Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)

Analytical Chemistry

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Overview

Quelle: Dr. Paul Bower - Purdue Universität

Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) ist eine wichtige analytische Methode häufig verwendet, um zu trennen und Komponenten von flüssigen Proben zu quantifizieren. Bei dieser Technik wird eine Lösung (erste Phase) durch eine Spalte gepumpt, die eine Verpackung von kleinen porösen Partikeln mit einer zweiten Phase gebunden an die Oberfläche enthält. Die verschiedenen Solubilities der Probe Komponenten in den beiden Phasen dazu führen, dass die Komponenten durch die Säule mit unterschiedlichen durchschnittlichen Geschwindigkeiten, wodurch eine Trennung dieser Komponenten verschieben. Die gepumpte Lösung heißt der mobilen Phase, während die Phase in der Spalte der stationären Phase genannt wird.

Es gibt verschiedene Modi der Flüssigchromatographie, je nach Art der stationären oder mobilen Phase eingesetzt. Dieses Experiment verwendet umgekehrt-Phase Chromatographie, wo die stationäre Phase unpolar, und die mobile Phase ist polar. Die stationäre Phase eingesetzt werden ist C18 Kohlenwasserstoff-Gruppen auf 3 µm Silica-Partikel gebunden, während die mobile Phase eine wässrige Puffer mit polaren organischen Modifier (Acetonitril ist) hinzugefügt, um seine Medikamentenfreisetzende Stärke variieren. In dieser Form kann die Kieselsäure für Proben verwendet werden, die wasserlöslich ist, bietet ein breites Anwendungsspektrum. In diesem Experiment werden die Mischungen der drei Komponenten häufig in Diät Softdrinks (nämlich Koffein Natriumbenzoat und Aspartam) getrennt. Sieben vorbereitete Lösungen mit bekannten Beträge der drei Arten dienen, und ihre Chromatogramme werden dann aufgezeichnet.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Grundlagen der analytischen Chemie. Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC). JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Principles

Während ein HPLC-Experiment nimmt eine Hochdruckpumpe die mobile Phase aus einem Reservoir durch einen Injektor. Er reist dann durch eine Reverse-Phase C18-verpackten Spalte für Trennung der Komponenten. Schließlich zieht die mobile Phase in eine Detektorzelle, wo die Extinktion bei 220 nm und endet in einer Abfallflasche gemessen wird. Die Höhe der Zeitaufwand für eine Komponente vom Injektor Hafen zum Detektor zu reisen ist die Retentionszeit genannt.

Ein liquid Chromatograph ist in diesem Experiment verwendet wo erfolgt die Trennung auf einer Reverse-Phase-Spalte. Die Spalte Abmessungen sind 3 mm (Innendurchmesser) x 100 mm und die Kieselsäure (3 µm Partikelgröße) Verpackung mit C18 Octadecylsilane (ODS) funktionalisiert wird. Eine Rheodyne 6-Port rotary Einspritzventil wird verwendet, um zunächst die Probe in einer kleinen Schleife speichern und führt die Probe in der mobilen Phase beim Drehen des Ventils.

Erkennung ist durch Absorption Spektroskopie bei einer Wellenlänge von 220 nm. Dieses Experiment ausgeführt werden kann, bei 254 nm, wenn ein Melder nicht variabel ist. Daten vom Melder hat einen analogen Spannungsausgang, gemessen mit einem digitalen Multimeter (DMM), und lesen Sie von einem Computer mit einer Daten-Übernahme-Programm geladen. Die daraus resultierende Chromatogramm hat eine Spitze für jede Komponente in der Probe. Für dieses Experiment eluieren aller drei Komponenten innerhalb von 5 Minuten.

Dieses Experiment verwendet eine einzelne mobile Phase und Pumpe, die eine isokratische mobile Phase genannt wird. Für Proben, die schwer zu trennen sind, kann eine Farbverlauf mobile Phase verwendet werden. Dies ist bei die erste mobilen Phase in erster Linie eine wässrige ist und im Laufe der Zeit eine zweite organische mobile Phase allmählich die insgesamt mobile Phase hinzugefügt. Diese Methode löst die Polarität dieser Phase im Laufe der Zeit die senkt der Retentionszeiten der Komponenten und funktioniert ähnlich wie ein Temperaturgradient auf einen Gaschromatographen. Es gibt einige Fälle, wo die Spalte (in der Regel auf 40 ° C) erhitzt wird, die nimmt Aufbewahrung Zeitfehler im Zusammenhang mit einer Änderung der Umgebungstemperatur.

Im Reverse-Phase-HPLC ist die Spalte stationäre Phase Verpackung in der Regel eine C4, C8 und C18 Verpackung. Die C4-Spalten sind in erster Linie für Proteine mit großen Molekulargewichten C18 Spalten für Peptide und einfache Beispiele mit niedrigeren Molmassen sind.

Erkennung durch Absorption Spektroskopie ist mit überwältigender Mehrheit die Methode der Wahl, da die Absorptionsspektren der Komponenten alle leicht zugänglich sind. Einige Systeme verwenden elektrochemische Messungen, wie Leitfähigkeit oder strommesstechnik, als ihre Nachweismethode.

Für dieses Experiment die mobile Phase ist in erster Linie 20 % Acetonitril und 80 % gereinigte deionisiertes Wasser (DI). Eine kleine Menge an Essigsäure wird hinzugefügt, um den pH-Wert der mobilen Phase zu senken, hält die Silanol in der stationären Nachdruckphase in einem undissoziierten Zustand. Dies reduziert die Adsorption Spitze von Tailing, schmalere Spitzen geben. Dann ist der pH-Wert eingestellt, mit 40 % Natriumhydroxid, den pH-Wert zu erhöhen und verringern die Retentionszeiten der Komponenten.

Jede Gruppe nutzt eine Reihe von den 7 Ampullen mit verschiedenen Konzentrationen von Standardlösungen (Tabelle 1). Die ersten 3 werden verwendet, um jede Spitze zu identifizieren, und die letzten 4 sind zur Grafikerstellung Kalibrierung für jede Komponente. Maßstäbe 1 – 3 sind auch für die Kalibrierung-Diagramm verwendet.

Anzahl Koffein (mL) Benzoat (mL) Aspartam (mL)
1 4 0 0
2 0 4 0
3 0 0 4
4 1 1 1
5 2 2 2
6 3 3 3
7 5 5 5

Tabelle 1. Mengen an Lager Standards verwendet, um die 7 bereitgestellten Arbeitsstandards vorbereiten (Gesamtvolumen von jedem Standard ist 50 mL).

