环境样品中的噬菌体的检测

Environmental Microbiology

Your institution must subscribe to JoVE's Environmental Sciences collection to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Overview

资料来源: 实验室的博士伊恩胡椒和博士查尔斯称-亚利桑那大学
演示作者: 亚历克斯 Wassimi

病毒是一独特组感染真核生物和原核生物的生物实体。他们是专性寄生虫,没有代谢的能力,和来进行复制,依赖宿主代谢产生病毒在宿主细胞内自组装的零件。

病毒是超微 — — 太小,无法进行光镜观察,可见只有与更大的分辨率的电子显微镜下查看。病毒粒子组成的核酸基因组 DNA 或 RNA,包围一层蛋白质,称为衣壳组成蛋白质亚基或 capsomers。在一些更复杂的病毒衣壳包围其他脂质信封,一些有穗状表面附属物或尾巴。

病毒感染人类和动物的肠道被称为肠道病毒。他们在粪便中排出,可以隔离从生活污水。感染细菌的病毒被称为噬菌体,和那些感染大肠菌群被称为体内大肠杆菌噬菌 (图 1)。噬菌体大肠菌群是任何地方发现大肠菌群发现。

Figure 1
图 1。大肠杆菌 T2。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 环境微生物学精要. 环境样品中的噬菌体的检测. JoVE, Cambridge, MA, (2019).

Principles

噬菌体研究在环境科学中,因为它们是生物系统的重要组成部分。他们是地球上最丰富的生物实体,是重要的因为他们帮助控制细菌类群、 食物链过程、 生物地球化学循环,以及增强通过基因水平转移的原核生物多样性。还有证据表明,噬菌体是疾病引起的肠道病毒也 fecally-传输但很难测定的可靠的替代指标。相对快速和廉价的方法来枚举噬菌体的可用性使他们有吸引力的工具,用于评估的粪便污染环境样品中。

水噬体测定由加法样品给软或覆盖琼脂培养大肠杆菌和日志阶段的增长。噬菌体细菌细胞附着和溶解细菌。细菌产生除了领域在哪里增长和裂解细菌噬菌体生长汇合草坪。这些结果明确领域被称为斑块。软琼脂覆盖用于限制物理扩散的病毒,因此,在从一种细菌的溶胞,他们只能传播到邻近的细菌细胞。

为了获得最优的斑块形成宿主菌是在成长的日志阶段至关重要。这可以确保所有噬菌体附加的活菌和产生后代。这就要求文化的宿主菌准备每一天,进行测定。通常情况下,一种文化被孵化含量测定的前一天,它将处于平稳阶段。测定日,文化用于接种的肉汤,孵化在日志相含量测定中获得足够的宿主菌的 (这通常需要 2-3 h 的孵化在晃动的水浴在 35-37 ° C)。

Procedure

  1. 得到的污水或水中含有大肠杆菌的样本。
  2. 稀释的示例 1:10 和 1: 100 用三缓冲区。执行此操作通过将 1.0 毫升的培养液转移到 9 毫升的三缓冲区,然后使第二 10 倍稀释。
  3. 通过将它们放在蒸汽浴室或高压釜融化三管的软琼脂 (0.7%营养琼脂或胨大豆琼脂每 3 毫升管)。
  4. 将琼脂放在水浴在 45-48 ° C 为 15 分钟,使温度的琼脂调整到 45 ° c。
  5. 第一筒,添加 1 毫升的大肠杆菌1和 1 毫升的稀释样品的日志阶段培养液。
  6. 删除管水浴和轻轻地岩手混合悬浮 2 3 s 之间。
  7. 水从管子用一张纸巾擦干和琼脂倒入事先准备好的培养皿,含底部琼脂 (普通营养琼脂或胨大豆琼脂)。
  8. 快速旋转板传播顶级琼脂。因此,请务必琼脂覆盖整个表面。
  9. 重复步骤 5-8 与其他两个管的软琼脂,使用 1 毫升的细菌和 1 毫升的每个样品稀释 (图 2)。
  10. 琼脂凝固后,倒置培养皿和孵化在 37 ° C,为 48 h.敲开了盖子的培养皿任何水分。如果水分就会造成这种病毒在琼脂表面蔓延斑块上落下。
  11. 经过孵化,数数每个稀释 (图 3) 上的斑块数目和计算噬菌体在原样品的浓度。记录的大小或外观斑块的任何重大差异。

