Kalibrierkurven

Analytical Chemistry

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Overview

Quelle: Labor von Dr. B. Jill Venton - University of Virginia

Kalibrierkurven werden verwendet, um die instrumentelle Reaktion auf eines Analyten zu verstehen und vorherzusagen, die Konzentration in einer unbekannten Probe. In der Regel eine Reihe von standard-Proben sind in verschiedenen Konzentrationen mit einer Reihe gemacht, als unbekannte Sehenswürdigkeiten beinhaltet und die instrumentelle Reaktion bei jeder Konzentration wird aufgezeichnet. Für mehr Genauigkeit und den Fehler zu verstehen kann die Reaktion bei jeder Konzentration wiederholt werden, so eine Fehler Bar erreicht wird. Die Daten werden dann mit einer Funktion passen, so dass unbekannte Konzentrationen vorausgesagt werden können. In der Regel die Antwort ist linear, jedoch eine Kurve kann mit anderen Funktionen gemacht werden, solange die Funktion bekannt ist. Die Eichkurve kann verwendet werden, zur Berechnung der Nachweisgrenze und Begrenzung der Quantifizierung.

Wenn Sie Lösungen für eine Eichkurve, kann jede Lösung separat erfolgen. Jedoch kann das eine Menge des Ausgangsmaterials und zeitaufwendig sein. Eine weitere Methode zur Herstellung von vielen verschiedener Konzentrationen einer Lösung soll serielle Verdünnungen verwenden. Eine konzentrierte Probe verdünnt mit Verdünnungsreihen unten in gewissem Sinne schrittweise niedrigere Konzentrationen zu machen. Das nächste Beispiel besteht aus den vorherigen Verdünnung und der Verdünnungsfaktor oft konstant gehalten. Der Vorteil ist, dass nur eine erste Lösung erforderlich ist. Der Nachteil ist, dass etwaige Fehler in der Lösung machen — pipettieren, massing, etc. – erhalten propagiert, da weitere Lösungen hergestellt werden. Daher muss darauf geachtet werden, wenn die erste Lösung zu machen.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Grundlagen der analytischen Chemie. Kalibrierkurven. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Principles

Kalibrierkurven lässt sich die Konzentration von einer unbekannten Probe vorherzusagen. Um ganz genau zu sein, sollte das Standardmuster in der gleichen Matrix als der unbekannten Probe ausgeführt werden. Eine Probenmatrix ist die Bestandteile der Probe außer der Analyten von Interesse, einschließlich des Lösungsmittels und alle Salze, Proteine, Metall-Ionen, etc., die in der Probe vorhanden sein könnten. In der Praxis ist die Kalibrierung Proben in der gleichen Matrix als ungewisse laufen manchmal schwierig, da der unbekannte Probe aus einer komplexen biologischer oder ökologischer sein kann. So sind viele Kalibrierungskurven in einer Probenmatrix gemacht, die eng nähert sich die echte Probe, z.B. künstliche zerebralen spinalen Flüssigkeit oder künstliche Urin, aber möglicherweise nicht genau sein. Konzentrationen der Standardkurve sollten, die in der erwarteten unbekannten Probe Halterung. Im Idealfall werden ein paar Konzentrationen oberhalb und unterhalb der erwarteten Konzentration Probe gemessen.

Viele Kalibrierkurven sind linear und passen mit der Gleichung y = Mx + b, wo m ist die Steigung und b der y-Achsenabschnitt. Jedoch nicht alle Kurven sind linear und manchmal um eine Linie zu bekommen, eine oder beide Achsen wird festgelegt auf einer logarithmischen Skala. Linearer Regression erfolgt in der Regel mit Hilfe eines Computerprogramms und die am häufigsten verwendete Methode ist, einen kleinsten Quadrate passend zu verwenden. Mit einer linearen Regressionsanalyse ist ein R-Wert2 , genannt der Bestimmungskoeffizient, gegeben. Für eine einfache einzelne Regression R2 ist das Quadrat des Korrelationskoeffizienten (R) und enthält Informationen darüber, wie weit die y-Werte von der vorhergesagten Linie sind. Eine perfekte Linie hätte einen R-2 -Wert von 1, und die meisten R2 Werte für Kalibrierkurven sind über 0,95. Wenn die Eichkurve linear ist, die Steigung ist ein Maß für die Empfindlichkeit: wieviel das Signal für eine Änderung der Konzentration ändert. Eine steilere Linie mit einer größeren Neigung zeigt eine empfindlichere Messung. Eine Eichkurve kann auch helfen den linearen Bereich, Konzentrationen festlegen, dass das Gerät eine lineare Antwort gibt. Außerhalb dieses Bereichs die Antwort kann verjüngen sich instrumentellen Gesichtspunkten und die Gleichung von der Kalibrierung kann nicht verwendet werden. Dieses bekannt als die Grenze der Linearität.

