Overview
ソース: ドクターペッパー イアン博士チャールズ Gerba - アリゾナ大学所
示す著者: ブラッドリー ・ シュミッツ
量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR)、リアルタイム PCR とも呼ばれますは、環境中の微生物を列挙するため広く使われている分子手法です。このアプローチの前に、微生物の定量化は、古典文化ベースの技術の主に限られていた。環境試料からの微生物の培養は、特に困難になることができ、それは一般的に微生物の環境試料中に存在の 1 ~ 10% がこれらの技術を使用して検出数が開催されます。環境微生物学研究の qPCR の出現が病気の原因となるなどの微生物の濃度より正確な測定を可能にする大きくしてフィールドを進んでいるしたがって環境試料中の病原体。しかし、応用微生物学的手法として qPCR の重要な制限事項は、非アクティブまたは非生物の集団生活、実行可能な人口を区別できないが、です。
このビデオでは、環境水サンプルからトウガラシマイルドモットル ウイルスを検出する qPCR の使用を示します。
Principles
QPCR の背後にある基本的な原則は、標準 PCR-テンプレートのプライマーアニー リングのサイクルは、テンプレートから製品の変性と PCR 産物の伸長を繰り返す、「増幅」プールから開始材料のとして知られている興味のターゲット シーケンスの指数関数的増幅につながると同じです。QPCR の革新はで各サイクル専門の thermocyclers で「リアルタイム」で直接可視化することで PCR 製品合成が可能反応に蛍光化学薬品付加は、元のサンプル テンプレート順序量を定量化することが可能。量は、通常蛍光製品の量がバック グラウンド レベルを超えた、PCR のサイクルである閾値サイクル (Ct、定量化サイクルまたは Cqとしても知られている) の面で測定されます。
定量化は別標準または制御シーケンスを 1 つのシーケンスの Ct値を比較相対することができます。または、一連の既知量の DNA を反応のサンプルと一緒に実行すると、DNA 量の蛍光値を比較する「標準曲線」は作り出すことができるし、、サンプル dna 確実に測定します。
1 つの qPCR 法プローブとして知られている DNA の短いストレッチは興味の特定のターゲット シーケンスに対して設計されています。プローブは、蛍光色素として近接の場合色素からの蛍光信号を抑制する「癒す」分子に化学的に添付されます。ポリメラーゼの酵素は、DNA の製品を合成、蛍光分子プローブは、したがって、クェンチャーから色素を分離し、検出される蛍光信号を許可するから解放されるための原因となる DNA 分解活性があります。Fluorophore レベルを定量的測定した各 PCR 増幅ターゲット シーケンス (「産物」と呼ばれる) 環境試料中に存在のより高いレベルに増加信号強度の相関とのサイクル。
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Procedure
1. サンプル コレクション
- オーガーを使用して土壌を収集または決められた深さをシャベルで掘る。根から土を集めて、ルートから余分な土壌を押すとコレクション バレルに希望の土壌を削りによって植物根周り 7 mm 以内の土壌を収集のみ。
- 棒を浸漬に滅菌 Nalgene 瓶を配置します。棒の端を保持し、ボトルを水没によって水を収集します。氷をクーラーにボトルを置きます。
- 研究室にサンプルを転送します。
2. 核酸抽出
- 収集した試料から微生物を分離してそれらから DNA や RNA を抽出するには、コミュニティによる核酸抽出にゼウス科学教育ビデオを参照してください。
3. 逆のトランスクリプション
- 試金される遺伝物質が RNA の場合逆転写 PCR に進む前にを介して相補的 DNA (cDNA) を生成する使用する必要があります。詳細については、ゼウス科学教育 RT-PCR のビデオを参照してください。
4. qPCR の設定
- -20 ° C で保存試薬を取得し、氷の上またはクリーン フード内室温で解凍します。この例で使用する試薬は、qPCR 反応混合物 (qPCR マシンに依存使用; DNA ポリメラーゼが含まれています), 前方および逆のプライマーと TaqMan プローブ。プライマーおよびプローブ シーケンスは、シーケンスが列挙されて生物に特有の設計されています。現在の文献の興味のシーケンスを見つけるために参照してください。この例では、ロシュ社光サーマルサイクラー 480 プローブ ミックス試薬システムが使用されます。トウガラシマイルドモットル ウイルスは、水試料に列挙されます。1, 2は、プライマーの表 1を参照してくださいし、のプローブ順序。
- 解凍は、常温 (c) サンプルおよび肯定的な制御 (細菌のプラスミドにクローニング生物固有のシーケンスで構成) される DNA から DNA を抽出しました。