Procedure

<>

(1) macht der mobilen Phase

  1. Bereiten Sie die mobile Phase von ca. 1,5 L Trinkwasser DI 400 mL Acetonitril hinzufügen.
  2. 2,4 mL Eisessig sorgfältig diese Projektmappe hinzufügen.
  3. Verdünnen Sie die Lösung für ein Gesamtvolumen von 2,0 L in einem volumetrischen Kolben mit gereinigtem DI Wasser. Die resultierende Lösung sollte einen pH-Wert zwischen 2,8 bis 3.2 aufweisen.
  4. Stellen Sie den pH-Wert auf 4.2 durch Zugabe von 40 % Natronlauge tropfenweise mit dem Einsatz von einem kalibrierten digital pH-Meter. Fügen Sie sehr langsam, sobald der pH-Wert 4.0 erreicht. Dies dauert rund 50 Tropfen zu erreichen.
  5. Filtern Sie die mobile Phase durch ein 0,47-µm-Nylon 66-Membranfilter unter Vakuum um die Lösung zu entgasen und Feststoffe zu entfernen, die die chromatographische Säule stecken könnte. Es ist wichtig zu entgasen die mobile Phase zu vermeiden, dass eine Blase, die entweder eine Lücke in der stationären Phase am Einlass der Spalte verursachen oder Arbeit ihren Weg in der Detektorzelle verursacht Instabilität mit der UV-Absorption.

2. erstellen die Komponentenlösungen

Die drei Komponenten, die getroffen werden müssen sind Koffein (0,8 mg/mL), Kalium-Benzoat (1,4 mg/mL) und Aspartam (L-Aspartyl-L-Phenylalanin Methylester) (6,0 mg/mL). Diese Konzentrationen verdünnt einmal in der gleichen Weise setzen die Standards auf den Ebenen in den Soda-Proben gefunden.

  1. Eine volumetrische 500-mL-Flasche 0,40 g Koffein hinzufügen, dann auf die 500-mL-Markierung mit VE-Wasser zu verdünnen.
  2. Eine volumetrische 500-mL-Flasche 0,70 g Natriumbenzoat hinzufügen, dann auf die 500-mL-Markierung mit VE-Wasser zu verdünnen.
  3. Eine volumetrische 100 mL-Flasche 0,60 g von Aspartam hinzufügen, dann auf den 100-mL-Markierung mit VE-Wasser zu verdünnen. Legen Sie diese Lösung in einem Kühlschrank, Zersetzung während der Lagerung zu vermeiden.

3. machen die 7 Standard-Lösungen

Alle drei Komponenten haben unterschiedliche Verteilung Koeffizienten, die beeinflusst, wie jeder mit den beiden Phasen interagiert. Je größer der Verteilung Koeffizient, desto mehr Zeit verbringt die Komponente in der stationären Phase, was zu längerer Verweildauer in den Detektor erreichen Zeiten.

  1. Nach der Tabelle in Tabelle 1, pipettieren die korrekte Menge der einzelnen Komponenten in eine volumetrische 50-mL-Flasche.
  2. Verdünnen Sie die Stammlösungen, die 50-mL-Markierung auf die volumetrische Fläschchen mit mobilen Phase.
  3. Gießen Sie jede standard-Lösung in beschrifteten kleinen Fläschchen in einem Probenrack.
  4. Die Regale von Proben im Kühlschrank, zusammen mit den restlichen Lösungen in die volumetrische 50-mL-Fläschchen aufbewahren.

4. überprüfen die Grundeinstellungen der HPLC-Anlage

  1. Bestätigen Sie, dass die Abwasserlinie in einem Abfallbehälter und ist nicht wieder in der mobilen Phase recycling.
  2. Stellen Sie sicher, dass die Durchflussmenge der mobilen Phase auf 0,5 mL/min eingestellt ist. Dies ist hoch genug, um ermöglichen allen Gipfeln eluieren innerhalb von 5 min und langsam genug, um schöne Auflösung zu ermöglichen.
  3. Stellen Sie sicher, dass die minimalen und maximalen Druck und die Durchflussmenge auf die korrekten Werte auf der Vorderseite der Lösungsmittel Delivery Systems (die Pumpe) festgelegt sind.
    1. Minimale Druckeinstellung: 250 Psi (Dies ist die Pumpe abgeschaltet, wenn ein Leck auftritt).
    2. Maximale Druckeinstellung: 4.000 Psi (Dies ist zum Schutz der Pumpe vor dem brechen, wenn ein Clog bildet).
  4. Drücken Sie "Null" auf den Detektor Frontplatte um die Leerzeichen gesetzt (die leere ist die reine mobile Phase).
  5. Spülen einer 100 µL Spritze mit entionisiertem Wasser, dann mit mehreren Bänden eines Arbeitsstandards werden analysiert, und füllen die Spritze mit der Lösung. Beginnen Sie mit 3 Einkomponenten-Proben, wodurch für die Ermittlung der Höhepunkt jeder Komponente von Interesse.

5. manuell Einspritzen der Probe und Datenerhebung

  1. Injizieren Sie mit dem Injektor Griff in Ladeposition langsam 100 µL der Lösung durch das Septum Port.
  2. Überprüfen Sie, ob Datenbeschaffungsprogramm ist für die Datensammlung für 300 s, die genügend für alle 3 Gipfel Zeit, durch den Detektor eluieren.
  3. Wenn Sie bereit zum Starten der Testversion, drehen Sie den Injektor Griff in die Spritzen-Position (die Probe in der mobilen Phase injiziert) und klicken Sie auf "Test starten" auf dem Computer Datenbeschaffungsprogramm sofort. Erscheinen Sie für Standards 1-3, nur einer der drei sequenziellen Gipfel auf dem Bildschirm während des Laufs (Abbildung 1).
  4. Einmal 300 s vergangen, die Datenerhebung sendet eine Aufforderung zum Speichern der Datei. Sichern Sie die Daten unter einem passenden Dateinamen (z. B.STD #1).
  5. Beachten Sie die Zeit in Sekunden für die Peak von jeder Studie, die bei der Ermittlung dieser Komponente verwendet wird.
  6. Ziehen Sie die Spritze aus dem Septum, und wiederholen Sie den Vorgang für jede der verbleibenden Arbeitsstandards, mit der gleichen Zeit pro Chromatogramm wie aus dem ersten Lauf ermittelt.

Figure 1
Abbildung 1: Das Chromatogramm der 3 Komponenten. Von links nach rechts sind sie Koffein, Aspartam und Natriumbenzoat.

(6) die Proben der Diät Limonaden

Diet Coke, Diet Pepsi und Coke Zero sind die "unbekannten". Sie haben in offenen Behältern über Nacht get rid of die Kohlensäure ausgelassen worden wie Luftblasen nicht gut für die HPLC-Anlage sind. Dies beseitigt ausreichend keine Gase in den Proben.

  1. Ziehen Sie etwa 2 mL die Diätsoda in einer Kunststoffspritze.
  2. Legen Sie die Filterspitze auf die Spritze über Luer-Lok durch Drehen an Ort.
  3. Drücken Sie die Flüssigkeit in der Spritze durch den Filter und in ein kleines Glas-Fläschchen. Dies beseitigt unerwünschte Partikel, die potenziell die Trennsäule verstopfen könnten.
  4. Jede Probe mit einer gleichen Menge von VE-Wasser zu verdünnen, so sind sie bei 50 % Reinheit.
  5. Injizieren Sie 100 µL der Probe in die Probenschleife, und laufen Sie Studien mit den gleichen Parametern wie die Standards.

