestras pueden cultivarse con medios que contienen productos químicos que se encuentran alterados para producir color o fluorescencia en presencia de los organismos indicadores. Mediante la realización de múltiples pequeñas réplicas de este experimento en celdas individuales, con las muestras diluidas a una concentración conocida, la proporción de células positivas puede hacer referencia a una tabla MPN para el organismo indicador específico y la concentración inicial en las muestras determinada.

También se pueden cultivar algas para aplicaciones comerciales. Por ejemplo, algunos tipos de biofertilizantes utilizan las algas verdiazul, que puede actuar como simbiontes con plantas, ayudando a su accesorio y asimilación de nitrógeno, que es particularmente útil en ayudar al crecimiento del cultivo en áreas con suelos pobres. Del mismo modo, se pueden cultivar algas para biocombustibles, o como una fuente de nutrientes rico alimento para el ganado.

Sólo ha visto introducción de Zeus cultura algas y enumeración. Ahora debería entender cómo diluir las muestras de suelo para el crecimiento de las algas, cómo cultivar las algas en el laboratorio y cómo la concentración de algas de sus muestras a partir de enumerar. ¡Gracias por ver!

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Results

Figura 2 es un ejemplo de resultados representativos.

p 1 es elegido para ser el número de réplicas tubos de la dilución más alta (menos concentrada en el suelo) que tiene el mayor número de tubos positivos. Aquí, las repeticiones del tubo B no cuentan, porque esos de tubo C son de una dilución mayor. En contraste, el número de tubos de tubo que mostrar un signo positivo de crecimiento es menor que los del tubo C. Así, p1 = 5.

p 2 y p3 son elegidos para ser el número de tubos en las dos diluciones mayores que muestran un signo positivo de crecimiento. Por lo tanto, p2 = 3 y p3 = 1.

El valor de p1 se puede encontrar mirando la primera columna en la tabla 2. La misma se realiza en la columna de2 p. Entonces, el valor de p3 (en la parte superior) se cruza con los dos definidos por los valores de p1 y p2. En este ejemplo, el valor es 1,1 organismos por mL.

Dividir este valor por la concentración del suelo en la dilución a la que asigna p2. En este ejemplo, se trata de tubo D.

Equation 1

Así, en este ejemplo, había 1.1 x 104 células de algas por g de suelo. Este valor es bastante típico del número de algas que se encuentran en el suelo.

Figure 2
Figura 2. Resultado hipotético de un experimento de la enumeración de las algas. Tubos sombreados indican la presencia de algas. Tubos no sombreados representan la ausencia de algas.

Número más probable para los valores indicados de p3
P1 P2 0 1 2 3 4 5
0
0
0
0
0
0
0
1
2
3
4
5
--
0.018
0,037
0.056
0.075
0,094
0.018
0,036
0.055
0.074
0,094
0.11
0,036
0.055
0.074
0.093
0.11
0.13
0.054
0.073
0.092
0.11
0.13
0.15
0.072
0.091
0.11
0.13
0.15
0.17
0.090
0.11
0.13
0.15
0.17
0.19
1
1
1
1
1
1
0
1
2
3
4
5
0.020
0.040
0.061
0.083
0.11
0.13
0.040
0.061
0,082
0.1
0.13
0.16
0.060
0.081
0.10
0.13
0.15
0.17
0,080
0.10
0.12
0.15
0.17
0.19
0.10
0.12
0.15
0.17
0.19
0.22
0.12
0.14
0.17
0.19
0.22
0.24
2
2
2
2
2
2
0
1
2
3
4
5
0.045
0.068
0.093
0.12
0.15
0.17
0.068
0.092
0.12
0.14
0.17
0.20
0.091
0.12
0.14
0.17
0.20
0.23
0.12
0.14
0.17
0.20
0.23
0.26
0.14
0.17
0.19
0.22
0.25
0.29
0.16
0.19
0.22
0.25
0.28
0.32
3
3
3
3
3
3
0
1
2
3
4
5
0.078
0.11
0.14
0.17
0.21
0.25
0.11
0.14
0.17
0.21
0.24
0.29
0.13
0.17
0.20
0.24
0.28
0.32
0.16
0.20
0.24
0.28
0.32
0.37
0.20
0.23
0.27
0.31
0.36
0,41
0.23
0.27
0.31
0.35
0.40
0.45
4
4
4
4
4
4
0
1
2
3
4
5
0.13
0.17
0.22

0.34
0,41
0.17
0.21
0.26
0.33
0.40
0.48
0.21
0.26
0.32
0.39
0.47
0,56
0.25
0.31
0.38
0.45
0.54
0,64
0.30
0.36
0.44
0,52
0.62
0,72
0.36
0.42
0.5
0,59
0.69
0.81
5
5
5
5
5
5
0
1
2
3
4
5
0.23
0.33
0.49
0,79
1.3
2.4
0.31
0,46
0,7
1.1
1.7
3.5
0.43
0,64
0.95
1.4
2.2
5.4
0.58
0.84
1.2
1.8
2.8
9.2
0,76
1.1
1.5
2.1
3.5
16
0.95
1.3
1.8
2.5
4.3
--

Tabla 2. Número más probable para el uso con el diseño experimental en este ejercicio.

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Applications and Summary

La metodología MPN es útil, porque permite estimar una población funcional basada en un proceso de atribución. En el ejemplo, el proceso funcional fue la fotosíntesis realizada por algas, que permitió para el crecimiento en ausencia de carbono orgánico. Esto permitió total poblaciones de algas en el suelo a enumerar.

MPN se utiliza también para estimar el número de un determinado tipo de patógenos microbianos en el agua, tales como Salmonella, utilizando la resistencia de Salmonella a verde de Malaquita.

Otro uso es la estimación de los hongos micorrízicos inocular las diluciones de suelo en una planta huésped y mirando para la colonización de raíz por los hongos.

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