- QPCR 96 ウェル プレートのような 96 セルのテーブル テンプレートを準備します。各セルには、プレートの上に読み込まれる反応にラベルを付けます。肯定的な制御のない DNA 反応などの否定的な制御だけでなく、各サンプルと 3 通、標準の反応があります。
- 製造元の指示および文献に基づいて、反応の間で一定している試薬のすべてが含まれます「マスター ミックス」の反応に必要な試薬のボリュームを計算します。すべてのサンプルに加えて、コントロール、およびピペット誤差を考慮する、さらに 10% の帳票の反応を十分なマスター ミックスを準備します。サンプル マスター ミックス レシピは、表 2を参照してください。
- すべての試薬は完全に融解後一度クリーン フード内部の作業、マスター ミックスを作成する 1.5 mL 低結合および microfuge の管に各試薬の計算量を追加します。渦と簡単に minicentrifuge 追加する前に各試薬。汚染を防ぎ正しい濃度を維持する各試薬間ピペット チップを変更します。すべての試薬を追加すると、渦と minicentrifuge は均質性を確保するためのマスターの組合せとチューブします。
- 因数 96 ウェル PCR プレートでよく示されるそれぞれにマスター ミックスの適切なボリューム。
- 指定されたウェルに (c) DNA のサンプル、肯定的な制御プラスミドと否定的な制御 (分子グレード水) の適切な量を追加します。
- すべてのサンプルやコントロールを追加すると、プレート シール箔をシールします。箔の下から空気をプッシュすると泡を防ぐシール ツールを使用します。ホイルのエッジを慎重にはがします。
- 各井戸の底で混合物を収集するプレート ホルダーと遠心分離機でシール 96 ウェル プレートを遠心します。カウンターウェイト プレートを使用して回転しながら遠心分離機を正しく分散されますを確認することを確認します。遠心分離機のパルス 1000 rpm までし、ブレーキなし聞かせて遠心分離機が徐々 に停止します。
5. qPCR 操作
- QPCR マシンに封印された 96 ウェル プレートを配置します。そのマシンを開始する準備ができたことを示しますを確認します。
- すべての情報、ソフトウェアによって必要な qPCR マシンを実行を設定を正しく入力する qPCR マシンの指示に従います。
- コンピューターには、実行が完了すると、ソフトウェアは各反応の cDNA の数量を計算する肯定的な制御の既知濃度を使用することになります。元のサンプル ウイルス量計算できます、希釈、ろ過、集中、増幅、または DNA のサンプルを取得するための抽出プロセスに基づきます。
| 試薬 | シーケンス (5' → 3') | ボリューム (μ L/も) | 最終濃度 |
| 前方のプライマー | GAGTGGTTTGACCTTAACGTTTGA | 2.25 | 900 nM |
| 逆プライマー | TTGTCGGTTGCAATGCAAGT | 2.25 | 900 nM |
| プローブ | FAM CCTACCGAAGCAAATG BHQ1 | 1.0 | 200 nM |
表 1。検出するためのサンプルのプライマーおよびプローブ シーケンスはコショウ トウガラシマイルドモットル ウイルスです。
| 試薬 | ボリューム (μ L/も) | 井戸の数 | マスター ミックス ボリューム (μ L) |
| LC 480 ミックス | 12.5 | 26 | 325 |
| 分子 H2O | 4.5 | 117 | |
| 前方のプライマー | 2.25 | 58.5 | |
| 逆プライマー | 2.25 | 58.5 | |
| プローブ | 1.0 | 26 | |
| 合計 | 22.5 | 585 |
表 2。個々 の反応のマスター ミックス試薬ボリューム。
量的なポリメラーゼの連鎖反応、または、qPCR の出現が可能定量的環境試料中のすべての微生物の量を決定します。
標準 PCR のような qPCR は興味の有機体に特定の DNA シーケンスの存在の有無を検出することにより微生物を識別します。環境微生物のはるかに広い範囲を測定することが可能となって、研究室で培養できない微生物の検出が可能になります。また、qPCR は定量的に評価するための DNA の量をことができます。しかし、同時に PCR 方法論はデッドオアア ライブ、サンプル中の微生物を積極的に成長のためだけを検索する機能を制限するすべての有機体から DNA を検出します。
このビデオは通常 PCR の qPCR の区別、qPCR を使用して DNA を定量的に測定する方法を説明する化学の技術革新を確認、qPCR を使用して土壌試料からの RNA ウイルスを検出、および環境微生物学にで qPCR が適用される今日を最後に、示すプロトコルを示します。