(7) Berechnungen

  1. Berechnen Sie von den Konzentrationen der Komponentenlösungen die Konzentration aller Komponenten in den Standards, basierend auf die Verdünnungen, die für die 7 Proben vorgenommen wurden.
  2. Bestimmen Sie Peakflächen auf die Chromatogramme für jeden Standard und der unbekannten Proben durch die dreieckigen Methode, die Höhe Spitzenzeiten die Breite auf ½ Höhe (Abbildung 2 entspricht). Treten Sie nach der Festlegung, welchen Gipfel entspricht jede Komponente basiert auf den Zeitaufwand für die einzelnen Komponenten zu ihren jeweiligen Höhepunkt zeigen diese Peakflächen in einem Tabellenkalkulationsprogramm auf dem Computer.
  3. Kalibrierkurven von Peak vs. Konzentration (mg/L) in den Normen für alle drei Komponenten zu erstellen.
  4. Bestimmen der kleinsten Quadrate für jede Kalibrierungskurve passen.
  5. Berechnen Sie die Konzentration der einzelnen Komponenten in der Diät-Limonaden aus der Peakflächen der HPLC-Studien für die Beispiele gezeigt. Denken Sie daran, dass die Diät-Cola, um den Faktor 2 vor dem Einspritzen in das HPLC-System verdünnt wurde.
  6. Berechnen Sie die Menge in mg/L, der einzelnen Komponenten in der Diät-Limonaden.
  7. Basierend auf den Ergebnissen, berechnen Sie die Milligramm der einzelnen Komponenten in der 12-Unze-Dose Soda gefunden. 12 Unzen = 354,9 mL zu übernehmen.

Figure 2
Abbildung 2. Ein einfaches Beispiel für einer Kurve Peakhöhe und Breite, die multipliziert werden sollen (Peakhöhe x Breite in ½ Höhe).

Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie oder HPLC, ist eine äußerst vielseitige Technik, die Komponenten einer flüssigen Mischung basierend auf unterschiedlichen Wechselwirkungen mit der stationären Phase trennt.

HPLC ist eine Anpassung der Säulenchromatographie. In Säulenchromatographie steckt eine Spalte mit Mikromaßstab Perlen die stationäre Phase genannt. Die stationäre Phase-Perlen sind mit chemischen Gruppen funktionalisiert, die eine Interaktion zwischen der Wulst und die Bestandteile einer Mischung befindet sich in der Flüssigkeit oder mobile Phase auslösen. Die Mischung fließt durch die Spalte, interagieren die Komponenten mit der stationären Phase anders.

In HPLC, Säulenchromatographie erfolgt auf einer höheren Durchfluss, und daher höheren Druck als klassische Säulenchromatographie. Dies ermöglicht den Einsatz von kleineren stationären Phase Perlen mit einer größeren Fläche Volumen-Verhältnis, das die Interaktion der stationären Phase und Komponenten in der mobilen Phase erhöht.

Dieses Video werden die Grundlagen des Betriebs der HPLC vorstellen, durch den Nachweis der getrennten Bestandteile der verschiedenen Diät-Limonaden.

Es gibt zwei Arten von HPLC verwendet im Labor: analytische und präparative. In analytischen HPLC das Gerät dient zum identifizieren Komponenten eines kleinen Volumens und die analysierten Probe ist dann als Abfall weggeworfen. Bei präparativen HPLC dient das Instrument reinigen eine Mischung und eine gewünschte Menge der einzelnen Komponenten erfolgt in Sekundenbruchteilen.

Die HPLC-Instrumentierung besteht aus einer Reihe von einfachen Komponenten. Erstens ist die mobile Phase, gehalten in Lösungsmittel Stauseen, durch eine oder mehrere Pumpen bei konstantem Volumenstrom durch das System gepumpt. Die Probe wird in der mobilen Phase Strom durch die Probe-Injektor eingespritzt. Die Probe durch die mobile Phase verdünnt wird dann für die HPLC-Säule geliefert wo die Komponenten der Probe getrennt werden. Die Komponenten werden dann durch den Detektor und entweder in Sekundenbruchteilen zur späteren Verwendung gespeichert oder übertragen einer Abfallflasche analysiert.

Die HPLC-Säule ist die zentrale Komponente des Systems. Es besteht aus einem Metall- oder Zylinder, vollgepackt mit Mikromaßstab Perlen der stationären Phase oder Chromatographie Harz. Das Probe-Gemisch fließt durch das gepackte Partikel Bett bei konstantem Volumenstrom und jede Komponente interagiert mit der stationären Phase, wie es durch fließt.

Die Verbindungen zu interagieren mit der stationären Phase anders, und daher Reisen über die gesamte Länge der Spalte mit dem Detektor mit einer anderen Geschwindigkeit. Der Zeitaufwand für eine Komponente, um die Spalte zu beenden, oder eluieren, wird die Retentionszeit genannt. Das Ergebnis ist eine Handlung der Retentionszeit vs. Intensität oder ein Chromatogramm. Die Retentionszeit wird verwendet, um die Komponente zu identifizieren. Die Maximalgröße, speziell der Bereich unter dem Gipfel wird verwendet, um die Menge der Verbindung in der Ausgangslösung zu quantifizieren.

Die Wahl der stationären Phase hängt von den Eigenschaften der Komponenten in der Probe-Mischung. Die am häufigsten verwendete stationäre Phase ist Kieselsäure Perlen, wie sie einem unpolaren Inertmaterial, Mikromaßstab Perlen bildet, und ausreichend Packungsdichte erreicht. Die häufigste Art der HPLC ist umgekehrt-Phase Chromatographie, die eine hydrophobe stationäre Phase, in der Regel Silica Beads mit C18-Ketten gebunden an die Perlen Oberfläche nutzt. Die Komponenten sind in der Reihenfolge abnehmender Polarität eluiert.

Die mobile Phase in umgekehrt-Phase Chromatographie verwendet wird in der Regel eine Mischung aus Wasser und einem organischen Lösungsmittel, wie z. B. Acetonitril. Abhängig von der Probe kann die mobile Phase ein konstantes Verhältnis von Wasser und organischen Lösungsmitteln, bleiben als isokratischen Modus bekannt. Allerdings kann dies zu breiten Gipfel, bei hohem Wassergehalt oder überlappende Peaks – bei hohen organischen Inhalt.

Der mobilen Phasenverhältnis kann auch während der Trennung, erstelle ich einen mobilen Phase Farbverlauf linear oder schrittweise geändert werden. Ein gradient Elution kann verhindern, dass Peak Verbreiterung der weniger polaren Komponenten, wodurch die Trennung und Verkürzung der Elution.

Nun, da die Grundlagen der HPLC skizziert haben, wird die HPLC-Technik im Labor nachgewiesen werden. In diesem Experiment wird HPLC verwendet werden, zu trennen und drei gemeinsame Komponenten der Diät-Cola zu quantifizieren.

Fügen Sie zunächst um die mobile Phase vorzubereiten, 400 mL Acetonitril bis 1,5 L des gereinigten deionisiertes Wasser. Dann sorgfältig 2,4 mL Eisessig hinzugeben. Verdünnen Sie die Lösung auf ein Gesamtvolumen von 2 L. Die resultierende Lösung sollte einen pH-Wert zwischen 2,8 und 3,2 aufweisen.

Stellen Sie den pH-Wert auf 4.2 durch Zugabe von 40 % NaOH tropfenweise auf die bewegende Lösung mit dem Einsatz von einem kalibrierten pH-Meter.

