Methode der Standard Addition

Analytical Chemistry

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Overview

Quelle: Labor von Dr. Paul Bower - Purdue Universität

Die Methode der standard Ergänzungen ist eine Quantitative Analyse-Methode, die oft verwendet wird, wenn die Probe von Interesse mehrere Komponenten, die Matrix-Effekte, wo die zusätzlichen Komponenten können hat entweder reduzieren oder erhöhen das Analyten Extinktion Signal führen. Dies führt zu erheblichen Fehlern in den Analyseergebnissen.

Standardzusätzen werden häufig verwendet, um Matrixeffekte aus einer Messung zu beseitigen, da davon ausgegangen wird, dass die Matrix aller Lösungen gleichermaßen betrifft. Darüber hinaus wird es verwendet, um für die chemische korrigieren phase Trennungen in der Extraktion durchgeführt.

Die Methode erfolgt durch das Lesen der experimentellen (in diesem Fall fluoreszierenden) Intensität der unbekannten Lösung und dann durch die Messung der Intensität des unbekannten mit unterschiedlichen Mengen von bekannten Standard hinzugefügt. Die Daten werden grafisch dargestellt als Fluoreszenz Intensität Vs. die Menge des Standards hinzugefügt (das unbekannte selbst, mit keinen Standard hinzugefügt, ist auf der y-Achse aufgetragen). Die kleinsten Quadrate-Linie schneidet die x-Achse an der negativen der Konzentration des unbekannten, wie in Abbildung 1dargestellt.

Figure 1
Abbildung 1. Grafische Darstellung der Methode der standard Addition.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Grundlagen der analytischen Chemie. Methode der Standard Addition. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Principles

In diesem Experiment wird die Methode der standard Ergänzungen als analytisches Werkzeug demonstriert. Die Methode ist ein Verfahren für die Quantitative Analyse einer Art ohne die Erzeugung von einer typischen Kalibrierkurve. Standard zusätzlich Analyse erfolgt durch spektroskopische Intensität zu messen, vor und nach der Zugabe von präzise Aliquote einer bekannten standard-Lösung des Analyten.

Dieses Experiment Studien nicht fluoreszierenden Arten reagieren Sie in so einen fluoreszierenden Komplex bilden. Dieser Ansatz wird häufig bei der Untersuchung von Metall-Ionen verwendet. Aluminiumionen (Al3 +) werden bestimmt durch die Bildung einer Anlage mit 8-Hydroxychinolin (8HQ). Die Al3 + wird von 8HQ aus wässriger Lösung ausgefällt und wird dann in Chloroform extrahiert; die Fluoreszenz der Chloroform-Lösung wird gemessen und im Zusammenhang mit der Konzentration der ursprünglichen Al3 + Lösung. Empfindlichkeit im Bereich von Teil pro Million (ppm oder μg/mL) dürfte für dieses Experiment.

Die Reaktion ist

Reaction

Die Menge an Aluminium in jeder Probe während dieses Experiments wird wie folgt berechnet:

Leere 0
Unbekannte + 0 mL Standard Vunbekannt(Cunbekannt) = 25 mL (Cunbekannt)
Unbekannte + 1 mL Standard Vunbekannt(Cunbekannt) + VStandard(CStandard) = 25 mL (Cunbekannt) + 1 mL (1 μg/mL)
Unbekannte + 2 mL Standard V Unbekannt (Cunbekannt) + V Standard (CStandard) = 25 mL (Cunbekannt) + 2 mL (1 μg/mL)
Unbekannte + 3 mL Standard V Unbekannt (Cunbekannt) + V Standard (CStandard) = 25 mL (Cunbekannt) + 3 mL (1 μg/mL)
Unbekannte + 4 mL Standard V Unbekannt (Cunbekannt) + V Standard (CStandard) = 25 mL (Cunbekannt) + 4 mL (1 μg/mL)