Nachweisgrenze ist der niedrigste Betrag, der vom Lärm statistisch ermittelt werden kann. In der Regel wird dies als Signal definiert, 3 Mal das Geräusch ist. Der Nachweisgrenze kann von der Piste die Kalibrierkurve berechnet und ist in der Regel definiert als LOD=3*S.D./m, wo S.D. die Standardabweichung des Rauschens ist. Der Lärm wird gemessen, indem man die Standardabweichung der Mehrfachmessung. Alternativ kann in einer Ablaufverfolgung, Lärm als die Standardabweichung der Baseline geschätzt werden. Die Grenze der Quantifizierung ist die Menge, die differenzieren zwischen Proben und ist in der Regel definiert als 10-Mal das Geräusch.

Procedure

1. machen die Standards: Verdünnungsreihen

  1. Machen Sie eine konzentrierte Stammlösung der Norm. Das Mittel ist in der Regel genau abgewogen, und dann quantitativ in einem volumetrischen Kolben übertragen. Fügen Sie einige Lösungsmittel hinzu, mischen Sie, so dass die Probe auflöst, dann füllen Sie in die Zeile mit dem entsprechenden Lösungsmittel.
  2. Durchführen Sie Verdünnungsreihen. Nehmen eine andere volumetrischen Kolben und pipette die Höhe der Standard für die Verdünnung benötigt dann füllen Sie in die Zeile mit Lösungsmittel und mischen. Eine zehnfache Verdünnung ist in der Regel gemacht, also für eine volumetrische 10 mL-Flasche, 1 mL der vorherigen Verdünnung zugeben.
  3. Weiterhin Bedarf für weitere Verdünnungen, Pipettieren von der vorherigen Lösung um es zu machen, die nächste Probe verdünnen. Für eine gute Kalibrationskurve werden mindestens 5 Konzentrationen benötigt.

2. führen Sie die Proben für die Eichkurve und das unbekannte

  1. Laufen Sie die Proben mit der UV-Vis Spektralphotometer, die instrumentelle Reaktion benötigt für die Eichkurve zu bestimmen.
  2. Den Meßwert mit der ersten Probe. Es ist eine gute Idee, die Proben in zufälliger Reihenfolge (d. h. nicht höchsten bis zur niedrigsten zum höchsten oder niedrigsten) laufen, für den Fall, dass systematische Fehler vorliegen. Um eine Schätzung des Rauschens zu erhalten, wiederholen Sie der Lesung zu jeder Probe 3 – 5 X.
  3. Die zusätzliche standard Proben, Wiederholung der Messungen für jede Probe eine Schätzung der Lärm zu laufen. Notieren Sie die Daten später zu einem Grundstück.
  4. Führen Sie die unbekannten Proben. Verwenden Sie als ähnliche Bedingungen zu den Standards wie möglich laufen. So, die Probenmatrix oder Puffer sollte identisch sein, der pH-Wert sollte identisch sein und die Konzentration sollte im Bereich der Normen ausgeführt werden.

3. machen die Kalibrierkurve

  1. Erfassen Sie die Daten in eine Tabelle und verwenden Sie ein Computerprogramm, um die Daten gegen Konzentration zeichnen. Wenn mindestens dreifacher Messungen für jeden Punkt aufgenommen wurden, können Fehlerindikatoren der Standardabweichung dieser Messungen, die Fehler der einzelnen Punkte zu schätzen geplottet werden. Für einige Kurven müssen die Daten mit einer Achse als ein Protokoll zu einer Linie dargestellt werden. Die Gleichung, die die Eichkurve regelt ist im Allgemeinen vor der Zeit, bekannt ein Log-Plot verwendet wird, wenn es gibt ein Protokoll in der Gleichung.
  2. Die Eichkurve zu untersuchen. Sieht es linear? Es muss einen Teil, der nicht-linearen sieht (d. h. erreicht die Grenze der instrumentalen Antwort)? Um zu überprüfen, passen alle Daten, um eine lineare Regression mit der Software. Wenn der Bestimmungskoeffizient (R2) nicht hoch ist, entfernen Sie einige der Punkte am Anfang oder Ende der Kurve, die nicht angezeigt werden, passen die Linie und die lineare Regression wieder durchführen. Es geht nicht um Punkte in der Mitte zu entfernen, nur weil sie eine großen Fehler-Bar. Entscheiden Sie aus dieser Analyse, welcher Teil der Kurve linear ist.
  3. Die Ausgabe des linearen sollte eine Gleichung für die Format-y = Mx + b, wo m ist die Steigung und b der y-Achsenabschnitt. Die Einheiten für die Neigung sind die y-Achse Einheit/Konzentration, in diesem Beispiel (Abbildung 1) Absorption/μM. Für den y-Achsenabschnitt werden die y-Achse Einheiten. Es ergibt sich ein Bestimmungskoeffizient (R2). Je höher die R2 je besser die Passform; eine perfekte Passform verleiht ein R2 1. Das Programm kann auch eine Schätzung des Fehlers auf die Piste und das Abfangen können.

