検量線

Analytical Chemistry

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Overview

ソース: 研究所博士 b. ジル Venton - ヴァージニアの大学の

検量線は、検体を機器の応答を理解し、未知試料の濃度を予測に使用されます。一般的には、標準試料のセットは、興味の未知が含まれていますよりも範囲で種々 の濃度に作られています、各濃度で楽器の応答が記録されます。高い精度とエラーを理解するのは、エラー バーが得られるように各濃度で応答を繰り返すことができます。未知濃度を予測できるように、データは関数と合うし。通常線形応答、曲線が他の機能で行うことが関数は知られている限りでは、しかし、です。検量線は、検出限界と定量限界の計算に使用できます。

較正曲線のためのソリューションの際、各ソリューションを個別に可能です。ただし、開始材料の多くを取るし、時間がかかるをことができます。ソリューションの多くの異なる濃度を作るための別の方法は、シリアルの希薄を使用することです。シリアル希釈で集中のサンプルは低濃度を段階的に下に希薄化します。次のサンプルは前希釈からなされ、希釈倍率を一定に保たれる多くの場合。利点は、1 つだけの最初のソリューションが必要であります。欠点ソリューション作成のエラーは、-ピペッティング、マス、等-より多くのソリューションが行われるとに反映されます。初期解の際、注意が必要があります。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 分析化学の基本. 検量線. JoVE, Cambridge, MA, (2019).

Principles

未知試料の濃度を予測するための較正曲線を使用できます。完全に正確であること、標準試料を未知のサンプルとして同じ行列で実行してください。サンプル マトリックスは、溶媒とすべての塩、タンパク質、金属イオン、検体中に存在する可能性がありますなどを含む興味の analyte 以外のサンプルのコンポーネントです。実習では、未知の世界として同じ行列で校正サンプルの実行は困難です、複雑な生物学的または環境サンプルから不明なサンプルがあります。したがって、多くの検量線は、密接に人工脳脊髄液または人工尿など、実際のサンプルに近いが、正確ではない可能性がありますサンプル マトリックスで作られています。検量線の濃度範囲は予想される未知サンプルのブラケットを必要があります。理想的には上と下の予想される濃度サンプルのいくつかの濃度が測定されます。

多くの較正曲線が線形であり基本的な方程式 y と合うことができる = mx+b と、m は傾き、b は y 切片です。ただし、いないすべてのカーブが線形、時行を取得する軸の 1 つまたは両方のセットが対数目盛で。通常のコンピューター プログラムを使用して線形回帰が実行され、最小二乗を使用する最も一般的な方法です。線形回帰分析の決定係数と呼ばれます、R2値であります。単純な 1 つの回帰の R2は相関係数 (r) の二乗です y 値予測線からどのくらい離れてについての情報を提供しています。較正曲線のほとんどの R2値が 0.95 以上と完璧なラインは、1、R2値でしょう。校正曲線は線形、勾配は感度の測定: 濃度の変化分だけいくら信号変化します。大きな斜面を急線より高感度の測定を示します。検量線の直線範囲、線形応答を計測器に与える濃度の範囲を定義ことができます。この範囲外の応答可能性があります楽器の制約により先細りし、キャリブレーションから式は使用できません。これは、直線性の制限と呼ばれます。

検出限界は、雑音の中から統計的に定めることができる最低の量です。一般的にこれは 3 回のノイズは、信号として定義されます。検出限界は校正曲線の傾きから算出することができます、LOD=3*S.D./m、標準偏差がノイズの標準偏差として一般的に定義されています。ノイズは複数の測定値の標準偏差によって測定されます。また、1 つのトレースのベースラインの標準偏差としてノイズを推定できます。定量限界は、サンプル間で区別することができ、通常 10 倍ノイズとして定義される量です。

Procedure

1、基準を作る: シリアル希薄

  1. 標準の濃縮原液を作る。通常、化合物は、正確に計り、定量的、メスフラスコに転送されます。いくつかの溶剤を追加、サンプルが溶解するのでミックスを適切な溶媒との行に入力されます。
  2. シリアルの希薄を実行します。別のメスフラスコを取ると、希釈に必要な標準量をピペット、溶媒との行に記入し、混ぜます。だから 10 mL メスフラスコ、10 倍希釈が行われた通常、前希釈の 1 mL を追加します。
  3. 次のサンプルを作ることを希釈する前のソリューションのピペッティングより多くの希薄のため必要に応じて継続します。良い校正曲線の少なくとも 5 の濃度が必要です。