Procedure

1. Vorbereitung der Reagenzien

  1. 100 ppm Al3 + Standardlösung: auflösen 0,9151 g Aluminium Nitrat (Al (Nr.3)3•9H2O) in eine volumetrische 1-L-Flasche mit VE-Wasser.
  2. 8HQ Lösung in 1 M Essigsäure (2 % wt/Vol): eine volumetrische 100 mL-Flasche 2,0 g 8-Hydroxychinolin hinzufügen.
  3. Sorgfältig fügen Sie 5,74 mL Eisessig in den 100-mL-Kolben, dann bis zur Markierung mit VE-Wasser zu verdünnen. Dies ermöglicht das 8-Hydroxychinolin in wässrigen Phase aufzulösen.
  4. 1 M NH4+/NH3 Puffer (pH ~ 8): eine 100-mL-Flasche 20 g Ammoniumacetat (NH4OAc) hinzufügen.
  5. Diese 100-mL-Flasche 7 mL 30 % Ammonium Hydroxid hinzu, und bis zur Markierung mit VE-Wasser zu verdünnen. Auf diese Weise neutralisieren die Säure in der 8HQ-Lösung kombiniert.
  6. Anderen Reagenzien enthalten wasserfreiem Natriumsulfat (Na2SO4) und Chloroform (Spec Klasse).

2. Vorbereitung der Proben

  1. Bereiten Sie eine 1,00 ppm standard Al3 + Lösung durch Zugabe von 1,0 mL 100 ppm Lager Al3 + Lösung mit einer Pipette in ein 100 mL volumetrischen Kolben.
  2. Legen Sie sechs 125 mL separatory Trichter auf die Ringe, die auf einem großen Ring-Stand befindet sich in der Haube sind. Sie sollte wie folgt beschriftet: BL, 0, 1, 2, 3, 4. sicherstellen, dass alle Gläser ist absolut sauber, da es schwierig ist, quantitative Ergebnisse zu erzielen, wenn kleine Perlen aus Chloroform an den Wänden der Glaswaren bleiben.
  3. Die fünf separatory Trichter mit der Bezeichnung 0, 1, 2, 3, 25,00 mL der unbekannten Al3 + Lösung hinzufügen & 4. In diesem Beispiel ist die unbekannte Konzentration 0,110 ppm.
  4. Fügen Sie 0, 1.00, 2.00, 3.00 und 4,00 mL 1,00-ppm Al3 + Standardlösung hinzu, bzw. die 5 Trichter mit einer 1-mL-Pipette.
  5. Bereiten Sie eine leere indem 25,00 mL destilliertem Wasser zu den separatory Trichter mit der Bezeichnung Bl.
  6. Fügen Sie 1,0 mL der Lösung mit einer Pipette 8-Hydroxychinolin hinzu, jede der sechs Lösungen.
  7. 3,0 mL Pufferlösung mit einer Pipette zu jedem der sechs Lösungen hinzugeben.
  8. Jede Lösung zweimal mit 10 mL Chloroform, schüttelt energisch für 1 min jedes Mal zu extrahieren. Denken Sie daran, den separatory Trichter zum Druckaufbau lösen gelegentlich entlüften. (Hinweis: eine gute Extraktion findet nur statt, wenn es eine Menge von flüssig-flüssig Kontakt zwischen den Phasen gibt).
  9. Das Chloroform in einem sauberen, trockenen 100 mL gekennzeichneten Becherglas zu sammeln. Chloroform hat eine Dichte von in der Nähe von 1,5 g/cm3, so dass die untere Schicht ist. Es darf keine Spur von gelber Farbe links in der wässrigen Phase nach eine vollständige Extraktion.
  10. Die kombinierte Chloroform Auszug aus jedem Becherglas in ihre jeweiligen volumetrische 25-mL-Flasche zu übertragen und bis zur Markierung mit Chloroform verdünnen. Achten Sie darauf, Stopper in jedem volumetrischen Kolben Chloroform aus verdampfen zu platzieren.
  11. Fügen Sie ~ 1 g wasserfreies Natriumsulfat (Na2SO4) zu jedem der sechs 100-mL-Becher aus Schritt 2,9. Das Natriumsulfat hilft jede Spur von Wasser zu entfernen, die möglicherweise in der Chloroform-Extrakt.
  12. Übertragen Sie die Lösungen zurück zu ihren respektierten Becher. Schwenken Sie vorsichtig um Austrocknung von Wasser in der Probe zu erleichtern.
  13. Die Chloroform-Extrakte in eine Quarz Fluorimeter Zelle Dekantieren (Hinweis: Chloroform löst eine Kunststoff-Polystyrol-Zelle).