4. Ergebnisse: Kalibrierkurve des Absorption des blauen Farbstoff #1

  1. Die Eichkurve für Absorption des blauen Farbstoff #1 (bei 631 nm) wird unten (Abbildung 1) angezeigt. Die Antwort ist linear von 0 bis 10 µM. oben, dass Konzentration das Signal auf Stufe beginnt ab weil die Antwort aus den linearen Bereich der UV-Vis Spektralphotometer ist.
  2. Berechnen Sie die LOD. Von der Piste die Eichkurve, die Detailgenauigkeit ist 3*S.D. (Lärm) / m. Für diese Eichkurve der Lärm wurde erreicht, indem man eine Standardabweichung von wiederholten Messungen und 0,021 war. Das LOD wäre 3*0.021/.109=0.58 µM.
  3. Berechnung der LOQ. Das LOQ ist 10*S.D. (Lärm) / m. Für diese Eichkurve LOQ ist 10*0.021/.109 = 1,93 µM.
  4. Berechnen Sie die Konzentration des unbekannten. Verwenden Sie die Gleichung der Linie um die Konzentration der unbekannten Probe zu berechnen. Die Eichkurve gilt nur, wenn das unbekannte in den linearen Bereich der Standardproben fällt. Wenn die Messwerte zu hoch sind, kann die Verdünnung erforderlich sein. In diesem Beispiel wurde die unbekannte Sportgetränk 1:1 verdünnt. Die Extinktion war 0,243 und dies entspricht einer Konzentration von 2,02 µM. Damit die Endkonzentration von blauer Farbstoff #1 in der in der Sport-Getränk war 4,04 µM.

Figure 1
Abbildung 1: Kalibrierkurven für UV-Vis Absorption des blauen Farbstoff. Links: die Absorption der verschiedenen Konzentrationen von blauen Farbstoff #1 gemessen wurde. Die Antworten einpendeln nach 10 µM bei die Extinktion über 1. Die Fehlerbalken sind durch wiederholte Messungen der gleichen Probe und Standardabweichungen. Recht: Die lineare Teil der Kalibrierkurve ist mit einer Linie fit y = 0.109 * X + 0,0286. Unbekannten Daten werden in schwarz angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Kalibrierkurven dienen dazu, die instrumentelle Reaktion auf eines Analyten zu verstehen und vorherzusagen die Konzentration des Analyten in einer Probe.

Eine Kalibrierkurve entsteht durch die erste Vorbereitung eine Reihe von standard-Lösungen mit bekannten Konzentrationen des Analyten. Die Instrument Reaktion ist für jede gemessen und geplottet vs. Konzentration der Standardlösung. Der lineare Teil dieses Grundstück kann dann verwendet werden, die Konzentration einer Probe des Analyten, vorherzusagen, indem Sie seine Reaktion auf Konzentration korrelieren.

Dieses Video führt Kalibrierkurven und deren Verwendung durch den Nachweis der Vorbereitung einer Reihe von Normen, gefolgt von der Analyse einer Probe mit unbekannter Konzentration.

Eine Reihe von standard-Lösungen wird verwendet, um die Eichkurve vorbereiten. Diese Lösungen bestehen aus einer Reihe von Konzentrationen, die die ungefähre Konzentration des Analyten zu umfassen.

Standardlösungen sind oft mit einer seriellen Verdünnung bereit. Eine serielle Verdünnung erfolgt durch die erste Vorbereitung eine Stammlösung des Analyten. Die Stammlösung wird dann durch eine bekannte Menge, oft eine Größenordnung verdünnt. Die neue Lösung wird dann in der gleichen Weise und So weiter verdünnt. Dies führt zu einer Reihe von Lösungen mit Konzentrationen über mehrere Größenordnungen bis hin.