Figure 2
图 2。使用顶级琼脂大肠杆菌计数细菌草坪的编制程序。

Figure 3
图 3。噬菌体在细菌的草坪上的斑块。

1大肠杆菌株 ATCC 15597 通常会产生斑块从污水样本的最大数量。它应该长成隔夜中含有的营养或胨大豆肉汤 100 毫升 250 毫升锥形瓶及孵化下晃动条件在 35 ° c。前噬菌体检测 3 h 接种一毫升的这种文化到新鲜的烧瓶含有 100 毫升的营养或胨大豆肉汤和地方在晃动的水浴在 35-37 ° c。这将确保细菌处于日志阶段的增长。

病毒是负责很多疾病、 感冒和流感,肝炎和艾滋病毒的传染性生物粒子。

病毒是生物粒子组成的 DNA 或 RNA 的基因组,包裹在蛋白质的外衣,称为衣壳,有时与其他脂质信封里。病毒对他们自己,有没有代谢或生殖能力必须入侵活细胞和劫持其细胞的机械,使更多的自己的拷贝。

等细菌,原核细胞和真核细胞,如那些人类,可以由特定类的病毒感染。具体来说,噬菌体是感染细菌的病毒。例如,体内大肠杆菌噬菌是这些噬菌体感染大肠杆菌,一种常见的肠道细菌,其中有些菌株可导致食物中毒,和这是相对值的粪便污染的水供应。

噬菌体本身也不知道要在人类致病性,而是证据,他们是可靠的替代指标为致病肠道病毒也 fecally-传输但很难测定。相对快速和廉价的方法来枚举噬菌体的可用性使他们有吸引力的工具,用于评估的粪便污染环境样品中。

这个视频将介绍噬菌体枚举; 背后的原则显示协议为量化噬菌体,称为空斑法测定;最后,探讨几种环境科学应用程序的检测和计数的噬菌体和其他病毒。

噬菌体,像所有的病毒,必须寄生在活细胞,在此案例中的细菌,以重现。

噬菌体通过登陆和细菌细胞表面附着和其遗传物质注入细胞来做到。一旦进入细胞,病毒基因组复制和产生病毒衣壳蛋白组分,两个使用了宿主细胞的生化机制。一旦组装噬菌体颗粒,他们是来自细菌,经常主机的溶胞和发表迸发出来,杀死宿主细胞过程中。

广泛使用的方法,测定样品中的噬菌体浓度利用此裂解的活动。在这种技术,样品从噬菌体被混合细菌和软琼脂。这种混合物被倒到常规琼脂培养皿上作为衬底和顶部图层形式覆盖。

细菌是浓度较高时,他们形成一个连续的草坪。这种细菌应所得的文化,是在增长,以确保每个噬菌体感染的细菌是活着的日志阶段,允许噬菌体产生后代。

当噬菌体颗粒体感染并裂解细菌时,噬菌体后代会蔓延到附近的细菌细胞并引起持续感染。软琼脂法限制扩散的噬菌体颗粒。最终,将形成面积结算,称为斑块。

如果噬菌体被稀释到足够低的浓度,然后可以在细菌的草坪上观察离散的、 个别的斑块。这些可以计数和用于计算的空斑形成单位或 PFUs,每毫升的原始样品的噬菌体数量。

既然您已了解如何噬菌体感染细菌,这种活动如何可以用于噬菌体浓度测量,通过一个协议来使用空斑法测定枚举环境水样中的噬菌体吧。

一天之前进行化验,接种大肠杆菌株 ATCC 15597 成胨大豆肉汤在 250 毫升锥形瓶 100 毫升的殖民地。孵化用颤抖在 35 ° C 的一夜。

3 h 前测定,接种 1 毫升的过夜的大肠杆菌培养成新鲜的 100 毫升的肉汤。这种新文化放在震动的水浴温度 35 和 37 ° C 之间。这将确保当检测开始时,日志阶段的生长的细菌,是。

若要启动空斑法测定,做 10 倍和 100 倍系列稀释水样,使用 9 毫升的三缓冲区。

使用蒸汽浴室,融化的 0.7%软顶琼脂三 5 毫升管、 要么胨大豆或营养琼脂。一旦融化,放在水浴在 45 至 48 ° C 至少 15 分钟的琼脂的温度下降到 45 ° c。

