Reinigung des gesamten Lipid-Extrakt mit Säulenchromatographie

Earth Science

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Overview

Quelle: Labor von Jeff Salacup - University of Massachusetts Amherst

Das Produkt ein Bio solvent-Extraktion, eine totale Lipid-Extrakt (TLE), ist oft eine komplexe Mischung von Hunderten, wenn nicht Tausende von verschiedenen Verbindungen. Der Forscher ist oft nur eine Handvoll Verbindungen interessiert. Die Verbindungen des Interesses können gehören zu einer der mehrere Klassen von Verbindungen wie Alkane, Ketone, Alkohole und Säuren (Abbildung 1), und es möglicherweise sinnvoll, die Stoffklassen zu entfernen, zu denen es nicht gehört, um einen besseren Überblick über die Verbindungen zu erhalten, die Sie interessieren. Beispielsweise kann ein TLE enthalten 1.000 Verbindungen, aber die Uk'37 Meer Oberflächentemperatur Proxy basiert auf nur zwei Verbindungen (Alkenone) und TEX86 Meer Oberflächentemperatur Proxy basiert auf nur vier (Glycerin Dialkylcarbonat Glycerin Tetraethers). Es wäre gut beraten, den Forscher, wie viele der Verbindungen zu entfernen, die sie nicht interessieren. Dies macht die instrumentelle Analytik der Verbindungen von Interesse (Alkenone oder GDGTs), seltener durch andere äußeren Verbindungen erschwert werden.

In anderen Fällen kann eine vorgeschaltete Reinigung Technik Verbindungen hergestellt haben, die Sie jetzt aus der Probe, wie zur Herstellung von Carbonsäuren während Verseifung in unserem vorherigen Video entfernen möchten. In den beiden oben genannten Fällen ist die Reinigung Technik namens Säulenchromatographie sehr nützlich.

Figure 1
Abbildung 1. Geochemisch wichtigen funktionellen Gruppen. Von Killops und Killops1.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Earth Science. Reinigung des gesamten Lipid-Extrakt mit Säulenchromatographie. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Principles

Säulenchromatographie Silikagel ist eine Reinigung-Technik, die die unterschiedlichen Verbänden der diskreten Stoffklassen für eine Kieselsäure Festphase, ein feines Pulver, das als einer Gels verwendet. Eine kleine Pipette ist etwa halb voll mit dem Gel (Abbildung 2) geladen. Diese Spalte wird dann mit einem apolaren Lösungsmittel, häufig Hexan gesättigt. Eine Probe wird dann auf der Oberseite des Gels in der Spalte geladen, und eine Reihe von Lösungsmitteln zunehmender Polarität wird sequentiell durchlaufen der Probenmaterials um es in separate zusammengesetzte Klassen trennen. Die Trennung beruht auf die Affinität der verschiedenen Substanzklassen für die feste Phase oder der Lösungsmittel-Phase. Polare Verbindungen Bindung stärker an die Kieselsäure und daher mehr polare Lösungsmittel aus der Spalte gewaschen werden. So kann mit einer Spalte und einer Probe, dieser Probe in verschiedene Fraktionen getrennt werden; z. B. Apolars (Kohlenwasserstoffe), polare (Ketone und Alkohole) und polare (Säuren und andere funktionalisierten Verbindungen).

Figure 2

Abbildung 2. Bild eines maßgeschneiderten Racks, die die Reinigung von bis zu 12 Proben gleichzeitig ermöglicht.

Säulenchromatographie ist eine flexible Technik zur Reinigung des komplexen Gemisch von Verbindungen im Sediment. Gemische trennen, wie sie bewegen sich durch die Spalte und werden gesammelt in Fraktionen, die jeweils einer anderen chemische Klasse von Verbindungen. Säulenchromatographie wird daher oft als eine zusätzliche Reinigungsstufe nach anfänglichen Isolierung der gewünschten Verbindung verwendet. Bio-Extrakte wie total Lipid-Extrakte werden komplexe Mischungen von vielen Verbindungen. Einige Reinigungstechniken, z. B. Verseifung, stellen Verbindungen, die analytische Instrumente beschädigt werden können und müssen also vor der Analyse entfernt werden. Dieses Video ist Teil einer Serie über Lipid-Extraktion, Reinigung und Analyse von Sedimenten. Sobald ein total Lipid-Extrakt aus einer sedimentären Stichprobe erhoben werden, dient der Säulenchromatographie Alkenone und GDGTs, je nach der gewünschten Analyse zu reinigen.