Die Kalibrierkurve ist ein Grundstück der instrumentale Signal vs. Konzentration. Die Handlung der Standards sollte linear sein und Fit sein kann mit der Gleichung y = Mx + b. Die nichtlineare Teile der Handlung sollte verworfen werden, da diese Konzentrationsbereiche aus die Grenze der Linearität sind.

Die Gleichung der Best-fit-Linie kann dann verwendet werden, um die Konzentration der Probe bestimmen mithilfe der Instrument-Signal zu Konzentration korrelieren. Proben mit Messungen, die außerhalb des linearen Bereichs des Grundstücks liegen müssen verdünnt werden, um im linearen Bereich sein.

Der Nachweisgrenze des Gerätes oder die niedrigste Messung, die statistisch kann, über den Lärm ermittelt werden, kann aus der Eichkurve sowie berechnet werden. Eine leere Probe wird mehrfach gemessen. Der Nachweisgrenze wird allgemein als das durchschnittliche leer Signal plus 3 Mal seine Standardabweichung definiert.

Schließlich kann auch die Grenze der Quantifizierung berechnet werden. Die Grenze der Quantifizierung ist die niedrigste Menge des Analyten, die präzise quantifiziert werden kann. Dies errechnet sich aus 10 Standardabweichungen über dem leeren Signal.

Nun, da Sie die Grundlagen einer Kalibrationskurve gelernt, mal sehen, wie vorbereiten und verwenden Sie eine im Labor.

Bereiten Sie zuerst, eine konzentrierte Stammlösung der Norm. Genau wiegen Sie die Norm, und in einem volumetrischen Kolben übertragen. Fügen Sie eine kleine Menge des Lösungsmittels und vermischen Sie, damit die Probe auflöst. Füllen Sie in die Zeile mit Lösungsmittel. Es ist wichtig, die gleichen Lösungsmittel wie die Probe verwenden.

Um die Standards vorzubereiten, pipette die erforderliche Menge in der volumetrischen Kolben. Dann füllen Sie die Flasche in die Zeile mit Lösungsmittel und mischen.

Weiterhin die Standards aus der Stammlösung pipettieren und verdünnen. Für eine gute Kalibrationskurve werden mindestens 5 Konzentrationen benötigt.

Nun benötigt Proben laufen mit dem analytischen Instrument, in diesem Fall eine UV-Vis Spektralphotometer, um festzustellen, die instrumentale Antwort für die Eichkurve.

Nehmen Sie die Messung der ersten standard. Führen Sie die Standards in zufälliger Reihenfolge, für den Fall, dass systematische Fehler vorliegen. Messen Sie jeden Standard 3 – 5 X um eine Schätzung des Rauschens zu erhalten.

Messen Sie den Rest der Normen, die Messungen für jede Wiederholung. Alle Daten werden erfasst.

Schließlich führen Sie das Beispiel. Verwenden Sie die gleiche Probe Matrix und Messung Bedingungen wie für die Standards verwendet wurden. Stellen Sie sicher, dass die Probe im Bereich der Normen und die Grenze des Instruments ist.

Um die Eichkurve zu konstruieren, verwenden Sie ein Computerprogramm, um die Daten als Signal vs. Konzentration zu zeichnen. Verwenden Sie die Standardabweichung der wiederholten Messungen für jeden Datenpunkt Fehlerindikatoren zu machen.

Teile der Kurve, die sind nichtlinear, dann führen Sie eine lineare Regression und ermitteln die optimale Linie zu entfernen. Die Ausgabe sollte eine Gleichung in der Form y = m X + b. Eine R-2-Wert in der Nähe von 1 kennzeichnet eine gute Passform.

Dies ist die Eichkurve für blauen Farbstoff #1, gemessen am 631 nm. Die Antwort ist linear von 0 bis 15 mM.

Berechnen Sie die Konzentration der Probe unter Verwendung der Gleichung der Best-fit-Linie. Die Absorption der Probe war 0.141, und eine Konzentration von 6,02 mM entsprach.

Nun, da Sie gesehen haben, wie eine Eichkurve mit einem UV-Vis Spektralphotometer verwendet werden kann, werfen wir einen Blick auf einige andere nützlichen Anwendungen.

Kalibrierkurven sind oft mit Elektrochemie Anwendungen verwendet, da die Elektrode-Signal auf die Konzentration der Ionen in der Lösung kalibriert werden muss. In diesem Beispiel wurden die Daten für eine ionenselektive Elektrode für Fluorid erhoben.