Filtern Sie die mobile Phase durch ein 0,47-μm-Membranfilter unter Vakuum zu entgasen der Lösung und Entfernen von Feststoffen, die die Spalte stecken könnte. Es ist wichtig, die Lösung zu entgasen, wie Luftblasen können dazu führen, Hohlräume in der stationären Phase dass oder ihre zu der Detektorzelle Weise und Instabilität in Messungen verursachen.

Bereiten Sie drei Komponentenlösungen Koffein Natriumbenzoat und Aspartam, die drei typischen Komponenten der Diät Limonaden sind. Diese Komponentenlösungen dienen dann die Standardlösungen vorzubereiten, die verwendet wird, um die unbekannte zu bestimmen. 500 mL Koffein und Benzoat Lösungen vorzubereiten.

100 mL Aspartam-Komponentenlösung vorzubereiten. Lagern Sie die Lösung im Kühlschrank bei Nichtgebrauch Zersetzung zu vermeiden.

Als nächstes bereiten Sie 7 standard-Lösungen, jeweils mit verschiedenen Konzentrationen von Koffein, Benzoat und Aspartam. Pipettieren die richtige Menge an jede Komponente in einem volumetrischen Kolben und verdünnte bis zur 50-mL-Markierung mit mobilen Phase.

Die ersten 3 Lösungen enthalten eine Komponente, um Gipfel Identifikation zu ermöglichen. Die anderen 4 Lösungen enthalten eine Reihe von Konzentrationen aller 3 Komponenten, um Peakhöhe Konzentration korrelieren.

Gießen Sie jede standard-Lösung in einem beschrifteten Fläschchen in einem Probenrack. Lagern Sie die Probenrack mit Proben und den restlichen Lösungen im Kühlschrank.

Zuerst richten Sie die mobile Phase und Abfallbehälter. Sicherstellen Sie, dass die Abfälle Linien in einen Abfallcontainer fließen und sind nicht wieder in der mobilen Phase recycling. Sicherstellen Sie, dass der Saugleitung der mobilen Phase in der mobilen Phase Behälter eingespeist wird.

Stellen Sie sicher, dass die Durchflussmenge der mobilen Phase auf 0,5 mL/min eingestellt ist. Dieser Volumenstrom ermöglicht es alle Komponenten, um innerhalb von 5 min eluieren, aber ist langsam genug, um die Auflösung der einzelnen Peaks zu gewährleisten.

Überprüfen Sie anschließend, den minimalen und maximalen Druck auf Lösungsmittel Liefersystem. Diese Einstellungen abschalten die Pumpe im Falle einer Leckage oder verstopfen, beziehungsweise.

Drücken Sie "Null" auf der Frontplatte Detektoren, die Leerzeichen gesetzt. Spülen einer 100 μl Spritze mit entionisiertem Wasser, dann mit mehreren Bänden 1 der 7 Arbeitsstandards. Dann füllen Sie die Spritze mit dieser Lösung. Beginnen Sie mit den 3 Einkomponenten-Proben um die Spitze der einzelnen Komponenten zu identifizieren.

Anschließend manuell die Lösung zu injizieren, indem man den Injektor Griff in die Ladeposition. Injizieren Sie langsam die 100 μl der Lösung durch das Septum Port.

Überprüfen Sie, ob Datenbeschaffungsprogramm ist für die Datensammlung für 300 s, die genügend Zeit für alle 3 Gipfel, durch den Detektor eluieren ermöglicht. Wenn Sie bereit sind, den Test zu starten, drehen Sie den Injektor Griff in die Spritzen-Position, um die Probe in der mobilen Phase zu injizieren. Klicken Sie an "Prüfung starten" sofort Datenbeschaffungsprogramm. Wenn der Scan abgeschlossen ist, wiederholen Sie den Vorgang für jede der 7 standard-Lösungen. Für jede der ersten 3 Standards wird nur eines der 3 Gipfel. Notieren Sie den Speicherort des Peaks, die verwendet wird, um die Komponente zu identifizieren.

Wählen Sie 3 Diät Soda Proben und lassen sie in offenen Behältern über Nacht um die Kohlensäure zu entfernen, draußen zu sitzen.

Ziehen Sie nach Übernachtung Entgasung ca. 3 mL jede Diät-Cola in einer Kunststoffspritze. Als nächstes die Spritze beimessen Sie eine Filterspitze, und drücken Sie die Soda durch den Filter in eine Glasflasche um festen Partikel zu entfernen.

Verdünnen Sie 2 mL jeder Probe mit 2 mL der mobilen Phase, die Soda-Konzentration um die Hälfte zu verringern.

100 μl eines Soda-Proben in eine Spritze zu ziehen und in die Probenschleife injizieren. Führen Sie die Testversion mit identischen Parametern zu den Standardlösungen. Wiederholen Sie für jede Probe Soda.

Erstens korrelieren Sie die Peakflächen der standard Proben mit den bekannten Konzentrationen. Hierzu bestimmen Sie die Peakflächen auf den Chromatographen für jede standard Probe mit der dreieckigen Methode. Berechnen Sie die Peak-Höhe-Zeiten mit der Breite bei der Hälfte der Höhe zu, und verwenden Sie diesen Wert als die Peakfläche.

Mithilfe der Peakflächen und bekannte Konzentrationen erstellen Sie eine Kalibrierkurve für jede Komponente zu und bestimmen Sie der kleinsten Quadrate für jede Kalibrierungskurve passen.

Berechnen Sie die Konzentration der einzelnen Komponenten in der Diät-Limonaden aus der Peakflächen. Beachten Sie, dass die Limonaden waren alle um den Faktor 2 vor der Injektion in der HPLC verdünnt. Basierend auf diesen Ergebnissen, berechnen Sie die mg jede Komponente in der 12-Unze-Dose Soda.

Es überrascht nicht, enthalten alle 3 Limonaden getestet etwa die gleiche Menge an das Konservierungsmittel Natriumbenzoat. Jedoch enthalten die Cola-Produkte mehr Koffein. Die berechneten Werte für alle Komponenten korreliert gut mit Werten von den Herstellern.

HPLC ist ein sehr vielseitiges Instrument, das in eine Vielzahl von Analysen verwendet wird.

HPLC wird häufig verwendet, um Peptid Moleküle zu reinigen. In diesem Beispiel transmembranen Peptid-komplexe vorbereitet wurden, und dann stabilisiert durch oxidative Vernetzung der Proteine mit Disulfid-Bindungen.

Die Proteine wurden dann in Ameisensäure aufgelöst, und gereinigten mit Phase HPLC storniert. Die Probe wurde dann eluiert mit einem linearen Farbverlauf der beiden Lösungsmittel, und die Reinheit mit Massenspektrometrie bestätigt.

HPLC kann auch verwendet werden, um organische Verbindungen synthetisiert im Labor zu identifizieren. In der Miller-Urey-Experiment wurde die abiotische Synthese von organischen Verbindungen auf der ursprünglichen Erde untersucht. Primordial Gase wie Methan und Ammoniak, wurden in ein Fläschchen mit Wasser, Simulation der frühen Ozeane eingeführt. Elektrischer Entladung wurde dann angewendet, Blitz auf der Ur-Erde zu imitieren.