2. 校正曲線と未知のサンプルを実行します。

  1. 検量線に必要な楽器の応答を判断する紫外可視分光光度計のサンプルを実行します。
  2. 最初のサンプルに読書を取る。体系的なエラーがある場合、ランダムな順序 (すなわちない最低または最高に最低に最高) でサンプルを実行することをお勧めします。騒音の推定値を得るためにどのようなサンプルを読み 3-5 x を繰り返します。
  3. ノイズの見積もりを取得する各サンプルの測定を繰り返し、その他の標準サンプルを実行します。後でプロットするデータを記録します。
  4. 未知試料を実行します。できるだけ基準を実行するいると同様の条件として使用します。したがって、サンプル マトリックスまたはバッファーは同じにする必要があります、pH が同じである必要があります、濃度、基準の範囲で実行してください。

3. 検量線を作る

  1. スプレッドシートにデータを記録、データ対の濃度をプロットするコンピューター プログラムを使用します。少なくとも帳票の測定は、各ポイントの撮影された、誤差範囲が各ポイントの誤差を推定するこれらの測定値の標準偏差のプロットできます。いくつかの曲線のデータ行を取得するログとして軸にプロットする必要があります。方程式を検量線を支配する一般に知られている前もってログ プロットがある、ので式のログ。
  2. 較正曲線を確認します。それは線形に見えますか。それが非線型に見える部分を持っている (すなわち応答関数の制限に達しました) ですか?調べるには、ソフトウェアを使用して線形回帰するすべてのデータに適合します。(2R) の係数が高くない場合は、直線の調整を再び線形回帰を実行する表示されない先頭または曲線の終了点のいくつかを削除します。それは大きな誤差があるからといって、途中でポイントを削除する受け入れられないです。この解析から線形曲線のどの部分を決定します。
  3. 線形出力形式 y の関係式をする必要があります = mx+b と、m は傾き、b は y 切片です。勾配の単位は、この例 (図 1) 吸光度/μ M で y 軸ユニット ・濃度、です。Y 切片の単位は、y 軸の単位です。(2R) の係数が得られます。高い R2より良いフィット。完璧なフィット感を与える 1 の R2 。プログラムはまた、傾きと切片の誤差の推定値を与えることができるかもしれません。

4. 結果: 検量線 #1 青色色素の吸光度を

  1. #1 青色色素の吸光度の較正曲線 (631 で nm) (図 1) 以下の通りです。応答が線形 0 から 10 μ M. の上にその濃度信号を開始レベル オフ応答紫外可視分光光度計の線形の範囲外であります。
  2. LOD を計算します。検量線の傾きから LOD です 3*S.D (ノイズ)/m。この検量線のノイズは繰り返し測定の標準偏差を求めたし、0.021 をだった。LOD は、3*0.021/.109=0.58 μ M になります。
  3. LOQ. を計算します。LOQ です 10*S.D (ノイズ)/m。この検量線 LOQ は 10*0.021/.109 = 1.93 μ M。
  4. 未知の濃度を計算します。線路方程式を使用して、未知試料の濃度を計算します。検量線のみ未知の世界標準試料の線形の範囲に該当する場合に有効です。測定値が高すぎる、希釈が必要かもしれません。この例では、不明なスポーツド リンク希釈 1:1 であった。吸光度は 0.243、これは 2.02 μ M の濃度に対応しました。青い染料 #1 での最終的な集中したがって、スポーツの飲み物だった 4.04 μ M。

Figure 1
図 1。青色色素の紫外可視吸光度の較正曲線。左: #1 青色色素の濃度の吸光度を測定しました。吸光度が 1 以上の場合、10 μ M 後の応答が頭打ち。誤差範囲は同一試料の繰り返し測定からは、標準偏差です。右:ライン、較正曲線の直線部分を合わせて y = 0.109 * x + 0.0286。未知のデータが黒で表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