In Säulenchromatographie ist eine Mischung aus chemischen Verbindungen auf einer festen stationären Phase wie Silica-Gel geladen. Eine mobile Phase wie ein organisches Lösungsmittel dient dann zum Eluieren, oder zu entfernen, die Verbindungen aus der Spalte. Die Reihenfolge, in der die Verbindungen eluiert werden, hängt von der Stärke der Wechselwirkungen der Verbindungen mit der Silica-Gel und der Eluent.

Das Eluat wird in Sekundenbruchteilen, jeweils verschiedene Verbindungen aus der Mischung gesammelt. Je nach den Eigenschaften der Verbindungen kann ein einziges Lösungsmittel bieten ausreichende Trennung und eluieren alle Verbindungen von Interesse. Ansonsten sind mehrere Lösungsmittel verwendet, um jede Verbindung von Interesse wiederum eluieren.

Polare Verbindungen, die eine ungleichmäßige Verteilung der Ladung, adsorbieren stark an die polar Silica-Gel während apolaren Verbindungen schwach adsorbieren. Polare Lösungsmitteln haben größere Affinität für Silica-Gel und sind daher stärker Eluenten als apolaren Lösungsmittel. So eluieren apolaren Lösungsmittel nur apolaren Verbindungen, während die polare Lösungsmitteln apolaren und polaren Verbindungen eluieren.

Wenn die gewünschte Verbindungen mäßig polar sind, sollten apolaren Verbindungen aus der Spalte mit einem apolaren Lösungsmittel gewaschen, bevor ein polares Lösungsmittel verwendet wird. Zur Vermeidung von unerwünschten stark polaren Verbindungen wie Säuren eluierenden sollte eine polare Laufmittel nicht mehr Medikamentenfreisetzende macht als nötig für die meisten polar gewünschten Verbindung haben.

Nun, Sie die Prinzipien der Säulenchromatographie verstehen, durchlaufen Sie Lasst uns ein Verfahren zur Reinigung von Lipid-Biomarkern aus einer gesamten Lipid-Extrakt durch Säulenchromatographie Silikagel.

Organische Verunreinigungen entfernen, verbrennen Borosilikatglas Pipetten, Borosilikat Glasfläschchen und Glaswolle für 6 h bei 550 ° C. Sobald die Glaswaren einsatzbereit, richten Sie ein Rack, Pipetten und Fläschchen zu halten ist. Pipette Lampen erhalten, Pinzette, ein Labor Spatel, Kieselgel, Hexan, Dichlormethan und Methanol zu reinigen. Legen Sie mit einer sauberen Pinzette ein kleines Büschel Glaswolle in den Mund einer Pipette. Drücken Sie vorsichtig die Glaswolle am unteren Rand die Pipette mit dem Stiel einer anderen Pipette, einen losen Stecker zu bilden. Laden Sie sorgfältig Silica-Gel in die Pipette bis zur Hälfte gefüllt. Sichern Sie die Pipette aufrecht im Rack. Ein 4-mL Borosilikatglas Fläschchen unter die Spitze der Pipette für die Müllabfuhr zu sichern. Aussetzen Sie in einem anderen Borosilikatglas Ampulle, bis zu 10 mg der trockenen Probe aus dem Prozess der Verseifung in Hexan. Wenn die Probe an die Wände der Flasche festhält, beschallen Sie das Fläschchen für 5 min. Die Chromatographie-Verfahren kann nun beginnen.