3. Auswahl der Erregung Wellenlänge

Bestimmen Sie die Anregung und Emission Wellenlängen durch Ausführen von Scans, dann einfach lesen Sie ab und zeichnen Sie der Fluoreszenzintensität aller Proben auf diese Werte auf. Die Anregung und Emission Bandbreiten sind voreingestellt, bei 5 nm. Der Komplex nimmt im nahen UV, so die Erregung Wellenlänge sollte etwa 385 nm. Zunächst, überwachen die Fluoreszenz bei 500 nm im Bereich Emission.

  1. Auf die Fluorimeter stellen Sie sicher, dass sowohl die inneren und äußeren Lüfter in die Fluorimeter vor Einschalten der Xenon-Lampe eingeschaltet sind. Die Xenon-Lampe sehr heiß und benötigt ständige Kühlung.
  2. Schalten Sie die Hochspannung (HV) an den PMT-Detektor auf 400 V.
  3. Öffnen der Rollläden.
  4. Die Daten-Übernahme-Programm auf dem Computer zu öffnen, hier ist es "100nmFluorScan".
  5. Legen Sie die "Sample + 2 mL hinzugefügt" (2) Lösung in die Quarz-Zelle, für die Bestimmung der besten Anregung und Emission Wellenlängen zu verwenden.
  6. Mit der Emissionswellenlänge anfänglich bei 500 nm, einen Erregung Scan von 335-435 nm mit einer Scangeschwindigkeit von 2 nm/s laufen.
  7. Bestimmen Sie aus dem daraus resultierenden Fluoreszenz-Plot die maximale Fluoreszenz Erregung Wellenlänge (EXλmax), und legen Sie das Gerät auf diesen Wert.

4. Auswahl der Emissionswellenlänge

  1. Legen Sie die Emissionswellenlänge Fluorimeter auf 450 nm.
  2. Die Emission Wellenlängenbereich um einen 100 nm Scan von 450-550 nm eingestellt.
  3. Um den Scan zu starten, klicken Sie die Schaltfläche "Start Test" auf dem Programm zur gleichen Zeit drücken die Schaltfläche "START" auf der Vorderseite der Fluorimeter.
  4. Bestimmen Sie aus dem daraus resultierenden Fluoreszenz-Plot die maximale Fluoreszenz Emissionswellenlänge (EMλmax) , und legen Sie das Gerät auf diesen Wert (Abbildung 2).

Figure 2
Abbildung 2. Bestimmung der optimalen EXλmax und EMλMax. Wellenlängen.

5. Messung der Fluoreszenz der Proben

  1. Alle Proben werden in EMλmax und EXλmaxausgeführt. Scans sind nicht für jede Probe, sondern nur der Fluoreszenz-Wert bei diesen Bedingungen erforderlich. Beginnend mit der am meisten verdünnten Probe (leer), Ort in einer Quarz-Zelle und dann im Instrument. Die fluoreszente Intensität in Lab Notebook aufzeichnen.
  2. Wiederholen Sie für alle anderen Proben.
  3. Denken Sie daran, dass die Relative Intensität der jeweiligen Lösung vor dem Erstellen des Diagramms Kalibrierung die leere Relative Intensität subtrahiert werden muss.