較正曲線は、検体にインストゥルメンタルの応答を理解するサンプル試料の濃度を予測するために使用されています。

検量線を作成するには、試料の既知濃度の標準液のセットを準備します。楽器の応答は、それぞれについて、測定は、標準溶液の濃度とプロットします。このプロットの直線部分は、濃度への応答を関連づけることにより、試料の試料濃度を予測に使用できます。

このビデオは標準、未知濃度の試料の分析に続いて一連の準備を示すことによって較正曲線とその使用を紹介します。

一連の標準的なソリューションは、較正曲線を準備する使用されます。これらのソリューションは、おおよそ試料濃度を含む濃度の範囲で構成されます。

標準溶液は、しばしばシリアル希釈で用意しています。シリアル希釈は、試料の貯蔵液の準備によって実行されます。原液は、既知の量、しばしば一桁薄くなります。新しいソリューションは、同じように薄くなります。濃度が桁違いに及ぶ一連のソリューションでこの結果します。

検量線は濃度と楽器の信号のプロットです。標準のプロットは線形であるべきし、フィットすることができます、方程式 y = mx+b と。これらの濃度範囲は、直線性の限界から、プロットの非直線部分を破棄しなければなりません。

最も適合する直線の方程式は、濃度に関連する計測器の信号を使用してサンプルの濃度を決定する使用できます。線形の範囲にあるために、プロットの線形の範囲外にある測定試料を希釈する必要があります。

計測器、またはノイズの統計的に決定することができます最低測定値の検出限界は、同様に検量線から計算できます。空白のサンプルを複数回測定します。検出限界は平均ブランク信号プラス 3 回標準偏差として一般的に定義されます。

最後に、定量化の限界を計算することも。数量の制限は、正確に定量化することができる試料の最低の量です。これは、空白の信号の上 10 の標準偏差として計算されます。

検量線の基礎を学んできた、準備および研究所の 1 つを使用する方法をみましょう。

まず、標準の濃縮原液を準備します。正確に標準の重さし、容積測定フラスコに転送。溶媒の少量を追加し、サンプルを溶解するのでを混ぜます。その後、溶媒との行に入力します。サンプルと同じ溶剤を使用することが重要です。

基準を準備するには、ピペット、メスフラスコに必要な量の。溶剤、行にフラスコを記入し、ミックスします。

原液から分注、希釈によって基準を続けます。良い校正曲線の少なくとも 5 の濃度が必要です。

今、サンプルを実行すると、分析機器で、この場合楽器の応答を判断するために、紫外可視分光光度計に必要な検量線。

標準的な最初の測定を取る。体系的なエラーがある場合は、ランダムな順序で基準を実行します。各標準ノイズの見積もりを取得する 3-5 x を測定します。

それぞれの測定を繰り返し、基準の残りの部分を測定します。すべてのデータを記録します。

最後に、サンプルを実行します。標準のために使用された、同じサンプル マトリックスと測定条件を使用します。サンプルが基準の範囲は、計測器の制限内にあるかどうかを確認します。

検量線を作成するのにには、濃度対信号がデータをプロットするのにコンピューター プログラムを使用します。各データ ポイントの繰り返し測定の標準偏差を使用して、誤差範囲を行います。

非線形的線形回帰を実行し、最も適合する直線を決定する、曲線の部分を削除します。出力すべきフォーム y の式 m = x + b。R2-値近い 1 良いフィット感を表します。

これは青い染料 #1, 631 で測定のための検 nm。応答は、0 と 15 mM の線形です。

最も適合する直線の方程式を使用してサンプルの濃度を計算します。サンプルの吸光度、0.141、6.02 mM の濃度に対応しました。

紫外可視分光光度計での校正曲線の使用方法を見てきた、今、いくつかの他の有用なアプリケーションを見てをみましょう。

電極の信号は、水溶液中のイオンの濃度を調整する必要がある校正曲線、よく電気化学アプリケーションで使用されます。この例では、フッ化物イオン選択性電極のデータが収集されました。

濃度データは、行を取得するログ スケールにプロットする必要があります。この検量線は、歯磨き粉や水を飲むなどのソリューションにおけるフッ化物の濃度を測定する使用ことができます。

