Overview
Source : Laboratoire du Dr B. Jill Venton - University of Virginia
Courbes d’étalonnage sont utilisés pour comprendre la réponse instrumentale d’un analyte et prévoir la concentration dans un échantillon inconnu. Généralement, un ensemble d’échantillons standards sont faits à différentes concentrations d’une portée que comprend l’inconnu d’intérêt et la réponse instrumentale à chaque concentration est enregistrée. Pour plus de précision et de comprendre l’erreur, la réponse à chaque concentration peut être répétée si une barre d’erreur est obtenue. Les données sont ensuite propres avec une fonction afin que des concentrations inconnues peuvent être prédites. En général, la réponse est linéaire, cependant, une courbe est possible avec d’autres fonctions aussi longtemps que la fonction est connue. La courbe d’étalonnage peut être utilisée pour calculer la limite de détection et limite de quantification.
Lorsque vous effectuez des solutions pour une courbe d’étalonnage, chaque solution peut être faite séparément. Toutefois, qui peut prendre beaucoup de matériel de départ et prendre votre temps. Une autre méthode pour la fabrication de beaucoup de différentes concentrations d’une solution est d’utiliser des dilutions successives. Avec des dilutions successives, un échantillon concentré est dilué vers le bas selon des étapes pour faire des concentrations plus faibles. L’exemple suivant est issu de la dilution antérieure, et le facteur de dilution est souvent maintenu constant. L’avantage est qu’il faut qu’une seule solution initiale. L’inconvénient est que toute erreur dans la fabrication de la solution — pipetage, volumétrie, etc. — se propage que plusieurs solutions sont apportées. Ainsi, il faut lors de la solution initiale.
Principles
Courbes d’étalonnage peuvent être utilisés pour prédire la concentration d’un échantillon inconnu. Pour être tout à fait exact, les échantillons standards doivent être exécutés dans la même matrice que l’échantillon inconnu. Une matrice de l’échantillon est les composants de l’échantillon que l’analyte d’intérêt, y compris le solvant et tous les sels, protéines, ions métalliques, etc. qui pourraient être présentes dans l’échantillon. Dans la pratique, échantillons d’étalonnage en cours d’exécution dans la même matrice que l’inconnu est parfois difficile, car l’échantillon inconnu est peut-être auprès d’un échantillon biologique ou environnemental complex. Ainsi, plusieurs courbes d’étalonnage sont fabriqués dans une matrice de l’échantillon qui se rapproche de l’échantillon réel, comme artificielle cérébrale spinale fluide artificiel, d’urine ou de près mais ne peut pas être exact. La gamme de concentrations de la courbe d’étalonnage qui devrait support dans l’échantillon inconnu attendu. Idéalement quelques concentrations au-dessus et au-dessous de l’exemple de la concentration attendue sont mesurées.
Nombreuses courbes de calibration sont linéaires et peut être adaptés avec l’équation de base y = mx + b, où m est la pente et b l’ordonnée à l’origine. Cependant, pas toutes les courbes sont linéaires et parfois pour obtenir une ligne, un ou les deux ensemble d’axes sera sur une échelle logarithmique. Régression linéaire est généralement effectuée à l’aide d’un programme d’ordinateur et la méthode la plus courante consiste à utiliser un moindres carrés ajustement. Avec une analyse de régression linéaire, une valeur de2 R, appelée le coefficient de détermination, est donnée. Pour une simple régression simple, R2 est le carré du coefficient de corrélation (r) et fournit des informations sur comment les valeurs y êtes loin de la ligne prévue. Une ligne parfaite aurait une valeur2 R 1 et R plus2 valeurs pour les courbes d’étalonnage sont plus 0,95. Lorsque la courbe d’étalonnage est linéaire, la pente est une mesure de la sensibilité : combien le signal change pour un changement de concentration. Une ligne plus raide avec une plus grande pente indique une mesure plus sensible. Une courbe d’étalonnage permet également de définir la gamme linéaire, la gamme des concentrations que l’instrument donne une réponse linéaire. En dehors de cette plage, la réponse peut effiler au large en raison de considérations instrumentales, et l’équation de l’étalonnage ne peut être utilisée. Ceci est connu comme la limite de linéarité.
Limite de détection est le montant le plus bas qui peut être déterminé statistiquement du bruit. Ceci est généralement défini comme un signal qui est 3 fois le bruit. La limite de détection peut être calculée à partir de la pente de la courbe d’étalonnage et est généralement définie comme LOD=3*S.D./m, S.D. correspondant à l’écart du bruit. Le bruit est mesuré en prenant la déviation standard de mesures multiples. Par ailleurs, dans une trace, bruit peut être estimée comme l’écart de la ligne de base. La limite de quantification est le montant qui peut être différencié entre les échantillons et est généralement défini comme 10 fois le bruit.