Um die Chromatographie beginnen, waschen Sie die Silica-Gel-Spalte mit 3 Bände von Hexan, Luftblasen und Verunreinigungen zu entfernen. Ersetzen Sie die Abfälle Fläschchen mit einer leeren Fläschchen für den apolaren Bruch. Laden Sie mit einer Glaspipette die Probe auf die Säule und lassen Sie die Aufhängung in die Silica-Gel einweichen. Arbeiten Sie schnell, so dass die Spalte während des Verfahrens nicht austrocknet. Spülen Sie das Probenfläschchen zweimal mit kleinen Portionen von Hexan und übertragen Sie jedem Spülen in die Spalte zu. Weiter die Spalte Hexan hinzu, bis die Sammelbehälter fast voll ist. Lassen Sie alle das Hexan, Eingabe der Silica-Gel zu beenden. Dann tauschen Sie die gefüllte Flasche mit einer leeren Fläschchen für die Mitte-polar Bruchteil. Anschließend spülen Sie das Probenfläschchen mit DCM und Hinzufügen der Spalte 3 Mal. Weiter die Spalte DCM hinzu, bis die Sammelbehälter fast voll ist. Ermöglichen Sie die DCM, Einweichen in der Silica-Gel zu beenden und dann tauschen Sie die gefüllte Fläschchen mit einer leeren Fläschchen für polar Bruchteil. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit Methanol.

Sobald die Flasche fast voll ist, erlauben Sie das Methanol zu Tropfen in die Flasche zu beenden und dann Kappe alle Ampullen. Die Mitte-polar Bruchteil enthält die gewünschte Alkenone während der GDGTs in der polare Anteil sind. Für besonders schmutzige oder komplexe Alkenone Proben muss der Mitte unpolaren Anteil weiter mit Harnstoff Adduktion, vor der Analyse gereinigt werden.

Säulenchromatographie ist in der Chemie als eine analytische und Reinigung Technik verbreitet.

Kohlenstoff-Nanoröhrchen oder CNTs, sind zunehmend in vielen Branchen eingesetzt, aber es gibt wachsende Besorgnis über deren Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit. Unterschiedliche Eigenschaften von CNTs Änderungen in Wasser und Boden Verhalten. Um zu untersuchen, wie gut die poröse Medien wie Sand und Schmutz CNTs behalten, wurde eine Spalte mit porösem Boden als die stationäre Phase vorbereitet. Zunächst sammelten Brüche während des Ladens der CNT-Lösung auf die Säule, den Transport von CNTs durch Boden zu analysieren. Dann noch auf den Boden adsorbiert CNTs wurden eluiert und analysiert die Fraktionen für den Betrag von CNTs, die im Boden geblieben waren. Die Ergebnisse geben einen Einblick in die Beziehung zwischen CNT Oberfläche Funktionalisierung und deren Transportmechanismen in der Umgebung.

Säulenchromatographie kann sowohl kleine als auch große Schuppen operiert werden, und deshalb verwendet, wenn entwirft Synthesen für industrielle Anwendungen. Spinnenseide haben hervorragende Festigkeit und Duktilität, aber können nicht in industriellem Maßstab geerntet werden. Nach Seide Proteinsynthese sind rekombinante Seidenproteine durch Affinitätschromatographie, gereinigt in der stationäre Phase nur das gewünschte Molekül binden soll. Gründliches Waschen und Elution gewährt die reine Proteinfraktionen Spinnenseide in großen Maßstäben zu drehen musste.

Viele stationäre Phasen stehen für Säulenchromatographie. Eine stationäre Phase möglicherweise nicht für alle möglichen Produkte einer Synthese mit einem breiten Anwendungsbereich der Substituenten, wie z. B. diese Iodoaziridine Synthese geeignet. Rohprodukt ist gemischt mit verschiedenen stationären Phasen und Zersetzung von Proton NMR bewertet. Da Proton NMR sehr empfindlich ist, können viele stationäre Phasen für Produkt Zersetzung mit einem kleinen Betrag Rohprodukt abgeschirmt werden. Säulenchromatographie erfolgt dann mit der optimalen stationären Phase ermöglicht die Reinigung von Roman und hochreaktive Verbindungen.

Sie habe nur Jupiters Einführung in Säulenchromatographie für die Reinigung des gesamten Lipid-Extrakt beobachtet. Das folgende Video zeigt wie man komplexe Mischungen, die Alkenone weiter zu reinigen.

Danke fürs Zuschauen!