高速液体クロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィーは、分離と分析化学で頻繁に使用されている解析手法です。高速液体クロマトグラフィー分離分子クロマトグラフィー コラムの長さを旅行するために必要な時間に基づいて混合物のコンポーネントです。今回は、分子の化学的性質の範囲によって異なります。

分子の溶出は、クロマト グラムの結果、検出器を使用して測定されます。ピーク面積は、人気のソーダ成分のこの例でような標準的なソリューションは、の範囲の簡単な検量線を用いた濃度に関連付けることができます。

どこソリューション マトリックスは、溶質の測定と干渉する、いくつかのケースで古典的な検量線が正確なすることができます。これらのケースでは、変更された検量線が用意しています。これは、標準のソリューション ボリュームの範囲はサンプルに追加されます。X 切片は元試料溶液濃度に等しい濃度のプロットに信号が作成されます。この手法の詳細については、ビデオ、「標準添加法」ゼウス科学教育を見てください。

ゼウスの較正曲線入門を見てきただけ。今検量線が使用されている、それを作成する方法とそれを使用してサンプルの濃度を計算する方法を理解する必要があります。

いつも見てくれてありがとう!

Applications and Summary

検量線は、分析化学、生化学、医薬品化学の多くの分野で使用されます。分光法、クロマトグラフィー、電気化学測定とそれらを使用するが一般的です。検量線は、土壌試料中の環境汚染物質の濃度を理解する使用ことができます。それは使用することができる神経伝達物質頭脳の液体のサンプルでは、医薬品のサンプルでビタミンや食品中のカフェインの濃度を決定します。したがって、検量線、環境、生物学、製薬、および食品科学アプリケーションで役立ちます。検量線の作成の最も重要な部分は、サンプル混合物の近似行列は、高精度の標準試料をすることです。

(図 2) 以下、電気化学校正曲線の例です。フッ化物イオン選択性電極とデータが収集されました。電気化学データに従ってネルンストの同等化 E = E0 + 2.03*R*T/(nF) * c. をログに記録したがって、濃度データ (x 軸) は、行を取得するログ スケールにプロットする必要があります。この検量線は、歯磨き粉や飲料水中のフッ化物の濃度の測定に使用できます。

Figure 2
図 2。イオン選択性電極の校正曲線。異なる濃度のフッ化物に (mV) のフッ素電極の応答をプロットします。電極応答の予想される数式です (mV) で y =-59.2 * ログ x + 25 ° c で b。実際の方程式は y =-57.4 * +56.38% x ログ。R2値が 0.998 です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

1、基準を作る: シリアル希薄

  1. 標準の濃縮原液を作る。通常、化合物は、正確に計り、定量的、メスフラスコに転送されます。いくつかの溶剤を追加、サンプルが溶解するのでミックスを適切な溶媒との行に入力されます。
  2. シリアルの希薄を実行します。別のメスフラスコを取ると、希釈に必要な標準量をピペット、溶媒との行に記入し、混ぜます。だから 10 mL メスフラスコ、10 倍希釈が行われた通常、前希釈の 1 mL を追加します。
  3. 次のサンプルを作ることを希釈する前のソリューションのピペッティングより多くの希薄のため必要に応じて継続します。良い校正曲線の少なくとも 5 の濃度が必要です。

2. 校正曲線と未知のサンプルを実行します。

  1. 検量線に必要な楽器の応答を判断する紫外可視分光光度計のサンプルを実行します。
  2. 最初のサンプルに読書を取る。体系的なエラーがある場合、ランダムな順序 (すなわちない最低または最高に最低に最高) でサンプルを実行することをお勧めします。騒音の推定値を得るためにどのようなサンプルを読み 3-5 x を繰り返します。
  3. ノイズの見積もりを取得する各サンプルの測定を繰り返し、その他の標準サンプルを実行します。後でプロットするデータを記録します。
  4. 未知試料を実行します。できるだけ基準を実行するいると同様の条件として使用します。したがって、サンプル マトリックスまたはバッファーは同じにする必要があります、pH が同じである必要があります、濃度、基準の範囲で実行してください。