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Procedure
1. rendre les normes : des Dilutions successives
- Faire une solution concentrée de la norme. En règle générale, le composé est exactement pesé et muté quantitativement dans une fiole jaugée. Ajouter certains solvants, mélanger afin que l’échantillon se dissout, puis remplissez la ligne avec le solvant approprié.
- Effectuer des dilutions successives. Prendre une autre fiole jaugée et déposer la quantité d’étalon pour la dilution, puis remplir la ligne avec solvant et mélanger. Une dilution dix fois est généralement faite, donc, pour une fiole jaugée de 10 mL, ajouter 1 mL de la dilution antérieure.
- Continuer selon les besoins pour des dilutions plus, pipetage de l’ancienne solution à diluer pour faire l’échantillon suivant. Pour une courbe d’étalonnage bon, au moins 5 concentrations sont nécessaires.
2. exécuter les exemples de la courbe d’étalonnage et de l’inconnu
- Exécuter les exemples avec le spectrophotomètre UV-Vis pour déterminer la réponse instrumentale pour la courbe d’étalonnage.
- Effectuer la lecture avec le premier échantillon. C’est une bonne idée d’exécuter les exemples dans un ordre aléatoire (c'est-à-dire pas plus élevé au plus faible ou plus bas au plus élevé) dans le cas où il y a des erreurs systématiques. Pour obtenir une estimation du bruit, répéter la lecture sur n’importe quel échantillon donné 3 – 5 x.
- Exécuter les exemples standards supplémentaires, en répétant les mesures pour chaque échantillon obtenir une estimation du bruit. Enregistrer les données pour créer un terrain plus tard.
- Exécutez des échantillons inconnus. Utiliser dans des conditions similaires pour les normes en cours d’exécution possible. Ainsi, la matrice de l’échantillon ou le tampon doit être la même, le pH devrait être le même, et la concentration doit être dans la gamme des normes exécutée.
3. rendre la courbe d’étalonnage
- Enregistrer les données dans une feuille de calcul et utiliser un programme d’ordinateur pour tracer la concentration de vs de données. Si au moins trois mesures ont été prises pour chaque point, les barres d’erreur peuvent être tracées de l’écart de ces mesures à l’estimation de l’erreur de chaque point. Pour quelques courbes, les données devrez peut-être être tracées avec un axe sous un log pour obtenir une ligne. L’équation qui régit la courbe d’étalonnage est généralement connue d’avance, donc un journal-terrain est utilisé lorsqu’il y a un journal dans l’équation.
- Examiner la courbe d’étalonnage. Est-il linéaire ? A-t-il une partie qui ressemble non linéaire (c'est-à-dire atteint la limite de la réponse instrumentale) ? Pour vérifier, monter toutes les données à une régression linéaire en utilisant le logiciel. Si le coefficient de détermination (R2) n’est pas élevé, supprimer certains points au début ou à la fin de la courbe qui ne semblent pas s’adapter à la ligne et d’effectuer la régression linéaire à nouveau. Il n’est pas acceptable d’enlever des points au milieu juste parce qu’ils ont un bar faute grossière. De cette analyse, décidez quelle portion de la courbe est linéaire.
- La sortie de la linéaire doit être une équation du format y = mx + b, où m est la pente et b l’ordonnée à l’origine. Les unités pour la pente sont l’unité de l’axe y/concentration, dans cet exemple (Figure 1) absorbance/μM. Les unités pour l’ordonnée à l’origine sont les unités de l’axe des ordonnées. On obtient un coefficient de détermination (R2). Plus le R2 plus l’ajustement ; un ajustement parfait donne un R2 de 1. Le programme peut également être en mesure de donner une estimation de l’erreur sur la pente et l’ordonnée à l’origine.
4. résultats : Courbe d’étalonnage de l’Absorbance du colorant bleu #1
- La courbe d’étalonnage de l’absorbance du colorant bleu #1 (à 631 nm) est indiqué ci-dessous (Figure 1). La réponse est linéaire de 0 à 10 µM. ci-dessus que concentration le signal commence à niveau car la réponse est hors de la gamme linéaire du spectrophotomètre UV-Vis.
- Calculer la limite de détection. De la pente de la courbe d’étalonnage, la limite de détection est 3*S.D. (bruit) / m. Pour cette courbe d’étalonnage, le bruit a été obtenu en prenant une déviation standard de mesures répétées et était 0,021. La limite de détection serait 3*0.021/.109=0.58 µM.
- Calculer le ndd. La LDD est 10*S.D. (bruit) / m. Pour cette courbe d’étalonnage, NdD est 10*0.021/.109 = 1,93 µM.