Das Wasser wurde dann analysiert mittels HPLC mit der Massenspektrometrie gekoppelt, und im Vergleich zu bekannten Aminosäure-Standards. 23 Aminosäuren wurden synthetisiert und in diesem Experiment identifiziert.

Sie habe nur Jupiters Einführung in HPLC beobachtet. Sie sollten nun die Grundlagen der läuft des Geräts, und die Analyse der resultierenden Daten verstehen.

Danke fürs Zuschauen!

Results

Die HPLC-Chromatogramme sind in der Lage, jede der 3 Komponenten für alle Proben, die basierend auf die Kalibrierkurven der Standards (Abbildung 3) zu quantifizieren.

Ab dieser Serie von Experimenten wurde festgestellt, dass eine 12-oz Dose diese Diät-Limonaden die folgenden Beträge der einzelnen Komponenten enthalten:

Diät-Cola: 50,5 mg Koffein; 217,6 mg Aspartam; 83,6 mg Natriumbenzoat.
Coke Zero: 43,1 mg Koffein; 124,9 mg Aspartam; 85,3 mg Natriumbenzoat.
Diät-Pepsi: 34,1 mg Koffein; 184,7 mg Aspartam; 79,5 mg Natriumbenzoat.

Nicht überraschend, hatten alle 3 etwa die gleiche Menge an Natriumbenzoat, da es nur ein Konservierungsmittel ist. Die Cola-Produkte hatte ein bisschen mehr Koffein und Coke Zero hatte viel weniger Aspartam als die anderen beiden Limonaden, wie es auch Zitronensäure für einige Aromastoffe enthält.

Die folgenden Zahlen sind die tatsächlichen Mengen an Koffein und Aspartam in der 12-oz-Dose der 3 Diät-Limonaden (der Koffeingehalt aus den Webseiten von Coca-Cola und Pepsi ermittelt. Die Aspartam-Inhalte wurden LiveStrong.com und DiabetesSelfManagement.com entnommen.):

Diät-Cola: 46 mg Koffein; 187,5 mg Aspartam
Coke Zero: 34 mg Koffein; 87,0 mg Aspartam
Diät-Pepsi: 35 mg Koffein; 177,0 mg Aspartam

Beispielrechnungen (Tabelle 2):

Konzentration von Koffein in STD #1: die Komponentenlösung für Koffein hatte 0,400 g Koffein bis 500 mL = 0,500 L → 0,800 g / L = 0,800 mg / mL verdünnt.

STD #1 hatte 1 mL dieser Lösung bis 50,0 mL verdünnt
0,800 mg/mL * (1,0 mL/50,0 mL) = 0,016 mg / mL = 16,0 mg / L.

#2 STD hatte 2 mL dieser Lösung bis 50,0 mL verdünnt
0,800 mg/mL * (2,0 mL/50,0 mL) = 0,032 mg / mL = 32,0 mg / L.

Die Ergebnisse aus den drei Kalibrierung Grafiken (Abbildung 4) ergab die folgenden Gleichungen:

Koffein Peakfläche = 0.1583* [mg/L Koffein] - 0.574
Aspartam Peakfläche = 0.02696* [Aspartam mg/L] - 0.405
Benzoat Peakfläche = 0.1363* [Benzoat mg/L] - 1,192

Diät-Cola: Koffein Peakfläche = 10,68 = 0.1583* [mg/L Koffein] - 0.574

[Mg/L Koffein] = (10,68 + 0.574) / (0.1583) = 71,1 mg/L in der injizierten Probe.

Da die Probe mit einem Faktor von 2 verdünnt wurde, musste der Diet Coke 141,2 mg/L Koffein.

Der Betrag pro 12-oz = können (141,2 mg/L) (0.3549 mL/12-oz-Can) = 50,5 mg Koffein / können.

Figure 3
Abbildung 3. Die HPLC-Chromatogramme 5 Standards und die 3 Proben.

Figure 4
Abbildung 4. Die Kalibrierkurven für jede der 3 Komponenten.

Table 2
Tabelle 2. Die Tabellen für die HPLC-Studien für die Generierung der Kalibrierkurven verwendet.

Applications and Summary

HPLC ist eine weit verbreitete Technik in der Trennung und Nachweis für viele Anwendungen. Es ist ideal für nicht-flüchtige Verbindungen, wie Gaschromatographie (GC) setzt voraus, dass die Proben in ihrer Gasphase. Nicht-flüchtiger Verbindungen enthalten Zucker, Vitamine, Medikamente und Metaboliten. Außerdem ist es nicht-destruktiv, wodurch jede Komponente zur weiteren Analyse (z. B. Massenspektrometrie) gesammelt werden. Die mobilen Phasen sind praktisch unbegrenzt, wodurch Änderungen auf die richtige Polung des pH-Wertes, besseren Auflösung zu erreichen. Die Verwendung von gradient mobilen Phasen kann diese Änderungen während der eigentlichen Versuche.

Es wurde Besorgnis über die möglichen gesundheitlichen Probleme, die mit dem Süßstoff Aspartam verbunden sein können. Aktuelle Produkt-Kennzeichnung zeigt nicht die Menge dieser Komponenten im Inneren der Diät-Getränke. Diese Methode ermöglicht diese Beträge zusammen mit dem Koffein und Benzoat zu quantifizieren.

Andere Anwendungen umfassen die Bestimmung der Mengen von Pestiziden in Wasser; Bestimmung der Höhe der Paracetamol oder Ibuprofen in Schmerzen Schmerzmittel Tabletten; bestimmen, ob es leistungssteigernde Mittel in die Blutbahn des Athleten anwesend sind; oder einfach das Vorhandensein von Drogen in eine kriminaltechnische Labor bestimmen. Während die Konzentrationen dieser Proben, und oft die Identität der Komponenten, ohne weiteres ermittelt werden können, ist die eine Einschränkung, dass mehrere Proben in der Nähe von identischen Aufbewahrung Zeiten, wodurch Co eluierenden haben könnte.

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(1) macht der mobilen Phase

  1. Bereiten Sie die mobile Phase von ca. 1,5 L Trinkwasser DI 400 mL Acetonitril hinzufügen.
  2. 2,4 mL Eisessig sorgfältig diese Projektmappe hinzufügen.
  3. Verdünnen Sie die Lösung für ein Gesamtvolumen von 2,0 L in einem volumetrischen Kolben mit gereinigtem DI Wasser. Die resultierende Lösung sollte einen pH-Wert zwischen 2,8 bis 3.2 aufweisen.
  4. Stellen Sie den pH-Wert auf 4.2 durch Zugabe von 40 % Natronlauge tropfenweise mit dem Einsatz von einem kalibrierten digital pH-Meter. Fügen Sie sehr langsam, sobald der pH-Wert 4.0 erreicht. Dies dauert rund 50 Tropfen zu erreichen.
  5. Filtern Sie die mobile Phase durch ein 0,47-µm-Nylon 66-Membranfilter unter Vakuum um die Lösung zu entgasen und Feststoffe zu entfernen, die die chromatographische Säule stecken könnte. Es ist wichtig zu entgasen die mobile Phase zu vermeiden, dass eine Blase, die entweder eine Lücke in der stationären Phase am Einlass der Spalte verursachen oder Arbeit ihren Weg in der Detektorzelle verursacht Instabilität mit der UV-Absorption.