QPCR の背後にある基本的な原則は、通常 PCR - テンプレートのプライマーアニー リングのサイクルは、テンプレートから製品の変性と PCR 産物の伸長を繰り返す私アンプリコン、出発物質のプールからとして知られている興味のターゲット シーケンスの指数関数的増幅につながると同じです。
QPCR の革新はで各サイクル専門の thermocyclers で「リアルタイム」で直接可視化することで PCR 製品合成が可能反応に蛍光化学薬品付加は、元のサンプル テンプレート順序量を定量化することが可能。数量閾値サイクルの面では、通常測定、Ct、定量化サイクルまたは Cq、蛍光製品の量がバック グラウンド レベルを超えた、PCR のサイクルである別名を省略します。
別標準または制御シーケンスを 1 つのシーケンスの Ct値を比較、定量化は相対することができます。相対的な量は 2 Ctの差の力に等しいです。または、反応のサンプルと一緒に既知量の DNA のシリーズを実行すると、DNA 量の蛍光値比較標準曲線は作り出すことができるし、量的に表わされる絶対に DNA のサンプルをことができます。
QPCR で使用される蛍光分子の 2 つの広いタイプがあります。1 つの場合、二本鎖 DNA に結合する蛍光染料は反応に含まれます。染料の蛍光を発するは、DNA の二本鎖 DNA 製品測定する量をできるようにするバインドされたときのみ。
他の方法で、プローブとして知られている DNA の短いストレッチは興味の特定のターゲット シーケンスに対して設計されています。プローブは、蛍光色素として近接の場合色素からの蛍光信号を抑制する「癒す」分子に化学的に添付されます。ポリメラーゼの酵素は、DNA の製品を合成するには、蛍光分子プローブは、したがって、クェンチャーから色素を分離し、蛍光シグナルを検出することができますからの「リリース」の原因となる DNA 分解活性があります。
今では qPCR の背後にある原理を理解すると、植物に感染すると、トウガラシマイルドモットル ウイルス、土壌サンプルから RNA ウイルスを識別するためにこの手法を使用するためのプロトコルを見てみましょう。
このデモでは、根圏、土の根との共生微生物によって影響される植物の根の周り約 7 mm のゾーンからサンプルを収集します。
根圏土壌を収集、最初慎重に地面から興味の植物を抽出し余分なバルクとして削除するヒット可能な土壌します。演習でさらに処理工場をパッケージ化します。
研究室に戻るには、サンプルを読み込んだら、コレクションの容器に必要な土壌をスクラップに滅菌スパチュラを使用します。土壌からウイルスを収集し、RNA を抽出します。
サンプルから RNA を収集した後は、相補的にまたは逆のトランスクリプションによる cDNA を変換します。ゼウス SciEd 逆転写 PCR この手順の詳細についてのビデオを参照してください。
QPCR を実行する準備ができたら、専用の層流フードの内部部屋の温度で冷凍試薬を解凍し、一度融解したもの氷の場所します。DNA のポリメラーゼの酵素を含む試薬コンポーネントは、氷の上常に保管してください。
サンプル cDNA と肯定的な制御の興味それにクローンの私アンプリコンを持つプラスミドとして知られている DNA の円形の部分などの DNA を解凍します。
QPCR 96 ウェル プレートで反応を組み立てる前に紙の上 96 セルのテーブル テンプレートを準備し、プレートに読み込まれる反応を各セルにラベルを付けます。肯定的な制御のない DNA 反応などの否定的な制御だけでなく、各サンプルと 3 通、標準の反応があります。
反応の間で一定している試薬のすべてが含まれます「マスター ミックス」の反応に必要な試薬のボリュームを計算します。すべてのサンプルに加えて、コントロール、およびピペット誤差を考慮する、さらに 10% の帳票の反応を十分なマスター ミックスを準備します。
試薬は、解凍後、1.5 mL 低吸着および microfuge の管のマスター ミックスを組み立てます。これを行うに、簡潔に渦を徹底的にミックス、小型遠心分離機を使用して管の側面の任意の液体を収集各試薬および microfuge の管にピペットの試薬。必ず反応コンポーネントごとに新しいピペット チップを使用してください。後すべての試薬が追加されました、ミックスして遠心分離機の渦。その後、PCR プレートに指定されたウェルにマスター ミックスの適切な量の約数。
次に、渦と遠心分離機サンプルとコントロール DNA、各チューブ、PCR プレートの各ウェルに適切な量をピペットします。サンプルを追加すると、プレートにシール箔シールし、シールのツールを使用して完全にシールを平らにし、空気の泡を押し出します。シールの端から非粘着タブを慎重にはがします。
井戸の底に完全に反応混合物を収集するには、プレート ホルダーと遠心分離機に反応プレートを置き、カウンターウェイトのプレートが付いている回転子のバランスをとる。パルス遠心分離機 1,000 rpm までプレートは、遠心ブレーキなしストップに来てゆっくりしてみましょう。