3. 検量線を作る

  1. スプレッドシートにデータを記録、データ対の濃度をプロットするコンピューター プログラムを使用します。少なくとも帳票の測定は、各ポイントの撮影された、誤差範囲が各ポイントの誤差を推定するこれらの測定値の標準偏差のプロットできます。いくつかの曲線のデータ行を取得するログとして軸にプロットする必要があります。方程式を検量線を支配する一般に知られている前もってログ プロットがある、ので式のログ。
  2. 較正曲線を確認します。それは線形に見えますか。それが非線型に見える部分を持っている (すなわち応答関数の制限に達しました) ですか?調べるには、ソフトウェアを使用して線形回帰するすべてのデータに適合します。(2R) の係数が高くない場合は、直線の調整を再び線形回帰を実行する表示されない先頭または曲線の終了点のいくつかを削除します。それは大きな誤差があるからといって、途中でポイントを削除する受け入れられないです。この解析から線形曲線のどの部分を決定します。
  3. 線形出力形式 y の関係式をする必要があります = mx+b と、m は傾き、b は y 切片です。勾配の単位は、この例 (図 1) 吸光度/μ M で y 軸ユニット ・濃度、です。Y 切片の単位は、y 軸の単位です。(2R) の係数が得られます。高い R2より良いフィット。完璧なフィット感を与える 1 の R2 。プログラムはまた、傾きと切片の誤差の推定値を与えることができるかもしれません。

4. 結果: 検量線 #1 青色色素の吸光度を

  1. #1 青色色素の吸光度の較正曲線 (631 で nm) (図 1) 以下の通りです。応答が線形 0 から 10 μ M. の上にその濃度信号を開始レベル オフ応答紫外可視分光光度計の線形の範囲外であります。
  2. LOD を計算します。検量線の傾きから LOD です 3*S.D (ノイズ)/m。この検量線のノイズは繰り返し測定の標準偏差を求めたし、0.021 をだった。LOD は、3*0.021/.109=0.58 μ M になります。
  3. LOQ. を計算します。LOQ です 10*S.D (ノイズ)/m。この検量線 LOQ は 10*0.021/.109 = 1.93 μ M。
  4. 未知の濃度を計算します。線路方程式を使用して、未知試料の濃度を計算します。検量線のみ未知の世界標準試料の線形の範囲に該当する場合に有効です。測定値が高すぎる、希釈が必要かもしれません。この例では、不明なスポーツド リンク希釈 1:1 であった。吸光度は 0.243、これは 2.02 μ M の濃度に対応しました。青い染料 #1 での最終的な集中したがって、スポーツの飲み物だった 4.04 μ M。

Figure 1
図 1。青色色素の紫外可視吸光度の較正曲線。左: #1 青色色素の濃度の吸光度を測定しました。吸光度が 1 以上の場合、10 μ M 後の応答が頭打ち。誤差範囲は同一試料の繰り返し測定からは、標準偏差です。右:ライン、較正曲線の直線部分を合わせて y = 0.109 * x + 0.0286。未知のデータが黒で表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

較正曲線は、検体にインストゥルメンタルの応答を理解するサンプル試料の濃度を予測するために使用されています。

検量線を作成するには、試料の既知濃度の標準液のセットを準備します。楽器の応答は、それぞれについて、測定は、標準溶液の濃度とプロットします。このプロットの直線部分は、濃度への応答を関連づけることにより、試料の試料濃度を予測に使用できます。

このビデオは標準、未知濃度の試料の分析に続いて一連の準備を示すことによって較正曲線とその使用を紹介します。

一連の標準的なソリューションは、較正曲線を準備する使用されます。これらのソリューションは、おおよそ試料濃度を含む濃度の範囲で構成されます。

標準溶液は、しばしばシリアル希釈で用意しています。シリアル希釈は、試料の貯蔵液の準備によって実行されます。原液は、既知の量、しばしば一桁薄くなります。新しいソリューションは、同じように薄くなります。濃度が桁違いに及ぶ一連のソリューションでこの結果します。

検量線は濃度と楽器の信号のプロットです。標準のプロットは線形であるべきし、フィットすることができます、方程式 y = mx+b と。これらの濃度範囲は、直線性の限界から、プロットの非直線部分を破棄しなければなりません。