6. erstellen Standard Zusatz-Grundstück

  1. Plot der Fluoreszenzintensität vs. µg von Al3 + hinzugefügt.
  2. Bestimmen Sie den kleinste-Quadrate-Wert der daraus resultierende Handlung, und zeichnen Sie die Steigung und Achsenabschnitt.
  3. Bestimmen der µg von Al3 + in der unbekannten Probe aus der Gleichung µg von Al3 + = -b/m
  4. Wissend, dass die unbekannte Aluminium ein Volumen von 25,0 mL hinzugefügt, um jede Probe hatte, bestimmen Sie die Konzentration von Aluminium in das unbekannte.

Die Methode der standard Addition ist eine Quantitative Analyse-Technik verwendet, Matrix-Effekte zu minimieren, die Analyten Messsignale stören.

Unbekannte Komponente Konzentrationen sind oft durch eine Reihe von analytischen Techniken, wie Licht-Spektroskopie, Massenspektrometrie und Elektrochemie aufgeklärt. Jedoch die Messung kann durch andere Komponenten in der Probe, genannt die Matrix beeinflusst werden und dazu führen, dass die unbeabsichtigte Reduzierung oder Verstärkung des Signals, Matrix-Effekte bezeichnet. Diese Effekte können Ergebnisse verzerren und verursachen erhebliche Fehler in der Analyse.

Die Methode der standard Addition einsetzbar, Matrix-Effekte auf Messsignale zu minimieren. Dies erfolgt durch die Probe präzise Volumen einer bekannten Analyt-Lösung hinzufügen.

Dieses Video wird vermittelt Grundkenntnisse über die Normen Methode, und zeigen Sie, wie die Technik im Labor mit einer Fluoreszenzmessung durchführen.

Matrix-Effekte können in komplexen Proben entstehen wo eine Anzahl von anderen Molekülen mit den Analyten interagieren. Beispielsweise kann dies auftreten, wenn Moleküle binden oder mit den Analyten, verändert dadurch seine Fähigkeit zur Fluoreszenz agglomerieren. Oder die Matrix die Ionenstärke der Gesamtlösung, spezifische Eigenschaften des Analyten ändern ändern kann.

Um diese Effekte mit der Methode der standard hinaus zu mindern, wird eine Reihe von Bänden eine Standardlösung Analyten gleiche Volumina der Probe hinzugefügt. Die Lösung-Volumes werden dann gleich mit Lösungsmittel hergestellt.

Dann wird das Signal für die Proben mit und ohne standard gemessen. Die Daten werden als Intensität im Vergleich zu den Betrag standard hinzugefügt , die Probe, anstatt einer klassischen Kalibrationskurve gezeichnet. Die tatsächliche Konzentration des Analyten in jedem gegebenen Kolben wird durch die folgende Gleichung definiert. Die instrumentelle Reaktion entspricht manchmal konstante Konzentration des Analyten. Die resultierende Gleichung nimmt die linearen Form y = Mx + b. Damit, wenn die Handlung auf Absorption Null extrapoliert wird, ist das konstante Glied gleich die unbekannte Konzentration der Probe.

Die Signal Parzelle hat linear über den Konzentrationsbereich von Belang sein. Der Eingriff sollte auch nicht als das Verhältnis des Analyten auf Probe Matrix Veränderungen variieren. Schließlich sollte die Matrix selbst keine Messsignale auf eigene erzeugen.

Folgende Studien Aluminium, eine Art nicht-fluoreszierende durch Experimentieren reagiert es mit 8-Hydroxychinolin oder 8HQ, um die fluoreszierenden ALQ3 komplexe zu bilden.

Die Fluoreszenz des Aluminiums Komplex in einem organischen Lösungsmittel wird gemessen und dann im Zusammenhang mit der Konzentration der original Aluminium-Lösung. Diese Vorgehensweise ist üblich in der Analyse von Metallionen.

Nun, die Grundlagen der Methode der standard Zusatz umrissen worden, und die Grundlagen des Experiments erklärt, führen wir die Technik im Labor.

Zunächst bereiten Sie die 100 ppm Aluminium-Stammlösung in Wasser, und dann verwenden Sie, um eine Standardlösung 1 ppm vorbereiten.