2. erstellen die Komponentenlösungen

Die drei Komponenten, die getroffen werden müssen sind Koffein (0,8 mg/mL), Kalium-Benzoat (1,4 mg/mL) und Aspartam (L-Aspartyl-L-Phenylalanin Methylester) (6,0 mg/mL). Diese Konzentrationen verdünnt einmal in der gleichen Weise setzen die Standards auf den Ebenen in den Soda-Proben gefunden.

  1. Eine volumetrische 500-mL-Flasche 0,40 g Koffein hinzufügen, dann auf die 500-mL-Markierung mit VE-Wasser zu verdünnen.
  2. Eine volumetrische 500-mL-Flasche 0,70 g Natriumbenzoat hinzufügen, dann auf die 500-mL-Markierung mit VE-Wasser zu verdünnen.
  3. Eine volumetrische 100 mL-Flasche 0,60 g von Aspartam hinzufügen, dann auf den 100-mL-Markierung mit VE-Wasser zu verdünnen. Legen Sie diese Lösung in einem Kühlschrank, Zersetzung während der Lagerung zu vermeiden.

3. machen die 7 Standard-Lösungen

Alle drei Komponenten haben unterschiedliche Verteilung Koeffizienten, die beeinflusst, wie jeder mit den beiden Phasen interagiert. Je größer der Verteilung Koeffizient, desto mehr Zeit verbringt die Komponente in der stationären Phase, was zu längerer Verweildauer in den Detektor erreichen Zeiten.

  1. Nach der Tabelle in Tabelle 1, pipettieren die korrekte Menge der einzelnen Komponenten in eine volumetrische 50-mL-Flasche.
  2. Verdünnen Sie die Stammlösungen, die 50-mL-Markierung auf die volumetrische Fläschchen mit mobilen Phase.
  3. Gießen Sie jede standard-Lösung in beschrifteten kleinen Fläschchen in einem Probenrack.
  4. Die Regale von Proben im Kühlschrank, zusammen mit den restlichen Lösungen in die volumetrische 50-mL-Fläschchen aufbewahren.

4. überprüfen die Grundeinstellungen der HPLC-Anlage

  1. Bestätigen Sie, dass die Abwasserlinie in einem Abfallbehälter und ist nicht wieder in der mobilen Phase recycling.
  2. Stellen Sie sicher, dass die Durchflussmenge der mobilen Phase auf 0,5 mL/min eingestellt ist. Dies ist hoch genug, um ermöglichen allen Gipfeln eluieren innerhalb von 5 min und langsam genug, um schöne Auflösung zu ermöglichen.
  3. Stellen Sie sicher, dass die minimalen und maximalen Druck und die Durchflussmenge auf die korrekten Werte auf der Vorderseite der Lösungsmittel Delivery Systems (die Pumpe) festgelegt sind.
    1. Minimale Druckeinstellung: 250 Psi (Dies ist die Pumpe abgeschaltet, wenn ein Leck auftritt).
    2. Maximale Druckeinstellung: 4.000 Psi (Dies ist zum Schutz der Pumpe vor dem brechen, wenn ein Clog bildet).
  4. Drücken Sie "Null" auf den Detektor Frontplatte um die Leerzeichen gesetzt (die leere ist die reine mobile Phase).
  5. Spülen einer 100 µL Spritze mit entionisiertem Wasser, dann mit mehreren Bänden eines Arbeitsstandards werden analysiert, und füllen die Spritze mit der Lösung. Beginnen Sie mit 3 Einkomponenten-Proben, wodurch für die Ermittlung der Höhepunkt jeder Komponente von Interesse.

5. manuell Einspritzen der Probe und Datenerhebung

  1. Injizieren Sie mit dem Injektor Griff in Ladeposition langsam 100 µL der Lösung durch das Septum Port.
  2. Überprüfen Sie, ob Datenbeschaffungsprogramm ist für die Datensammlung für 300 s, die genügend für alle 3 Gipfel Zeit, durch den Detektor eluieren.
  3. Wenn Sie bereit zum Starten der Testversion, drehen Sie den Injektor Griff in die Spritzen-Position (die Probe in der mobilen Phase injiziert) und klicken Sie auf "Test starten" auf dem Computer Datenbeschaffungsprogramm sofort. Erscheinen Sie für Standards 1-3, nur einer der drei sequenziellen Gipfel auf dem Bildschirm während des Laufs (Abbildung 1).
  4. Einmal 300 s vergangen, die Datenerhebung sendet eine Aufforderung zum Speichern der Datei. Sichern Sie die Daten unter einem passenden Dateinamen (z. B.STD #1).
  5. Beachten Sie die Zeit in Sekunden für die Peak von jeder Studie, die bei der Ermittlung dieser Komponente verwendet wird.
  6. Ziehen Sie die Spritze aus dem Septum, und wiederholen Sie den Vorgang für jede der verbleibenden Arbeitsstandards, mit der gleichen Zeit pro Chromatogramm wie aus dem ersten Lauf ermittelt.

Figure 1
Abbildung 1: Das Chromatogramm der 3 Komponenten. Von links nach rechts sind sie Koffein, Aspartam und Natriumbenzoat.

(6) die Proben der Diät Limonaden

Diet Coke, Diet Pepsi und Coke Zero sind die "unbekannten". Sie haben in offenen Behältern über Nacht get rid of die Kohlensäure ausgelassen worden wie Luftblasen nicht gut für die HPLC-Anlage sind. Dies beseitigt ausreichend keine Gase in den Proben.

  1. Ziehen Sie etwa 2 mL die Diätsoda in einer Kunststoffspritze.
  2. Legen Sie die Filterspitze auf die Spritze über Luer-Lok durch Drehen an Ort.
  3. Drücken Sie die Flüssigkeit in der Spritze durch den Filter und in ein kleines Glas-Fläschchen. Dies beseitigt unerwünschte Partikel, die potenziell die Trennsäule verstopfen könnten.
  4. Jede Probe mit einer gleichen Menge von VE-Wasser zu verdünnen, so sind sie bei 50 % Reinheit.
  5. Injizieren Sie 100 µL der Probe in die Probenschleife, und laufen Sie Studien mit den gleichen Parametern wie die Standards.