Procedure

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1. Setup und Vorbereitung der Materialien

  1. Erhalten Sie eine totale Lipid Extrakt (TLE) Lösemittelextraktion Verfahren (Ultraschall, Soxhlet oder beschleunigte Lösungsmittel Extraktion (ASE)).
  2. Sammeln Sie die folgenden: verbrannt Borosilikat Glas, Pipetten und Glühbirnen, Kieselgel, Hexan, Dichlormethan (DCM) und Methanol.
    1. Diese Materialien können von jedem chemischen Händler gekauft werden. Die Reagenzien sollte rein und frei von Kohlenwasserstoffen.
  3. Erhalten Sie auch verbrannt Glaswolle und Borosilikatglas 4-mL-Fläschchen.
  4. Achten Sie darauf, ein Mittel zur Förderung der Spalte und die Sammlung Fläschchen während des Verfahrens haben. Zum Beispiel einen Stand mit Klammern und einem abscheulichen Rack. Viele Labore haben maßgeschneiderte Gestelle entwickelt, die mehrere Spalten und Sammlung Fläschchen (Abbildung 2) zu halten. Dadurch können viele Spalten gleichzeitig ausgeführt werden.

(2) Methoden

  1. Beginnen Sie mit der trockenen Probe in einem 4-mL-Fläschchen. Wenn die Probe wiegt mehr als ~ 10 mg nach dem Trocknen, es müssen aufgeteilt werden, bevor Sie die nächsten Schritte durchführen, wie das Silica-Gel nur mit einer endlichen Masse von organischen Stoffen reagieren zu können.
  2. Unterbrechen Sie die Probe in einer kleinen Menge von Hexan. Dies ist die erste und die mindestens drei Lösungsmittel polar in dieses Experiment verwendet.
  3. Besteht die Probe an der Innenseite der Flasche stecken, beschallen Sie die Proben 5 min.
  4. Laden Sie eine kleine Menge von Glaswolle in den oberen Teil einer Pipette mit einem Satz von sauberen Pinzette. Drücken Sie vorsichtig die Glaswolle am unteren Rand der Pipette, mit einem anderen Pipette, um einen Stecker zu bilden.
  5. Übertragen Sie sorgfältig Silica-Gel in die Pipette, bis es etwa halb voll ist.
  6. Legen Sie ein Abfallsammlung 4-mL-Fläschchen unter der Spalte.
  7. Die Silica-Gel in die Pipette mit 3 Bände von Hexan einweichen. Diese Bedingungen die Spalte Luftblasen entfernt und spült Verunreinigungen aus der Silica-Gel.
  8. Sobald die letzte Wäsche fertig ist, entfernen Sie den Abfall Sammelbehälter und ersetzen Sie es durch ein Fläschchen den apolaren Bruch zu sammeln.
  9. Die gesamte Probe im Hexan auf die Säule mit einer Pipette vorsichtig zu übertragen. Spülen Sie das Probenfläschchen zwei weitere Male mit kleinen Volumina von Hexan, und übertragen Sie auf die Spalte. Lassen Sie das Hexan, die, dem in die Probe übertragen wurde, vollständig in das Silica-Gel einweichen. Zu keinem Zeitpunkt während des Verfahrens sollte das Silica-Gel austrocknen.
  10. Weiter oben im Beispiel Hexan hinzu, bis der Sammelbehälter unterhalb der Spalte fast voll ist (~ 4 mL).
    1. Erlauben Sie all das Hexan Silikagel eingeben, bevor Sie mit dem nächsten Lösungsmittel.
  11. Legen Sie den mittleren Polarität Sammelbehälter unter der Spalte.
  12. Fügen Sie DCM zu den oberen Rand der Spalte hinzu, bis der Sammelbehälter fast voll ist. Lassen Sie, alle von der DCM in den Sammelbehälter geben vor dem Start der nächsten Lösungsmittel.
  13. Legen Sie den polar Sammelbehälter unter der Spalte.
  14. Den oberen Rand der Spalte fügen Sie Methanol bis die abscheulichen Sammlung fast voll ist hinzu.

Results

Diese Reinigung Technik produziert drei verschiedene Ampullen, jedes mit einer anderen zusammengesetzten Klasse oder Gruppe von Stoffklassen. Die Komplexität einer Probe auf einem Instrument analysiert wurde erheblich verringert. Dieser Vorgang entfernt auch Verbindungen wie Säuren produziert während einer Verseifung, das tatsächlich an Teile der Instrumente, wegen ihrer geringen Volatilität halten kann, die ihre Genauigkeit verringern würde, Präzision und Lebensdauer.