Auf der logarithmischen Skala, eine Linie zu erhalten müssen die Konzentrationsdaten geplottet werden. Diese Eichkurve kann zur Messung der Konzentration von Fluorid in einer Lösung, wie Zahnpasta oder Trinkwasser verwendet werden.

Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie oder HPLC, ist eine Trennung und Analysetechnik, die in der analytischen Chemie zu stark ausgelastet ist. HPLC trennt Bestandteile einer Mischung basierend auf den Zeitaufwand für die Moleküle, die Länge der Chromatographie Spalte zu reisen. Diese Zeit variiert je nach eine Reihe von chemischen Eigenschaften der Moleküle.

Die Elution der Moleküle wird mit einem Detektor, wodurch ein Chromatogramm gemessen. Die Peakfläche kann mithilfe einer einfachen Kalibrierungskurve eine Reihe von standard-Lösungen, wie in diesem Beispiel der beliebten Soda Zutaten Konzentration korreliert werden.

In einigen Fällen, wo die Lösungsmatrix die Messung des gelösten Stoffes stört, kann eine klassische Kalibrationskurve ungenau sein. In diesen Fällen ist eine modifizierte Kalibrationskurve bereit. Hierzu wird eine Reihe von standard-Lösung Volumen der Probe hinzugefügt. Das Signal für Konzentration Handlung entsteht, wobei X Abfangen der ursprünglichen Konzentration der Probenlösung entspricht. Schauen Sie für weitere Einzelheiten über diese Technik der Wissenschaftsbildung JoVE video, "die Methode der standard Addition".

Sie habe nur Jupiters Einführung in die Eichkurve beobachtet. Sie sollten jetzt verstehen, wo die Eichkurve verwendet wird, wie man es schaffen und wie Sie es verwenden, um die Konzentration der Proben zu berechnen.

Wie immer vielen Dank für das ansehen!

Applications and Summary

Kalibrierkurven sind in vielen Bereichen der analytischen Chemie, Biochemie und pharmazeutische Chemie eingesetzt. Es ist üblich, sie mit Spektroskopie, Chromatographie und Elektrochemie Messungen verwenden. Eine Eichkurve kann verwendet werden, um die Konzentration einer Umweltbelastung in einer Bodenprobe zu verstehen. Es kann verwendet werden, bestimmen die Konzentration der Neurotransmitter in einer Stichprobe von Gehirn Flüssigkeit, Vitamin in pharmazeutische Proben oder Koffein in Essen. Somit eignen sich Kalibrierungskurven in Umwelt-, Bio-, Pharma- und Lebensmittelindustrie-Science-Anwendungen. Der wichtigste Teil der Herstellung einer Kalibrationskurve ist, genaue standard Proben zu bilden, die in einer Matrix, die die Probe Mischung am nächsten kommt.

Ein Beispiel für eine Eichkurve Elektrochemie ist unten (Abbildung 2). Die Daten wurden mit einer ionenselektive Elektrode für Fluorid gesammelt. Elektrochemische Daten folgen die Nernst-Gleichung E = E0 + 2.03*R*T/(nF) * log C. So müssen die Konzentrationsdaten (x-Achse) auf einer logarithmischen Skala, eine Linie zu erhalten geplottet werden. Diese Eichkurve kann zur Messung der Konzentration von Fluorid in Zahnpasta oder Trinkwasser verwendet werden.

Figure 2
Abbildung 2: Eichkurve für eine ionenselektive Elektrode. Die Reaktion einer selektiven Fluorid-Elektrode (in mV) auf verschiedenen Konzentrationen von Fluorid aufgetragen. Die erwarteten Gleichung für die Reaktion der Elektrode ist y (in mV) =-59,2 * Log X + b bei 25 ° C. Die eigentliche Gleichung lautet y =-57,4 * Log x +56.38. Der R-2 -Wert ist 0.998. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

1. machen die Standards: Verdünnungsreihen

  1. Machen Sie eine konzentrierte Stammlösung der Norm. Das Mittel ist in der Regel genau abgewogen, und dann quantitativ in einem volumetrischen Kolben übertragen. Fügen Sie einige Lösungsmittel hinzu, mischen Sie, so dass die Probe auflöst, dann füllen Sie in die Zeile mit dem entsprechenden Lösungsmittel.
  2. Durchführen Sie Verdünnungsreihen. Nehmen eine andere volumetrischen Kolben und pipette die Höhe der Standard für die Verdünnung benötigt dann füllen Sie in die Zeile mit Lösungsmittel und mischen. Eine zehnfache Verdünnung ist in der Regel gemacht, also für eine volumetrische 10 mL-Flasche, 1 mL der vorherigen Verdünnung zugeben.
  3. Weiterhin Bedarf für weitere Verdünnungen, Pipettieren von der vorherigen Lösung um es zu machen, die nächste Probe verdünnen. Für eine gute Kalibrationskurve werden mindestens 5 Konzentrationen benötigt.