(7) Berechnungen

  1. Berechnen Sie von den Konzentrationen der Komponentenlösungen die Konzentration aller Komponenten in den Standards, basierend auf die Verdünnungen, die für die 7 Proben vorgenommen wurden.
  2. Bestimmen Sie Peakflächen auf die Chromatogramme für jeden Standard und der unbekannten Proben durch die dreieckigen Methode, die Höhe Spitzenzeiten die Breite auf ½ Höhe (Abbildung 2 entspricht). Treten Sie nach der Festlegung, welchen Gipfel entspricht jede Komponente basiert auf den Zeitaufwand für die einzelnen Komponenten zu ihren jeweiligen Höhepunkt zeigen diese Peakflächen in einem Tabellenkalkulationsprogramm auf dem Computer.
  3. Kalibrierkurven von Peak vs. Konzentration (mg/L) in den Normen für alle drei Komponenten zu erstellen.
  4. Bestimmen der kleinsten Quadrate für jede Kalibrierungskurve passen.
  5. Berechnen Sie die Konzentration der einzelnen Komponenten in der Diät-Limonaden aus der Peakflächen der HPLC-Studien für die Beispiele gezeigt. Denken Sie daran, dass die Diät-Cola, um den Faktor 2 vor dem Einspritzen in das HPLC-System verdünnt wurde.
  6. Berechnen Sie die Menge in mg/L, der einzelnen Komponenten in der Diät-Limonaden.
  7. Basierend auf den Ergebnissen, berechnen Sie die Milligramm der einzelnen Komponenten in der 12-Unze-Dose Soda gefunden. 12 Unzen = 354,9 mL zu übernehmen.

Figure 2
Abbildung 2. Ein einfaches Beispiel für einer Kurve Peakhöhe und Breite, die multipliziert werden sollen (Peakhöhe x Breite in ½ Höhe).

Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie oder HPLC, ist eine äußerst vielseitige Technik, die Komponenten einer flüssigen Mischung basierend auf unterschiedlichen Wechselwirkungen mit der stationären Phase trennt.

HPLC ist eine Anpassung der Säulenchromatographie. In Säulenchromatographie steckt eine Spalte mit Mikromaßstab Perlen die stationäre Phase genannt. Die stationäre Phase-Perlen sind mit chemischen Gruppen funktionalisiert, die eine Interaktion zwischen der Wulst und die Bestandteile einer Mischung befindet sich in der Flüssigkeit oder mobile Phase auslösen. Die Mischung fließt durch die Spalte, interagieren die Komponenten mit der stationären Phase anders.

In HPLC, Säulenchromatographie erfolgt auf einer höheren Durchfluss, und daher höheren Druck als klassische Säulenchromatographie. Dies ermöglicht den Einsatz von kleineren stationären Phase Perlen mit einer größeren Fläche Volumen-Verhältnis, das die Interaktion der stationären Phase und Komponenten in der mobilen Phase erhöht.

Dieses Video werden die Grundlagen des Betriebs der HPLC vorstellen, durch den Nachweis der getrennten Bestandteile der verschiedenen Diät-Limonaden.

Es gibt zwei Arten von HPLC verwendet im Labor: analytische und präparative. In analytischen HPLC das Gerät dient zum identifizieren Komponenten eines kleinen Volumens und die analysierten Probe ist dann als Abfall weggeworfen. Bei präparativen HPLC dient das Instrument reinigen eine Mischung und eine gewünschte Menge der einzelnen Komponenten erfolgt in Sekundenbruchteilen.

Die HPLC-Instrumentierung besteht aus einer Reihe von einfachen Komponenten. Erstens ist die mobile Phase, gehalten in Lösungsmittel Stauseen, durch eine oder mehrere Pumpen bei konstantem Volumenstrom durch das System gepumpt. Die Probe wird in der mobilen Phase Strom durch die Probe-Injektor eingespritzt. Die Probe durch die mobile Phase verdünnt wird dann für die HPLC-Säule geliefert wo die Komponenten der Probe getrennt werden. Die Komponenten werden dann durch den Detektor und entweder in Sekundenbruchteilen zur späteren Verwendung gespeichert oder übertragen einer Abfallflasche analysiert.

Die HPLC-Säule ist die zentrale Komponente des Systems. Es besteht aus einem Metall- oder Zylinder, vollgepackt mit Mikromaßstab Perlen der stationären Phase oder Chromatographie Harz. Das Probe-Gemisch fließt durch das gepackte Partikel Bett bei konstantem Volumenstrom und jede Komponente interagiert mit der stationären Phase, wie es durch fließt.

Die Verbindungen zu interagieren mit der stationären Phase anders, und daher Reisen über die gesamte Länge der Spalte mit dem Detektor mit einer anderen Geschwindigkeit. Der Zeitaufwand für eine Komponente, um die Spalte zu beenden, oder eluieren, wird die Retentionszeit genannt. Das Ergebnis ist eine Handlung der Retentionszeit vs. Intensität oder ein Chromatogramm. Die Retentionszeit wird verwendet, um die Komponente zu identifizieren. Die Maximalgröße, speziell der Bereich unter dem Gipfel wird verwendet, um die Menge der Verbindung in der Ausgangslösung zu quantifizieren.

Die Wahl der stationären Phase hängt von den Eigenschaften der Komponenten in der Probe-Mischung. Die am häufigsten verwendete stationäre Phase ist Kieselsäure Perlen, wie sie einem unpolaren Inertmaterial, Mikromaßstab Perlen bildet, und ausreichend Packungsdichte erreicht. Die häufigste Art der HPLC ist umgekehrt-Phase Chromatographie, die eine hydrophobe stationäre Phase, in der Regel Silica Beads mit C18-Ketten gebunden an die Perlen Oberfläche nutzt. Die Komponenten sind in der Reihenfolge abnehmender Polarität eluiert.

Die mobile Phase in umgekehrt-Phase Chromatographie verwendet wird in der Regel eine Mischung aus Wasser und einem organischen Lösungsmittel, wie z. B. Acetonitril. Abhängig von der Probe kann die mobile Phase ein konstantes Verhältnis von Wasser und organischen Lösungsmitteln, bleiben als isokratischen Modus bekannt. Allerdings kann dies zu breiten Gipfel, bei hohem Wassergehalt oder überlappende Peaks – bei hohen organischen Inhalt.

Der mobilen Phasenverhältnis kann auch während der Trennung, erstelle ich einen mobilen Phase Farbverlauf linear oder schrittweise geändert werden. Ein gradient Elution kann verhindern, dass Peak Verbreiterung der weniger polaren Komponenten, wodurch die Trennung und Verkürzung der Elution.

Nun, da die Grundlagen der HPLC skizziert haben, wird die HPLC-Technik im Labor nachgewiesen werden. In diesem Experiment wird HPLC verwendet werden, zu trennen und drei gemeinsame Komponenten der Diät-Cola zu quantifizieren.

Fügen Sie zunächst um die mobile Phase vorzubereiten, 400 mL Acetonitril bis 1,5 L des gereinigten deionisiertes Wasser. Dann sorgfältig 2,4 mL Eisessig hinzugeben. Verdünnen Sie die Lösung auf ein Gesamtvolumen von 2 L. Die resultierende Lösung sollte einen pH-Wert zwischen 2,8 und 3,2 aufweisen.

Stellen Sie den pH-Wert auf 4.2 durch Zugabe von 40 % NaOH tropfenweise auf die bewegende Lösung mit dem Einsatz von einem kalibrierten pH-Meter.

Filtern Sie die mobile Phase durch ein 0,47-μm-Membranfilter unter Vakuum zu entgasen der Lösung und Entfernen von Feststoffen, die die Spalte stecken könnte. Es ist wichtig, die Lösung zu entgasen, wie Luftblasen können dazu führen, Hohlräume in der stationären Phase dass oder ihre zu der Detektorzelle Weise und Instabilität in Messungen verursachen.