软琼脂集落形成的第一管,加 1 毫升的事先准备好的日志阶段大肠杆菌文化和 1 毫升的稀释的水样。删除管水浴和轻轻地双手 2 3 s 混合悬浮液之间的岩石。

软琼脂倒入事先准备好的培养皿用胨大豆或营养琼脂。快速旋转板蔓延,确保它涵盖整个表面。

对于其他两个管,使用 1 毫升的每个稀释样品重复接种和电镀。

一旦顶级琼脂已经凝固,反转的菜肴和 48 小时,37 ℃ 培养他们。

孵育后数瘟疫在每个印版上。从计数,计算原始样品中的噬菌体浓度

例如,如果从 10 倍稀释板中获得了 9 斑块,是 9 倍 10 除以 1 毫升或 90 PFUs/mL 的原水样本中大肠杆菌的。

现在,您已经看到如何执行噬菌斑化验的让我们看看如何斑块检测可以用于枚举噬菌体和其他类型的病毒从各种来源。

斑块基于检测的方法可以用于隔离从不同的环境样品,如土壤的噬菌体。在此示例中,研究人员首先收集噬菌体从土壤的过滤。噬菌体被用于感染常见土壤细菌节杆菌在空斑法测定。噬菌体被拿从个别斑块和到新的琼脂平板,有条纹,然后叠加与细菌包含顶级琼脂。噬菌体浓度减小沿长度的条纹,可能得到离散的斑块,由一个单一类型的噬菌体,有可能形成。然后可以拿这些个别的斑块进一步分析内的噬菌体。

除了噬菌体,也可以与其他感染哺乳动物的病毒,包括那些,如流行性感冒,执行斑块检测。为此,哺乳动物细胞首先长大了作为单分子膜在组织培养皿中。媒体包含病毒然后添加到要允许感染发生之前与固定化凝胶状琼脂糖等介质覆盖单元格, 的单元格。以后可能会持续两周的潜伏期,受感染的细胞是固定和染色,使斑块可视化,进行清点。

最后,除了环境所提供的样品,斑块化验是有益用于检测和枚举从受感染的个人组织样品中的病毒。在这里,研究人员获得和同质化的肺组织从小鼠感染与 γ 疱疹病毒。这包含病毒的匀浆然后用于感染哺乳动物细胞培养。然后可以计数斑块数目估计为感染的肺组织中病毒滴度。

你刚看了朱庇特的视频在环境样品中的噬菌体的检测。现在,您应该了解的基本生物学,噬菌体、 如何执行空斑法测定,定量测定环境样品中的噬菌体和斑块检测方法如何用于研究噬菌体和其他环境或临床样品中的病毒。一如既往,感谢您收看 !

Results

污水样品稀释 = 10-1

获得的斑块数目 = 9

因此,污水样品中的噬菌体浓度
= 10 × 9 ÷ 1 毫升
= 90 空斑形成单位 / 毫升

未经处理的污水通常包含 103 — — 每毫升,与一系列 10 104大肠杆菌2 – 108每毫升。

Applications and Summary

有许多潜在的应用体内大肠杆菌噬菌作为环境指标。这些包括他们使用作为指标的污水污染,水和废水处理的效率和肠道病毒和细菌在环境中的生存。作为指标的存在和行为的肠道细菌和动物病毒噬菌体的使用一直是有吸引力因为检测的易用性和低成本与噬菌体检测方法。此外,他们可以与天或周为肠道病毒的 24 小时内环境样品中量化。

1大肠杆菌株 ATCC 15597 通常会产生斑块从污水样本的最大数量。它应该长成隔夜中含有的营养或胨大豆肉汤 100 毫升 250 毫升锥形瓶及孵化下晃动条件在 35 ° c。前噬菌体检测 3 h 接种一毫升的这种文化到新鲜的烧瓶含有 100 毫升的营养或胨大豆肉汤和地方在晃动的水浴在 35-37 ° c。这将确保细菌处于日志阶段的增长。