2. führen Sie die Proben für die Eichkurve und das unbekannte

  1. Laufen Sie die Proben mit der UV-Vis Spektralphotometer, die instrumentelle Reaktion benötigt für die Eichkurve zu bestimmen.
  2. Den Meßwert mit der ersten Probe. Es ist eine gute Idee, die Proben in zufälliger Reihenfolge (d. h. nicht höchsten bis zur niedrigsten zum höchsten oder niedrigsten) laufen, für den Fall, dass systematische Fehler vorliegen. Um eine Schätzung des Rauschens zu erhalten, wiederholen Sie der Lesung zu jeder Probe 3 – 5 X.
  3. Die zusätzliche standard Proben, Wiederholung der Messungen für jede Probe eine Schätzung der Lärm zu laufen. Notieren Sie die Daten später zu einem Grundstück.
  4. Führen Sie die unbekannten Proben. Verwenden Sie als ähnliche Bedingungen zu den Standards wie möglich laufen. So, die Probenmatrix oder Puffer sollte identisch sein, der pH-Wert sollte identisch sein und die Konzentration sollte im Bereich der Normen ausgeführt werden.

3. machen die Kalibrierkurve

  1. Erfassen Sie die Daten in eine Tabelle und verwenden Sie ein Computerprogramm, um die Daten gegen Konzentration zeichnen. Wenn mindestens dreifacher Messungen für jeden Punkt aufgenommen wurden, können Fehlerindikatoren der Standardabweichung dieser Messungen, die Fehler der einzelnen Punkte zu schätzen geplottet werden. Für einige Kurven müssen die Daten mit einer Achse als ein Protokoll zu einer Linie dargestellt werden. Die Gleichung, die die Eichkurve regelt ist im Allgemeinen vor der Zeit, bekannt ein Log-Plot verwendet wird, wenn es gibt ein Protokoll in der Gleichung.
  2. Die Eichkurve zu untersuchen. Sieht es linear? Es muss einen Teil, der nicht-linearen sieht (d. h. erreicht die Grenze der instrumentalen Antwort)? Um zu überprüfen, passen alle Daten, um eine lineare Regression mit der Software. Wenn der Bestimmungskoeffizient (R2) nicht hoch ist, entfernen Sie einige der Punkte am Anfang oder Ende der Kurve, die nicht angezeigt werden, passen die Linie und die lineare Regression wieder durchführen. Es geht nicht um Punkte in der Mitte zu entfernen, nur weil sie eine großen Fehler-Bar. Entscheiden Sie aus dieser Analyse, welcher Teil der Kurve linear ist.
  3. Die Ausgabe des linearen sollte eine Gleichung für die Format-y = Mx + b, wo m ist die Steigung und b der y-Achsenabschnitt. Die Einheiten für die Neigung sind die y-Achse Einheit/Konzentration, in diesem Beispiel (Abbildung 1) Absorption/μM. Für den y-Achsenabschnitt werden die y-Achse Einheiten. Es ergibt sich ein Bestimmungskoeffizient (R2). Je höher die R2 je besser die Passform; eine perfekte Passform verleiht ein R2 1. Das Programm kann auch eine Schätzung des Fehlers auf die Piste und das Abfangen können.

4. Ergebnisse: Kalibrierkurve des Absorption des blauen Farbstoff #1

  1. Die Eichkurve für Absorption des blauen Farbstoff #1 (bei 631 nm) wird unten (Abbildung 1) angezeigt. Die Antwort ist linear von 0 bis 10 µM. oben, dass Konzentration das Signal auf Stufe beginnt ab weil die Antwort aus den linearen Bereich der UV-Vis Spektralphotometer ist.
  2. Berechnen Sie die LOD. Von der Piste die Eichkurve, die Detailgenauigkeit ist 3*S.D. (Lärm) / m. Für diese Eichkurve der Lärm wurde erreicht, indem man eine Standardabweichung von wiederholten Messungen und 0,021 war. Das LOD wäre 3*0.021/.109=0.58 µM.
  3. Berechnung der LOQ. Das LOQ ist 10*S.D. (Lärm) / m. Für diese Eichkurve LOQ ist 10*0.021/.109 = 1,93 µM.
  4. Berechnen Sie die Konzentration des unbekannten. Verwenden Sie die Gleichung der Linie um die Konzentration der unbekannten Probe zu berechnen. Die Eichkurve gilt nur, wenn das unbekannte in den linearen Bereich der Standardproben fällt. Wenn die Messwerte zu hoch sind, kann die Verdünnung erforderlich sein. In diesem Beispiel wurde die unbekannte Sportgetränk 1:1 verdünnt. Die Extinktion war 0,243 und dies entspricht einer Konzentration von 2,02 µM. Damit die Endkonzentration von blauer Farbstoff #1 in der in der Sport-Getränk war 4,04 µM.