Bereiten Sie drei Komponentenlösungen Koffein Natriumbenzoat und Aspartam, die drei typischen Komponenten der Diät Limonaden sind. Diese Komponentenlösungen dienen dann die Standardlösungen vorzubereiten, die verwendet wird, um die unbekannte zu bestimmen. 500 mL Koffein und Benzoat Lösungen vorzubereiten.

100 mL Aspartam-Komponentenlösung vorzubereiten. Lagern Sie die Lösung im Kühlschrank bei Nichtgebrauch Zersetzung zu vermeiden.

Als nächstes bereiten Sie 7 standard-Lösungen, jeweils mit verschiedenen Konzentrationen von Koffein, Benzoat und Aspartam. Pipettieren die richtige Menge an jede Komponente in einem volumetrischen Kolben und verdünnte bis zur 50-mL-Markierung mit mobilen Phase.

Die ersten 3 Lösungen enthalten eine Komponente, um Gipfel Identifikation zu ermöglichen. Die anderen 4 Lösungen enthalten eine Reihe von Konzentrationen aller 3 Komponenten, um Peakhöhe Konzentration korrelieren.

Gießen Sie jede standard-Lösung in einem beschrifteten Fläschchen in einem Probenrack. Lagern Sie die Probenrack mit Proben und den restlichen Lösungen im Kühlschrank.

Zuerst richten Sie die mobile Phase und Abfallbehälter. Sicherstellen Sie, dass die Abfälle Linien in einen Abfallcontainer fließen und sind nicht wieder in der mobilen Phase recycling. Sicherstellen Sie, dass der Saugleitung der mobilen Phase in der mobilen Phase Behälter eingespeist wird.

Stellen Sie sicher, dass die Durchflussmenge der mobilen Phase auf 0,5 mL/min eingestellt ist. Dieser Volumenstrom ermöglicht es alle Komponenten, um innerhalb von 5 min eluieren, aber ist langsam genug, um die Auflösung der einzelnen Peaks zu gewährleisten.

Überprüfen Sie anschließend, den minimalen und maximalen Druck auf Lösungsmittel Liefersystem. Diese Einstellungen abschalten die Pumpe im Falle einer Leckage oder verstopfen, beziehungsweise.

Drücken Sie "Null" auf der Frontplatte Detektoren, die Leerzeichen gesetzt. Spülen einer 100 μl Spritze mit entionisiertem Wasser, dann mit mehreren Bänden 1 der 7 Arbeitsstandards. Dann füllen Sie die Spritze mit dieser Lösung. Beginnen Sie mit den 3 Einkomponenten-Proben um die Spitze der einzelnen Komponenten zu identifizieren.

Anschließend manuell die Lösung zu injizieren, indem man den Injektor Griff in die Ladeposition. Injizieren Sie langsam die 100 μl der Lösung durch das Septum Port.

Überprüfen Sie, ob Datenbeschaffungsprogramm ist für die Datensammlung für 300 s, die genügend Zeit für alle 3 Gipfel, durch den Detektor eluieren ermöglicht. Wenn Sie bereit sind, den Test zu starten, drehen Sie den Injektor Griff in die Spritzen-Position, um die Probe in der mobilen Phase zu injizieren. Klicken Sie an "Prüfung starten" sofort Datenbeschaffungsprogramm. Wenn der Scan abgeschlossen ist, wiederholen Sie den Vorgang für jede der 7 standard-Lösungen. Für jede der ersten 3 Standards wird nur eines der 3 Gipfel. Notieren Sie den Speicherort des Peaks, die verwendet wird, um die Komponente zu identifizieren.

Wählen Sie 3 Diät Soda Proben und lassen sie in offenen Behältern über Nacht um die Kohlensäure zu entfernen, draußen zu sitzen.

Ziehen Sie nach Übernachtung Entgasung ca. 3 mL jede Diät-Cola in einer Kunststoffspritze. Als nächstes die Spritze beimessen Sie eine Filterspitze, und drücken Sie die Soda durch den Filter in eine Glasflasche um festen Partikel zu entfernen.

Verdünnen Sie 2 mL jeder Probe mit 2 mL der mobilen Phase, die Soda-Konzentration um die Hälfte zu verringern.

100 μl eines Soda-Proben in eine Spritze zu ziehen und in die Probenschleife injizieren. Führen Sie die Testversion mit identischen Parametern zu den Standardlösungen. Wiederholen Sie für jede Probe Soda.

Erstens korrelieren Sie die Peakflächen der standard Proben mit den bekannten Konzentrationen. Hierzu bestimmen Sie die Peakflächen auf den Chromatographen für jede standard Probe mit der dreieckigen Methode. Berechnen Sie die Peak-Höhe-Zeiten mit der Breite bei der Hälfte der Höhe zu, und verwenden Sie diesen Wert als die Peakfläche.

Mithilfe der Peakflächen und bekannte Konzentrationen erstellen Sie eine Kalibrierkurve für jede Komponente zu und bestimmen Sie der kleinsten Quadrate für jede Kalibrierungskurve passen.

Berechnen Sie die Konzentration der einzelnen Komponenten in der Diät-Limonaden aus der Peakflächen. Beachten Sie, dass die Limonaden waren alle um den Faktor 2 vor der Injektion in der HPLC verdünnt. Basierend auf diesen Ergebnissen, berechnen Sie die mg jede Komponente in der 12-Unze-Dose Soda.

Es überrascht nicht, enthalten alle 3 Limonaden getestet etwa die gleiche Menge an das Konservierungsmittel Natriumbenzoat. Jedoch enthalten die Cola-Produkte mehr Koffein. Die berechneten Werte für alle Komponenten korreliert gut mit Werten von den Herstellern.

HPLC ist ein sehr vielseitiges Instrument, das in eine Vielzahl von Analysen verwendet wird.

HPLC wird häufig verwendet, um Peptid Moleküle zu reinigen. In diesem Beispiel transmembranen Peptid-komplexe vorbereitet wurden, und dann stabilisiert durch oxidative Vernetzung der Proteine mit Disulfid-Bindungen.

Die Proteine wurden dann in Ameisensäure aufgelöst, und gereinigten mit Phase HPLC storniert. Die Probe wurde dann eluiert mit einem linearen Farbverlauf der beiden Lösungsmittel, und die Reinheit mit Massenspektrometrie bestätigt.

HPLC kann auch verwendet werden, um organische Verbindungen synthetisiert im Labor zu identifizieren. In der Miller-Urey-Experiment wurde die abiotische Synthese von organischen Verbindungen auf der ursprünglichen Erde untersucht. Primordial Gase wie Methan und Ammoniak, wurden in ein Fläschchen mit Wasser, Simulation der frühen Ozeane eingeführt. Elektrischer Entladung wurde dann angewendet, Blitz auf der Ur-Erde zu imitieren.

Das Wasser wurde dann analysiert mittels HPLC mit der Massenspektrometrie gekoppelt, und im Vergleich zu bekannten Aminosäure-Standards. 23 Aminosäuren wurden synthetisiert und in diesem Experiment identifiziert.

Sie habe nur Jupiters Einführung in HPLC beobachtet. Sie sollten nun die Grundlagen der läuft des Geräts, und die Analyse der resultierenden Daten verstehen.

Danke fürs Zuschauen!

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