Applications and Summary

Alkenone isoprenoider GDGTs sind beide sehr häufig Bestandteile von marinen Sedimenten und finden Sie über die Weltmeere. Alkenone sind zunehmend in Seesedimenten, erkannt wird, obwohl die Organismen verantwortlich für ihre Produktion anders als in den Ozean, und somit die Beziehung zwischen der U sindk'37 Verhältnis und Wassertemperatur (Kalibrierung) unterscheidet sich vom Meer und sogar zwischen separaten Seen. Isoprenoider GDGTs finden sich in einigen großen Seen und wie Alkenone, brauchen oft eine lokale Kalibrierung.

Alkenone und GDGTs wir interessiert sind kommen in das Keton und polare Fraktionen bzw.. In marinen Sedimenten analysieren wir oft beide Meer Oberflächentemperatur (SST) Vollmachten von einer Probe. Dies ermöglicht den Bau von zwei unabhängigen SST Records, die die Entwicklung der Wassertemperatur am zentralen Standort durch die Zeit zeigen. Dieses Vergleichs, genannt einen Multi-Proxy-Ansatz oft highlights Mal wenn die beiden Proxys zustimmen und Zeiten, in denen sie dies nicht tun. Dieser Vereinbarung oder Diskrepanz selbst enthält Informationen. Stimmen die beiden Proxys, vielleicht die produzierenden Organismen den gleichen Tiefe Lebensraum besetzt oder vielleicht lebte sie in einer separaten Tiefe aber eine gut durchmischten Wassersäule führte zu der vertikalen Homogenisierung der Temperatur (Wasser kühlt sich in der Regel mit der Tiefe). Wenn die beiden Proxys nicht einverstanden sind, könnte es sein, dass die beiden Populationen in separaten tiefen gelebt; Leben in warmen, flachen Gewässern und in kühleren, tieferen Wasser. Oder es könnte sein, dass die Verbindungen in verschiedenen Zeiten des Jahres produziert wurden und so reflektieren die Temperaturen der verschiedenen Jahreszeiten. Diese Fragen werden durch die Analyse von zwei verschiedenen SST Proxies am gleichen Standort erstellt und sie markieren die Pflege Bio Geochemiker und Paleo-Klimaforscher müssen Sie bei der Interpretation ihrer Daten.

Wegen der hohen relativen Stabilität des apolaren Kohlenwasserstoffe enthält der apolaren Bruch viele interessante organische Verbindungen. Alkane sind wichtige Bestandteile eines Blattes wachsartige Außenschicht und sie werden im Sediment Datensätze aus vielen Gründen verwendet. Ihre durchschnittliche Kettenlänge (Anzahl der Kohlenstoffatome) enthält Informationen über die Dominanz der aquatischen vs. Landpflanzen, Temperatur und Niederschlag. Die isotopische Verhältnis von Kohlenstoff in Alkanen bezieht sich auf den C3 und C4-Anlagentyp der Pflanze, die es produziert und die Wasserstoff-Isotopen-Verhältnis bezieht sich auf lokalen bis zur globalen Temperatur und Niederschlag. Steran und Hopanes finden sich auch in der apolaren Bruchteil. Diese Biomarker sind die Geostable Versionen von bioaktiven Substanzen wie Hopanoids und Steroide, die wichtige biochemische Rollen in Prokaryoten und Eukaryoten, bzw. dienen.

Die mittleren Polarität Bruchteil enthält unsere Alkenone. Alkenone sind Ketone, die wichtigen alten Oberflächentemperaturen über die U-Recorder sindk'37 Meer Oberflächentemperatur Proxy. Einige Ketone kommen auch aus den gleichen Blatt wachsen tun die Alkane, die zwar gibt es in der Regel weit weniger.

Der polare Anteil enthält Karboxylhaltige Säuren, ein weiterer wichtiger konstituierenden in Blatt Wachs, das ist etwas weniger spezifisch und härter arbeiten als Alkane (niedrige Volatilität) mit aber dennoch einige der gleichen Informationen beziehen können. Glycerin Dialkylcarbonat Glycerin Tetraethers (GDGTs) sind in der polare Anteil und sind ein weiterer wichtiger Recorder der alten Wasser- und Lufttemperaturen.