Figure 1
Abbildung 1: Kalibrierkurven für UV-Vis Absorption des blauen Farbstoff. Links: die Absorption der verschiedenen Konzentrationen von blauen Farbstoff #1 gemessen wurde. Die Antworten einpendeln nach 10 µM bei die Extinktion über 1. Die Fehlerbalken sind durch wiederholte Messungen der gleichen Probe und Standardabweichungen. Recht: Die lineare Teil der Kalibrierkurve ist mit einer Linie fit y = 0.109 * X + 0,0286. Unbekannten Daten werden in schwarz angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Kalibrierkurven dienen dazu, die instrumentelle Reaktion auf eines Analyten zu verstehen und vorherzusagen die Konzentration des Analyten in einer Probe.

Eine Kalibrierkurve entsteht durch die erste Vorbereitung eine Reihe von standard-Lösungen mit bekannten Konzentrationen des Analyten. Die Instrument Reaktion ist für jede gemessen und geplottet vs. Konzentration der Standardlösung. Der lineare Teil dieses Grundstück kann dann verwendet werden, die Konzentration einer Probe des Analyten, vorherzusagen, indem Sie seine Reaktion auf Konzentration korrelieren.

Dieses Video führt Kalibrierkurven und deren Verwendung durch den Nachweis der Vorbereitung einer Reihe von Normen, gefolgt von der Analyse einer Probe mit unbekannter Konzentration.

Eine Reihe von standard-Lösungen wird verwendet, um die Eichkurve vorbereiten. Diese Lösungen bestehen aus einer Reihe von Konzentrationen, die die ungefähre Konzentration des Analyten zu umfassen.

Standardlösungen sind oft mit einer seriellen Verdünnung bereit. Eine serielle Verdünnung erfolgt durch die erste Vorbereitung eine Stammlösung des Analyten. Die Stammlösung wird dann durch eine bekannte Menge, oft eine Größenordnung verdünnt. Die neue Lösung wird dann in der gleichen Weise und So weiter verdünnt. Dies führt zu einer Reihe von Lösungen mit Konzentrationen über mehrere Größenordnungen bis hin.

Die Kalibrierkurve ist ein Grundstück der instrumentale Signal vs. Konzentration. Die Handlung der Standards sollte linear sein und Fit sein kann mit der Gleichung y = Mx + b. Die nichtlineare Teile der Handlung sollte verworfen werden, da diese Konzentrationsbereiche aus die Grenze der Linearität sind.

Die Gleichung der Best-fit-Linie kann dann verwendet werden, um die Konzentration der Probe bestimmen mithilfe der Instrument-Signal zu Konzentration korrelieren. Proben mit Messungen, die außerhalb des linearen Bereichs des Grundstücks liegen müssen verdünnt werden, um im linearen Bereich sein.

Der Nachweisgrenze des Gerätes oder die niedrigste Messung, die statistisch kann, über den Lärm ermittelt werden, kann aus der Eichkurve sowie berechnet werden. Eine leere Probe wird mehrfach gemessen. Der Nachweisgrenze wird allgemein als das durchschnittliche leer Signal plus 3 Mal seine Standardabweichung definiert.

Schließlich kann auch die Grenze der Quantifizierung berechnet werden. Die Grenze der Quantifizierung ist die niedrigste Menge des Analyten, die präzise quantifiziert werden kann. Dies errechnet sich aus 10 Standardabweichungen über dem leeren Signal.

Nun, da Sie die Grundlagen einer Kalibrationskurve gelernt, mal sehen, wie vorbereiten und verwenden Sie eine im Labor.

Bereiten Sie zuerst, eine konzentrierte Stammlösung der Norm. Genau wiegen Sie die Norm, und in einem volumetrischen Kolben übertragen. Fügen Sie eine kleine Menge des Lösungsmittels und vermischen Sie, damit die Probe auflöst. Füllen Sie in die Zeile mit Lösungsmittel. Es ist wichtig, die gleichen Lösungsmittel wie die Probe verwenden.