  1. 得到的污水或水中含有大肠杆菌的样本。
  2. 稀释的示例 1:10 和 1: 100 用三缓冲区。执行此操作通过将 1.0 毫升的培养液转移到 9 毫升的三缓冲区,然后使第二 10 倍稀释。
  3. 通过将它们放在蒸汽浴室或高压釜融化三管的软琼脂 (0.7%营养琼脂或胨大豆琼脂每 3 毫升管)。
  4. 将琼脂放在水浴在 45-48 ° C 为 15 分钟,使温度的琼脂调整到 45 ° c。
  5. 第一筒,添加 1 毫升的大肠杆菌1和 1 毫升的稀释样品的日志阶段培养液。
  6. 删除管水浴和轻轻地岩手混合悬浮 2 3 s 之间。
  7. 水从管子用一张纸巾擦干和琼脂倒入事先准备好的培养皿,含底部琼脂 (普通营养琼脂或胨大豆琼脂)。
  8. 快速旋转板传播顶级琼脂。因此,请务必琼脂覆盖整个表面。
  9. 重复步骤 5-8 与其他两个管的软琼脂,使用 1 毫升的细菌和 1 毫升的每个样品稀释 (图 2)。
  10. 琼脂凝固后,倒置培养皿和孵化在 37 ° C,为 48 h.敲开了盖子的培养皿任何水分。如果水分就会造成这种病毒在琼脂表面蔓延斑块上落下。
  11. 经过孵化,数数每个稀释 (图 3) 上的斑块数目和计算噬菌体在原样品的浓度。记录的大小或外观斑块的任何重大差异。

Figure 2
图 2。使用顶级琼脂大肠杆菌计数细菌草坪的编制程序。

Figure 3
图 3。噬菌体在细菌的草坪上的斑块。

1大肠杆菌株 ATCC 15597 通常会产生斑块从污水样本的最大数量。它应该长成隔夜中含有的营养或胨大豆肉汤 100 毫升 250 毫升锥形瓶及孵化下晃动条件在 35 ° c。前噬菌体检测 3 h 接种一毫升的这种文化到新鲜的烧瓶含有 100 毫升的营养或胨大豆肉汤和地方在晃动的水浴在 35-37 ° c。这将确保细菌处于日志阶段的增长。

病毒是负责很多疾病、 感冒和流感,肝炎和艾滋病毒的传染性生物粒子。

病毒是生物粒子组成的 DNA 或 RNA 的基因组,包裹在蛋白质的外衣,称为衣壳,有时与其他脂质信封里。病毒对他们自己,有没有代谢或生殖能力必须入侵活细胞和劫持其细胞的机械,使更多的自己的拷贝。

等细菌,原核细胞和真核细胞,如那些人类,可以由特定类的病毒感染。具体来说,噬菌体是感染细菌的病毒。例如,体内大肠杆菌噬菌是这些噬菌体感染大肠杆菌,一种常见的肠道细菌,其中有些菌株可导致食物中毒,和这是相对值的粪便污染的水供应。

噬菌体本身也不知道要在人类致病性,而是证据,他们是可靠的替代指标为致病肠道病毒也 fecally-传输但很难测定。相对快速和廉价的方法来枚举噬菌体的可用性使他们有吸引力的工具,用于评估的粪便污染环境样品中。

这个视频将介绍噬菌体枚举; 背后的原则显示协议为量化噬菌体,称为空斑法测定;最后,探讨几种环境科学应用程序的检测和计数的噬菌体和其他病毒。

噬菌体,像所有的病毒,必须寄生在活细胞,在此案例中的细菌,以重现。

噬菌体通过登陆和细菌细胞表面附着和其遗传物质注入细胞来做到。一旦进入细胞,病毒基因组复制和产生病毒衣壳蛋白组分,两个使用了宿主细胞的生化机制。一旦组装噬菌体颗粒,他们是来自细菌,经常主机的溶胞和发表迸发出来,杀死宿主细胞过程中。