最も適合する直線の方程式は、濃度に関連する計測器の信号を使用してサンプルの濃度を決定する使用できます。線形の範囲にあるために、プロットの線形の範囲外にある測定試料を希釈する必要があります。

計測器、またはノイズの統計的に決定することができます最低測定値の検出限界は、同様に検量線から計算できます。空白のサンプルを複数回測定します。検出限界は平均ブランク信号プラス 3 回標準偏差として一般的に定義されます。

最後に、定量化の限界を計算することも。数量の制限は、正確に定量化することができる試料の最低の量です。これは、空白の信号の上 10 の標準偏差として計算されます。

検量線の基礎を学んできた、準備および研究所の 1 つを使用する方法をみましょう。

まず、標準の濃縮原液を準備します。正確に標準の重さし、容積測定フラスコに転送。溶媒の少量を追加し、サンプルを溶解するのでを混ぜます。その後、溶媒との行に入力します。サンプルと同じ溶剤を使用することが重要です。

基準を準備するには、ピペット、メスフラスコに必要な量の。溶剤、行にフラスコを記入し、ミックスします。

原液から分注、希釈によって基準を続けます。良い校正曲線の少なくとも 5 の濃度が必要です。

今、サンプルを実行すると、分析機器で、この場合楽器の応答を判断するために、紫外可視分光光度計に必要な検量線。

標準的な最初の測定を取る。体系的なエラーがある場合は、ランダムな順序で基準を実行します。各標準ノイズの見積もりを取得する 3-5 x を測定します。

それぞれの測定を繰り返し、基準の残りの部分を測定します。すべてのデータを記録します。

最後に、サンプルを実行します。標準のために使用された、同じサンプル マトリックスと測定条件を使用します。サンプルが基準の範囲は、計測器の制限内にあるかどうかを確認します。

検量線を作成するのにには、濃度対信号がデータをプロットするのにコンピューター プログラムを使用します。各データ ポイントの繰り返し測定の標準偏差を使用して、誤差範囲を行います。

非線形的線形回帰を実行し、最も適合する直線を決定する、曲線の部分を削除します。出力すべきフォーム y の式 m = x + b。R2-値近い 1 良いフィット感を表します。

これは青い染料 #1, 631 で測定のための検 nm。応答は、0 と 15 mM の線形です。

最も適合する直線の方程式を使用してサンプルの濃度を計算します。サンプルの吸光度、0.141、6.02 mM の濃度に対応しました。

紫外可視分光光度計での校正曲線の使用方法を見てきた、今、いくつかの他の有用なアプリケーションを見てをみましょう。

電極の信号は、水溶液中のイオンの濃度を調整する必要がある校正曲線、よく電気化学アプリケーションで使用されます。この例では、フッ化物イオン選択性電極のデータが収集されました。

濃度データは、行を取得するログ スケールにプロットする必要があります。この検量線は、歯磨き粉や水を飲むなどのソリューションにおけるフッ化物の濃度を測定する使用ことができます。

高速液体クロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィーは、分離と分析化学で頻繁に使用されている解析手法です。高速液体クロマトグラフィー分離分子クロマトグラフィー コラムの長さを旅行するために必要な時間に基づいて混合物のコンポーネントです。今回は、分子の化学的性質の範囲によって異なります。

分子の溶出は、クロマト グラムの結果、検出器を使用して測定されます。ピーク面積は、人気のソーダ成分のこの例でような標準的なソリューションは、の範囲の簡単な検量線を用いた濃度に関連付けることができます。

どこソリューション マトリックスは、溶質の測定と干渉する、いくつかのケースで古典的な検量線が正確なすることができます。これらのケースでは、変更された検量線が用意しています。これは、標準のソリューション ボリュームの範囲はサンプルに追加されます。X 切片は元試料溶液濃度に等しい濃度のプロットに信号が作成されます。この手法の詳細については、ビデオ、「標準添加法」ゼウス科学教育を見てください。

ゼウスの較正曲線入門を見てきただけ。今検量線が使用されている、それを作成する方法とそれを使用してサンプルの濃度を計算する方法を理解する必要があります。

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