Fügen Sie 2 g 8-Hydroxychinolin oder 8HQ, um eine volumetrische 100 mL-Flasche.

Vorsichtig 5,74 mL Eisessig hinzufügen, dann auf den 100-mL-Markierung mit entionisiertem Wasser verdünnen. Dieser Schritt ermöglicht die 8HQ in der wässrigen Phase aufzulösen.

Als nächstes bereiten Sie den Puffer durch eine markierte 100-mL-Flasche 20 g Ammoniumacetat und 7 mL 30 % Ammonium Hydroxid hinzufügen und verdünnen. Überprüfen Sie den pH-Wert mit einem pH-Indikator-Stock. Dieser Puffer hilft die Säure in der 8HQ-Lösung in Kombination zu neutralisieren.

Anderen Reagenzien benötigt wasserfreies Natriumsulfat und photometrische Grade Chloroform enthalten.

Nun bereiten Sie die Proben in diesem Fall durch die Extraktion der wässrigen Probe in die organische Phase mit flüssig-flüssig-Extraktion. Legen Sie sechs 125 mL separatory Trichter auf Ring-Ständer Ringe in der Kapuze. Stellen Sie sicher, dass alle Gläser makellos sauber, wie schmutzige Gläser Ergebnisse verzerren wird. Gegenüber dem Vorquartal kennzeichnen die Trichter "leer", "0", "1", "2", "3" und "4".

Fügen Sie mithilfe einer Pipette 25 mL der Lösung unbekannter Aluminium zu jedem der fünf separatory Trichter mit der Bezeichnung "0" bis "4". Vorbereiten des Rohlings durch Zugabe von 25 mL entionisiertem Wasser an den Trichter mit der Bezeichnung "blank".

Fügen Sie 1, 2, 3 und 4 mL 1-ppm-Standardlösung für die entsprechenden nummerierten Trichter. Fügen Sie keine Standardlösung, die leer oder 0 Trichter.

Fügen Sie 1 mL der Lösung 8HQ und 3 mL Pufferlösung zu jedem der 6 Teile herstellen.

Führen Sie eine flüssig-flüssig-Extraktion durch Zugabe von 10 mL Chloroform zu jedem Kolben. Schütteln Sie den Trichter kräftig, und gelegentlich entlüften Sie den Trichter zum Druckaufbau zu lösen. Setzen Sie den Trichter zurück in den Ring und lassen Sie die flüssigen Schichten trennen.

Als nächstes sammeln Sie die Chloroform-Phase in eine sauber, trocken und beschrifteten 100-mL-Becherglas. Da Chloroform eine höhere Dichte als Wasser hat, ist es die untere Schicht in den Trichter.

Übertragen des Chloroform-Extraktes in eine volumetrische 25-mL-Flasche und Kappe jedem Kolben um Verdunstung zu verhindern.

Führen Sie eine zweite flüssig-flüssig-Extraktion auf die verbleibenden wässrige Lösung durch Zugabe von 10 mL Chloroform zu jeder Trichter. Schütteln Sie den Trichter, wie früher, um alle verbleibenden Analyten zu Chloroform Phase zu übertragen. Es darf keine gelbe Farbe, die Links in der oberen wässrigen Phase.

Wiederholen Sie die zweite Extraktion für jeden Trichter, dann sammeln Sie die Chloroform-Phasen in entsprechenden Becher beschriftet. Die gesammelten Chloroform in ihren jeweiligen volumetrische Flaschen gießen, und bis zur Markierung mit frischem Chloroform verdünnen.

Um Spur Wasser zu entfernen, fügen Sie etwa 1 g wasserfreies Natriumsulfat zu jedem der sechs 100-mL-Becher. Übertragen Sie die Lösungen wieder in ihre jeweiligen Becher und wirbeln um die Austrocknung der Probe zu erleichtern.

Dekantieren des Chloroform-Extraktes in einen Quarz Fluorimeter Zelle.