广泛使用的方法,测定样品中的噬菌体浓度利用此裂解的活动。在这种技术,样品从噬菌体被混合细菌和软琼脂。这种混合物被倒到常规琼脂培养皿上作为衬底和顶部图层形式覆盖。

细菌是浓度较高时,他们形成一个连续的草坪。这种细菌应所得的文化,是在增长,以确保每个噬菌体感染的细菌是活着的日志阶段,允许噬菌体产生后代。

当噬菌体颗粒体感染并裂解细菌时,噬菌体后代会蔓延到附近的细菌细胞并引起持续感染。软琼脂法限制扩散的噬菌体颗粒。最终,将形成面积结算,称为斑块。

如果噬菌体被稀释到足够低的浓度,然后可以在细菌的草坪上观察离散的、 个别的斑块。这些可以计数和用于计算的空斑形成单位或 PFUs,每毫升的原始样品的噬菌体数量。

既然您已了解如何噬菌体感染细菌,这种活动如何可以用于噬菌体浓度测量,通过一个协议来使用空斑法测定枚举环境水样中的噬菌体吧。

一天之前进行化验,接种大肠杆菌株 ATCC 15597 成胨大豆肉汤在 250 毫升锥形瓶 100 毫升的殖民地。孵化用颤抖在 35 ° C 的一夜。

3 h 前测定,接种 1 毫升的过夜的大肠杆菌培养成新鲜的 100 毫升的肉汤。这种新文化放在震动的水浴温度 35 和 37 ° C 之间。这将确保当检测开始时,日志阶段的生长的细菌,是。

若要启动空斑法测定,做 10 倍和 100 倍系列稀释水样,使用 9 毫升的三缓冲区。

使用蒸汽浴室,融化的 0.7%软顶琼脂三 5 毫升管、 要么胨大豆或营养琼脂。一旦融化,放在水浴在 45 至 48 ° C 至少 15 分钟的琼脂的温度下降到 45 ° c。

软琼脂集落形成的第一管,加 1 毫升的事先准备好的日志阶段大肠杆菌文化和 1 毫升的稀释的水样。删除管水浴和轻轻地双手 2 3 s 混合悬浮液之间的岩石。

软琼脂倒入事先准备好的培养皿用胨大豆或营养琼脂。快速旋转板蔓延,确保它涵盖整个表面。

对于其他两个管,使用 1 毫升的每个稀释样品重复接种和电镀。

一旦顶级琼脂已经凝固,反转的菜肴和 48 小时,37 ℃ 培养他们。

孵育后数瘟疫在每个印版上。从计数,计算原始样品中的噬菌体浓度

例如,如果从 10 倍稀释板中获得了 9 斑块,是 9 倍 10 除以 1 毫升或 90 PFUs/mL 的原水样本中大肠杆菌的。

现在,您已经看到如何执行噬菌斑化验的让我们看看如何斑块检测可以用于枚举噬菌体和其他类型的病毒从各种来源。

斑块基于检测的方法可以用于隔离从不同的环境样品,如土壤的噬菌体。在此示例中,研究人员首先收集噬菌体从土壤的过滤。噬菌体被用于感染常见土壤细菌节杆菌在空斑法测定。噬菌体被拿从个别斑块和到新的琼脂平板,有条纹,然后叠加与细菌包含顶级琼脂。噬菌体浓度减小沿长度的条纹,可能得到离散的斑块,由一个单一类型的噬菌体,有可能形成。然后可以拿这些个别的斑块进一步分析内的噬菌体。

除了噬菌体,也可以与其他感染哺乳动物的病毒,包括那些,如流行性感冒,执行斑块检测。为此,哺乳动物细胞首先长大了作为单分子膜在组织培养皿中。媒体包含病毒然后添加到要允许感染发生之前与固定化凝胶状琼脂糖等介质覆盖单元格, 的单元格。以后可能会持续两周的潜伏期,受感染的细胞是固定和染色,使斑块可视化,进行清点。

最后,除了环境所提供的样品,斑块化验是有益用于检测和枚举从受感染的个人组织样品中的病毒。在这里,研究人员获得和同质化的肺组织从小鼠感染与 γ 疱疹病毒。这包含病毒的匀浆然后用于感染哺乳动物细胞培养。然后可以计数斑块数目估计为感染的肺组织中病毒滴度。

你刚看了朱庇特的视频在环境样品中的噬菌体的检测。现在,您应该了解的基本生物学,噬菌体、 如何执行空斑法测定,定量测定环境样品中的噬菌体和斑块检测方法如何用于研究噬菌体和其他环境或临床样品中的病毒。一如既往,感谢您收看 !

A subscription to JoVE is required to view this article.
You will only be able to see the first 20 seconds.

RECOMMEND JoVE