QPCR マシンにリアクション プレートを配置します。使用されているプライマーによると溶融温度を設定、製造元の仕様に従って PCR プログラムを設定します。反応プログラムを実行するを設定します。
QPCR プログラムが完了すると、ソフトウェアは各反応の cDNA の数量を計算する肯定的な制御の既知濃度を使用することになります。元のサンプルでウイルスの量が計算できます。
QPCR プログラムが完了すると、ソフトウェアは各反応の cDNA の数量を計算する肯定的な制御の既知濃度を使用することになります。
QPCR、井戸、土壌からの抽出および逆のトランスクリプションからファクターに転送量の結果と初期の土壌試料中のウイルスの数を計算できます。
今、あなたは、qPCR の実行方法を知って、それを使用して異なる環境試料を分析する方法を見てみましょう。
qPCR を使用して、サンプルの多くの異なる種類から回復したウイルスの量を定量化できます。このアプリケーションでアデノ ウィルスの 2 種類は数多くの異なる方法による水試料から集中していた。DNA はウイルスから抽出し、濃度の方法の相対的な効率を評価する qPCR を受けます。
QPCR による生菌の別のアプリケーションは、食品と農業のサンプル - この例では、糞便細菌の含量を定量化し、養鶏場からサンプルのくずです。個々 の種をターゲットではなく科学者は qPCR のすべての細菌の非常に節約された遺伝子に対するプライマーを使用してを実行し、サンプルの合計細菌群集を定量化します。
最後に、前述したように、従来の qPCR の方法論の欠点の 1 つはライブとデッドの微生物が識別することはできません。ただし、propidium monoazide、または PCR などその後の酵素反応を阻害する DNA に結合する死んだ細胞をのみ入力できます、PMA と呼ばれる化学物質を追加することによって研究者ここでされたエシェリヒア属大腸菌o157: h7、汚染された食物や水は、一般的な病原性株のライブとデッドの文化の間で区別することができます。
環境微生物と qPCR を使用してウイルスを定量化するゼウスの導入を見てきただけ。今、qPCR のしくみ、qPCR を使用して環境のサンプル、およびこの手法のいくつかのアプリケーションで微生物の量を測定する方法を理解する必要があります。見てくれてありがとう!
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Applications and Summary
定量化する能力は、qPCR 法によるコピー、科学分野の数に重要なゲノム セグメントを対象と。次の使用例アプリケーション
(1) 水、土壌、食品、表面、等の病原体を列挙します。
リアルタイム PCR を利用して、さまざまな環境における病原体を列挙します。流行中に広がりの原因の源を見つけるに関心の病原体の水と土のサンプルを分析できます。ソースは、病原体の濃度を列挙し、汚染の量を決定するさらに分析することができます。たとえば、重度の胃腸炎や嘔吐、下痢をする乗客の間で起こしているクルーズ船でノロウイルスの発生、中に水と食品サンプルは、ウイルス、例えば、正しく扱われませんでした、高い糞便汚染が含まれている水の源を識別するためにリアルタイム PCR に受ける場合があります。
(2) 排水処理による病原微生物の減少を測定
未処理下水水を含む病気の原因となる豊富な微生物と公衆衛生を保護するために扱われる必要があります。水試料は排水処理鉄道に沿ってさまざまなポイントで収集されたことができ、qPCR を使用してウイルスなどの病原性微生物の濃度の削減を決定する分析します。計算の削減、排水処理や水の再利用用途の有効性に関して貴重な情報を提供します。
(3) 環境における遺伝子マーカーの測定
微生物は、メンバーシップの変更と環境圧力による活動の変動によって予告します。これらの変化は、特定環境ストレスによって活性化する可能性があります機能遺伝子の解析を介して監視できます。リアルタイム PCR は、微生物活動の変更を監視するためのサンプルのこれらの遺伝子の発現を定量化する使用ことができます。たとえば、qPCR 人工汚染土壌に存在の存在下で生分解経路の活性化遺伝子の発現を定量化する微生物生態学者をことができます。
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References
- Zhang, T., Breitbart, M., et al. RNA Viral Community in Human Feces: Prevalence of Plant Pathogenic Viruses. PLoS Biology. 4, e3 (2005).
- Haramoto, E., et al. Occurrence of Pepper Mild Mottle in Drinking Water Sources in Japan. Applied Environmental Microbiology. 79, 7413-7418 (2013).