- Calculer la concentration de l’inconnu. L’équation de la ligne permet de calculer la concentration de l’échantillon inconnu. La courbe d’étalonnage est uniquement valide si l’inconnu se trouve dans la fourchette linéaire des échantillons standards. Si les lectures sont trop élevés, la dilution peut être nécessaire. Dans cet exemple, la boisson pour sportifs inconnu a été dilué 1:1. L’absorbance a été 0,243 et cela correspond à une concentration de 2,02 µM. Ainsi la concentration finale de colorant bleu #1 dans les dans les sports boisson était 4,04 µM.
Figure 1. Courbes d’étalonnage de l’absorbance UV-Vis du colorant bleu. Gauche : l’absorbance est mesurée de différentes concentrations de colorant bleu #1. Les réponses se stabiliser après 10 µM, lorsque l’absorption est supérieure à 1. Les barres d’erreur sont des mesures répétées du même échantillon et écarts-types. Droit : La partie linéaire de la courbe d’étalonnage est dotée d’une ligne, y = 0,109 * x + 0,0286. Les données inconnues sont affichées en noir. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Courbes d’étalonnage sont utilisés pour comprendre la réponse instrumentale d’un analyte et de prédire la concentration de l’analyte dans un échantillon.
Une courbe d’étalonnage est créée en premier préparer un ensemble de solutions standards avec des concentrations connues de l’analyte. La réponse de l’instrument est mesurée pour chacun et complotée contre la concentration de la solution étalon. La partie linéaire de ce complot peut alors servir pour prédire la concentration d’un échantillon de l’analyte, en corrélant sa réponse à la concentration.
Cette vidéo va présenter des courbes d’étalonnage et leur utilisation, en démontrant la préparation d’un ensemble de normes, suivie de l’analyse d’un échantillon avec concentration inconnue.
Un ensemble de solutions standards est utilisé pour préparer la courbe d’étalonnage. Ces solutions se composent d’une gamme de concentrations qui englobent la concentration approximative de l’analyte.
Solutions étalons sont souvent préparées avec une dilution en série. Une dilution en série est réalisée par la première prépare une solution mère de l’analyte. La solution est ensuite diluée par une quantité connue, souvent un ordre de grandeur. La nouvelle solution est ensuite diluée dans la même manière et ainsi de suite. Cela se traduit par un ensemble de solutions avec des concentrations variant sur plusieurs ordres de grandeur.
La courbe d’étalonnage est une parcelle de signal instrumental vs concentration. L’intrigue des normes doit être linéaire et peut être adapté avec l’équation y = mx + b. Les portions non linéaire de la parcelle doivent être jetées, comme ces gammes de concentration sont hors de la limite de linéarité.
L’équation de la ligne optimale permet ensuite à déterminer la concentration de l’échantillon, en utilisant le signal de l’instrument à corréler à la concentration. Échantillons avec des mesures qui se trouvent à l’extérieur de la gamme linéaire du complot doivent être dilués, afin d’être dans la gamme linéaire.
La limite de détection de l’instrument, ou la mesure le plus bas qui peut être déterminée statistiquement sur le bruit, peut être calculée de la courbe d’étalonnage aussi bien. Un échantillon témoin est mesuré plusieurs fois. La limite de détection est généralement définie comme étant le signal blanc moyen plus 3 fois son écart-type.
Enfin, la limite de quantification peut aussi être calculée. La limite de quantification est la plus faible quantité d’analyte qui peut être quantifiée avec précision. Cela correspond à 10 écarts-types au-dessus du signal blanc.
Maintenant que vous avez appris les rudiments d’une courbe d’étalonnage, nous allons voir comment préparer et utiliser un dans le laboratoire.
Tout d’abord, préparer une solution concentrée de la norme. Peser la norme et le transférer dans une fiole jaugée. Ajouter une petite quantité de solvant et mélanger de sorte que l’échantillon se dissout. Puis, remplissez la ligne avec le solvant. Il est important d’utiliser le même solvant que l’échantillon.
Pour préparer les normes, distribuer le montant requis dans la fiole jaugée. Remplir le ballon à la ligne avec un solvant, puis mélanger.
Continuer à faire les normes par pipetage de la solution mère et la dilution. Pour une courbe d’étalonnage bon, au moins 5 concentrations sont nécessaires.
Désormais, exécuté des exemples avec l’instrument d’analyse, dans ce cas un spectrophotomètre UV-Vis, afin de déterminer la réponse instrumentale nécessaires pour que la courbe d’étalonnage.
Prendre la mesure du premier standard. Exécuter les normes dans un ordre aléatoire, dans le cas où il y a des erreurs systématiques. Mesurer chaque norme 3 – 5 x pour obtenir une estimation du bruit.
Mesurer le reste des normes, répétant les mesures pour chacun. Enregistrer toutes les données.
Enfin, exécutez l’exemple. Utilisez les mêmes conditions de mesure et la matrice échantillon qui ont été utilisés pour les normes. S’assurer que l’échantillon soit dans le secteur des normes et de la limite de l’instrument.