Richten Sie die Fluorimeter gemäß den Anweisungen des Herstellers und stellen Sie die Spannung bis 400 V. Öffnen Sie anschließend die Daten-Übernahme-Programm auf dem Computer.

Verwenden Sie Beispiel 2 die beste Anregung und Emission Wellenlängen bestimmen. Legen Sie die Emissionswellenlänge auf 500 nm, und führen Sie eine Anregung von 335-435 nm mit einer Scangeschwindigkeit von 2 nm/s scannen.

Bestimmen Sie aus dem Fluoreszenz-Plot die maximale Wellenlänge für Erregung. Legen Sie das Gerät auf diesen Erregung Wellenlänge Wert, in diesem Fall 399 nm.

Bestimmen Sie als nächstes die Emissionswellenlänge von durchführen eines Scans von 450-550 nm. Bestimmen Sie aus dem daraus resultierenden Fluoreszenz-Plot die maximale Wellenlänge und die Emissionswellenlänge in diesem Fall 520 nm.

Messen Sie jede Probe, einschließlich des Rohlings bei ausgewählten Anregung und Emission Wellenlänge. Notieren Sie jede Fluoreszenz Intensität lesen.

Subtrahieren Sie die gemessenen Fluoreszenz der leeren Probe von jedem anderen 5 Proben.

Plot der Fluoreszenzintensität von jeder der fünf Proben im Vergleich zu der Menge an Aluminium hinzugefügt, um die Probe. Bestimmen Sie den Wert der kleinsten Quadrate der daraus resultierende Handlung, und zeichnen Sie die Steigung und Achsenabschnitt.

Die Handlung der Fluoreszenzintensität vs. Anteil an Aluminium hinzugefügt ergab eine Least-Square-Linie, wie gezeigt. Die Menge an Aluminium in der Probe kann dann mit dieser Zeile berechnet werden. Da die Menge der unbekannten hinzugefügt 25 mL, den ermittelten Wert war dividiert durch 25 mL 2.916 μg. Dies gibt ein Endergebnis von 0.117 μg/mL oder 0,117 ppm. Dies ist ganz in der Nähe des bekannten Werts von 0,110 ppm.

Nun, schauen wir uns einige andere analytische Techniken, die Ergebnisse durch Matrixeffekte verdreht haben können.

Atom-Absorptions-Spektroskopie ist eine analytische Methode, die die Absorption des Lichtes durch ein Ziel Analyten in der Gasphase misst. Für die meisten Proben kann eine einfache Kalibrierungskurve im Zusammenhang mit Absorption zu Probenkonzentration, als eine zuverlässige Methode zur Quantifizierung einer unbekannten Konzentration dienen.

Allerdings kann diese Technik Genauigkeit verlieren, wenn andere Komponenten des Gemisches mit dem Ziel Analyten interagieren und unterdrücken oder Absorption verbessern. Die Methode kann in diesem Fall verwendet werden, um die Auswirkungen dieser Interaktionen, vor allem in Proben zu berücksichtigen, wo die Matrix vor der Analyse entfernt werden kann.

Gerätekalibrierung spielt eine entscheidende Rolle in der Genauigkeit einer Messung. Die Methode der standard Addition wird häufig verwendet, um bei der Kalibrierung von Instrumenten zu unterstützen, wie z. B. ICP-MS., ICP-MS ist eine Vergleichsmethode, was bedeutet, dass die Messung von einer unbekannten Probe auf die Messung einer Chemikalie standard basiert.

So kann nicht die Messunsicherheit eines unbekannten eine besser als die Unsicherheit der Kalibrierung sein. Die Methode der standard Addition kann daher eine Eichkurve erstellen, die die ist genauer als die standard-Methode, und Konten für Matrix-Interaktionen in der Probe, verwendet werden.

Viele biologische Moleküle sind mittels Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie oder HPLC analysiert. HPLC ist eine Technik, die trennt und analysiert komplexe Mischungen auf der Grundlage Molekül Eigenschaften wie Polarität, Ladung und Größe. Die Zeit an der Analyten die Spalte verlässt ermöglicht dem Benutzer, jede Komponente in der Mischung zu identifizieren.