Um die Standards vorzubereiten, pipette die erforderliche Menge in der volumetrischen Kolben. Dann füllen Sie die Flasche in die Zeile mit Lösungsmittel und mischen.

Weiterhin die Standards aus der Stammlösung pipettieren und verdünnen. Für eine gute Kalibrationskurve werden mindestens 5 Konzentrationen benötigt.

Nun benötigt Proben laufen mit dem analytischen Instrument, in diesem Fall eine UV-Vis Spektralphotometer, um festzustellen, die instrumentale Antwort für die Eichkurve.

Nehmen Sie die Messung der ersten standard. Führen Sie die Standards in zufälliger Reihenfolge, für den Fall, dass systematische Fehler vorliegen. Messen Sie jeden Standard 3 – 5 X um eine Schätzung des Rauschens zu erhalten.

Messen Sie den Rest der Normen, die Messungen für jede Wiederholung. Alle Daten werden erfasst.

Schließlich führen Sie das Beispiel. Verwenden Sie die gleiche Probe Matrix und Messung Bedingungen wie für die Standards verwendet wurden. Stellen Sie sicher, dass die Probe im Bereich der Normen und die Grenze des Instruments ist.

Um die Eichkurve zu konstruieren, verwenden Sie ein Computerprogramm, um die Daten als Signal vs. Konzentration zu zeichnen. Verwenden Sie die Standardabweichung der wiederholten Messungen für jeden Datenpunkt Fehlerindikatoren zu machen.

Teile der Kurve, die sind nichtlinear, dann führen Sie eine lineare Regression und ermitteln die optimale Linie zu entfernen. Die Ausgabe sollte eine Gleichung in der Form y = m X + b. Eine R-2-Wert in der Nähe von 1 kennzeichnet eine gute Passform.

Dies ist die Eichkurve für blauen Farbstoff #1, gemessen am 631 nm. Die Antwort ist linear von 0 bis 15 mM.

Berechnen Sie die Konzentration der Probe unter Verwendung der Gleichung der Best-fit-Linie. Die Absorption der Probe war 0.141, und eine Konzentration von 6,02 mM entsprach.

Nun, da Sie gesehen haben, wie eine Eichkurve mit einem UV-Vis Spektralphotometer verwendet werden kann, werfen wir einen Blick auf einige andere nützlichen Anwendungen.

Kalibrierkurven sind oft mit Elektrochemie Anwendungen verwendet, da die Elektrode-Signal auf die Konzentration der Ionen in der Lösung kalibriert werden muss. In diesem Beispiel wurden die Daten für eine ionenselektive Elektrode für Fluorid erhoben.

Auf der logarithmischen Skala, eine Linie zu erhalten müssen die Konzentrationsdaten geplottet werden. Diese Eichkurve kann zur Messung der Konzentration von Fluorid in einer Lösung, wie Zahnpasta oder Trinkwasser verwendet werden.

Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie oder HPLC, ist eine Trennung und Analysetechnik, die in der analytischen Chemie zu stark ausgelastet ist. HPLC trennt Bestandteile einer Mischung basierend auf den Zeitaufwand für die Moleküle, die Länge der Chromatographie Spalte zu reisen. Diese Zeit variiert je nach eine Reihe von chemischen Eigenschaften der Moleküle.

Die Elution der Moleküle wird mit einem Detektor, wodurch ein Chromatogramm gemessen. Die Peakfläche kann mithilfe einer einfachen Kalibrierungskurve eine Reihe von standard-Lösungen, wie in diesem Beispiel der beliebten Soda Zutaten Konzentration korreliert werden.

In einigen Fällen, wo die Lösungsmatrix die Messung des gelösten Stoffes stört, kann eine klassische Kalibrationskurve ungenau sein. In diesen Fällen ist eine modifizierte Kalibrationskurve bereit. Hierzu wird eine Reihe von standard-Lösung Volumen der Probe hinzugefügt. Das Signal für Konzentration Handlung entsteht, wobei X Abfangen der ursprünglichen Konzentration der Probenlösung entspricht. Schauen Sie für weitere Einzelheiten über diese Technik der Wissenschaftsbildung JoVE video, "die Methode der standard Addition".

Sie habe nur Jupiters Einführung in die Eichkurve beobachtet. Sie sollten jetzt verstehen, wo die Eichkurve verwendet wird, wie man es schaffen und wie Sie es verwenden, um die Konzentration der Proben zu berechnen.

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