Pour construire la courbe d’étalonnage, utilisez un programme d’ordinateur pour tracer les données sous forme de signal vs concentration. Utiliser l’écart type des mesures répétées pour chaque point de données pour faire des barres d’erreur.
Supprimer des portions de la courbe qui sont non linéaires, puis effectuent une régression linéaire et déterminer la ligne optimale. La production devrait être une équation de la forme y = m x + b. Un R2-valeur proche de 1 dénote un bon ajustement.
Il s’agit de la courbe d’étalonnage pour colorant bleu #1, mesuré 631 nm. La réponse est linéaire entre 0 et 15 mM.
Calculer la concentration de l’échantillon à l’aide de l’équation de la ligne optimale. L’absorbance de l’échantillon était 0,141 et correspondait à une concentration de 6,02 mM.
Maintenant que vous avez vu comment une courbe d’étalonnage peut être utilisée avec un spectrophotomètre UV-Vis, nous allons jeter un oeil à d’autres applications utiles.
Courbes d’étalonnage sont souvent utilisés avec des applications de l’électrochimie, comme le signal de l’électrode doit être étalonné à la concentration des ions dans la solution. Dans cet exemple, les données ont été recueillies pour une électrode sélective des ions de fluorure.
Les données de concentration doivent être tracées sur l’échelle logarithmique pour obtenir une ligne. Cette courbe d’étalonnage peut être utilisée pour mesurer la concentration de fluorure dans une solution, comme la pâte dentifrice ou de l’eau potable.
Chromatographie liquide à haute performance, ou HPLC, est une séparation et une technique d’analyse est largement utilisé en chimie analytique. HPLC sépare les composants d’un mélange basé sur le temps nécessaire pour les molécules de voyager la longueur de la colonne de chromatographie. Ce temps varie selon une gamme de propriétés chimiques des molécules.
L’élution des molécules est mesurée à l’aide d’un détecteur, ce qui entraîne un chromatogramme. La surface du pic peut être corrélée à la concentration à l’aide d’une courbe d’étalonnage simple d’une gamme de solutions étalons, comme dans cet exemple d’ingrédients populaires de soude.
Dans certains cas, où la matrice solution interfère avec la mesure du soluté, une courbe d’étalonnage classique peut être inexacte. Dans ces cas, une courbe d’étalonnage mis à jour l’est prête. Pour ce faire, une gamme de volumes de la solution titrée est ajoutée à l’échantillon. Le signal à l’intrigue de concentration est créé, où l’intersection de x est égale à la concentration initiale de la solution échantillon. Pour plus de détails sur cette technique, s’il vous plaît regarder l’enseignement des sciences JoVE vidéo, « la méthode des ajouts dosés ».
Vous avez juste regardé introduction de Jupiter à la courbe d’étalonnage. Vous devez maintenant comprendre où la courbe d’étalonnage est utilisée, comment le créer et comment l’utiliser pour calculer les concentrations des échantillons.
Comme toujours, Merci pour regarder !
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Applications and Summary
Courbes d’étalonnage sont utilisés dans de nombreux domaines de la chimie analytique, biochimie et chimie pharmaceutique. Il est fréquent de les utiliser avec la spectroscopie, chromatographie et mesures de l’électrochimie. Une courbe d’étalonnage permet de comprendre la concentration d’un polluant environnemental dans un échantillon de sol. Il pourrait être utilisé, déterminer la concentration d’un neurotransmetteur dans un échantillon de liquide du cerveau, de la vitamine en échantillons pharmaceutiques, ou la caféine dans les aliments. Ainsi, les courbes d’étalonnage sont utiles dans des applications environnementales, de sciences biologiques, pharmaceutiques et alimentaires. La partie la plus importante de faire une courbe d’étalonnage est de faire des échantillons étalons précis qui se trouvent dans une matrice qui rapproche le mélange de l’échantillon.
Un exemple d’une courbe d’étalonnage électrochimie ci-dessous (Figure 2). Les données ont été recueillies avec une électrode sélective des ions de fluorure. Électrochimiques données suivent l’équation de Nernst E = E0 + 2.03*R*T/(nF) * log C. Ainsi, les données de concentration (axe x) doivent être tracées sur une échelle logarithmique pour obtenir une ligne. Cette courbe d’étalonnage pourrait être utilisée pour mesurer la concentration de fluorure dans les dentifrices ou l’eau potable.
Figure 2. Courbe d’étalonnage pour une électrode sélective des ions. La réponse d’une électrode sélective de fluorure (en mV) à différentes concentrations de fluorure est tracée. L’équation attendue de la réponse de l’électrode est y (en mV) =-59,2 * log x + b à 25 ° C. L’équation réelle est y =-57,4 * log x +56.38. La valeur de2 R est 0.998. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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