References

Killops, S. and Killops, V. Introduction to Organic Geochemistry. Blackwell Publishing, Malden, MA (2005).

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1. Setup und Vorbereitung der Materialien

  1. Erhalten Sie eine totale Lipid Extrakt (TLE) Lösemittelextraktion Verfahren (Ultraschall, Soxhlet oder beschleunigte Lösungsmittel Extraktion (ASE)).
  2. Sammeln Sie die folgenden: verbrannt Borosilikat Glas, Pipetten und Glühbirnen, Kieselgel, Hexan, Dichlormethan (DCM) und Methanol.
    1. Diese Materialien können von jedem chemischen Händler gekauft werden. Die Reagenzien sollte rein und frei von Kohlenwasserstoffen.
  3. Erhalten Sie auch verbrannt Glaswolle und Borosilikatglas 4-mL-Fläschchen.
  4. Achten Sie darauf, ein Mittel zur Förderung der Spalte und die Sammlung Fläschchen während des Verfahrens haben. Zum Beispiel einen Stand mit Klammern und einem abscheulichen Rack. Viele Labore haben maßgeschneiderte Gestelle entwickelt, die mehrere Spalten und Sammlung Fläschchen (Abbildung 2) zu halten. Dadurch können viele Spalten gleichzeitig ausgeführt werden.

(2) Methoden

  1. Beginnen Sie mit der trockenen Probe in einem 4-mL-Fläschchen. Wenn die Probe wiegt mehr als ~ 10 mg nach dem Trocknen, es müssen aufgeteilt werden, bevor Sie die nächsten Schritte durchführen, wie das Silica-Gel nur mit einer endlichen Masse von organischen Stoffen reagieren zu können.
  2. Unterbrechen Sie die Probe in einer kleinen Menge von Hexan. Dies ist die erste und die mindestens drei Lösungsmittel polar in dieses Experiment verwendet.
  3. Besteht die Probe an der Innenseite der Flasche stecken, beschallen Sie die Proben 5 min.
  4. Laden Sie eine kleine Menge von Glaswolle in den oberen Teil einer Pipette mit einem Satz von sauberen Pinzette. Drücken Sie vorsichtig die Glaswolle am unteren Rand der Pipette, mit einem anderen Pipette, um einen Stecker zu bilden.
  5. Übertragen Sie sorgfältig Silica-Gel in die Pipette, bis es etwa halb voll ist.
  6. Legen Sie ein Abfallsammlung 4-mL-Fläschchen unter der Spalte.
  7. Die Silica-Gel in die Pipette mit 3 Bände von Hexan einweichen. Diese Bedingungen die Spalte Luftblasen entfernt und spült Verunreinigungen aus der Silica-Gel.
  8. Sobald die letzte Wäsche fertig ist, entfernen Sie den Abfall Sammelbehälter und ersetzen Sie es durch ein Fläschchen den apolaren Bruch zu sammeln.
  9. Die gesamte Probe im Hexan auf die Säule mit einer Pipette vorsichtig zu übertragen. Spülen Sie das Probenfläschchen zwei weitere Male mit kleinen Volumina von Hexan, und übertragen Sie auf die Spalte. Lassen Sie das Hexan, die, dem in die Probe übertragen wurde, vollständig in das Silica-Gel einweichen. Zu keinem Zeitpunkt während des Verfahrens sollte das Silica-Gel austrocknen.
  10. Weiter oben im Beispiel Hexan hinzu, bis der Sammelbehälter unterhalb der Spalte fast voll ist (~ 4 mL).
    1. Erlauben Sie all das Hexan Silikagel eingeben, bevor Sie mit dem nächsten Lösungsmittel.
  11. Legen Sie den mittleren Polarität Sammelbehälter unter der Spalte.
  12. Fügen Sie DCM zu den oberen Rand der Spalte hinzu, bis der Sammelbehälter fast voll ist. Lassen Sie, alle von der DCM in den Sammelbehälter geben vor dem Start der nächsten Lösungsmittel.
  13. Legen Sie den polar Sammelbehälter unter der Spalte.
  14. Den oberen Rand der Spalte fügen Sie Methanol bis die abscheulichen Sammlung fast voll ist hinzu.

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