Biologische Moleküle können oft in einem Gemisch interagieren und sind stark betroffen von der Matrix, die, der Sie in ausgesetzt sind. Oft dient die Methode der standard Addition eine Kalibrationskurve diese Konten für diese Affekte erstellen.

Sie habe nur Jupiters Einführung in die Methode der standard hinaus beobachtet. Sie sollte jetzt verstehen, wie man die Technik um Matrixeffekte in Probenanalyse zu berücksichtigen.

Danke fürs Zuschauen!

Results

Ein Scan der Erregung Wellenlänge von 335-435 zeigte die höchste Absorption bei 399 nm, so die Erregung Monochromator für diesen Wert festgelegt wurde. Dann die Emission-Scan von 450-550 nm durchgeführt wurde, und das stärkste Signal erwies sich bei 520 nm. Dies sind die Wellenlängen, die für alle Beispiele verwendet werden.

Probe Fluoreszenzintensität Korrigierte Fluoreszenzintensität
Leere 0,008 0.000
Probe 0.128 0,120
Probe + 1 mL 0,167 0.159
Probe + 2 mL 0,220 0.212
Probe + 3 mL 0.260 0.252
Probe + 4 mL 0.290 0.282

Ein Grundstück von Fluoreszenz (Abbildung 3) vs. µg von Al3 + hinzugefügt (Abbildung 4) ergab eine kleinste-Quadrate-Linie von:

Fluoreszenzintensität = 0.0417 x (µg von Al3 + hinzugefügt) + 0.1216

Betrag von Al3 + =-(Y-Int)/Steigung =-0.1216/0.0417-2.916 = µg/mL

Da die Menge der unbekannten hinzugefügt 25 mL war, dann muss der 2.916 µg/mL-Wert von 25 aufgeteilt werden.

Unbekannte Aluminium Konzentration = 2.916 µg/mL / 25,0 mL = 0.117 µg/mL = 0,117 ppm
Das ist ganz in der Nähe der tatsächliche Wert von 0,110 ppm (6,4 % Fehler).

Figure 3
Abbildung 3. Fluoreszenz der Proben.

Figure 4
Abbildung 4. Die standard Zusatz Kalibrierung Handlung.

Applications and Summary

Die Methode der standard Ergänzungen ist oft die Technik verwendet, wenn genaue quantitative Ergebnisse gewünscht sind, analytische Analyse wie Atomabsorption, Fluoreszenz-Spektroskopie, ICP-OES und Gaschromatographie verwendet. Dies wird oft verwendet, wenn es gibt andere Komponenten in der Probe von Interesse, die bewirkt, dass eine Verringerung oder Erweiterung der Extinktion für quantitative Ergebnisse gewünscht. Wenn dies der Fall ist, vergleichen nicht einer der Analyten Signal Standards mit dem traditionellen Kalibrierung Kurve Ansatz einfach. In der Tat sollte Matrix Effekt Bewertung ein obligatorischer Bestandteil der Validierungsverfahren.

Ein weiteres Beispiel, wo standard Zusätze verwendet werden können, ist bei der Gewinnung von Silber aus alten fotografischen Abfällen. Die Abfälle enthält Silber Halogenide und extrahiert werden kann, so dass das Silber zurückgefordert werden kann. Von Spick das unbekannte "Abfall" mit bekannten Mengen von Silber, kann diese Methode die Menge an Silber gewonnen aus dem fotografischen Film Vorhersagen.

Arbeitnehmer, die Fertigungsanlagen Benzol ausgesetzt sind werden oft getestet, um sicherzustellen, dass sie sicher unter dem akzeptierten Niveau von Benzol sind. Ihr Urin ist für die chemische getestet, und das ist der biologische Matrix. Darüber hinaus variiert die Höhe der Analyten Unterdrückung für verschiedene Leute so eine einzelnes Kalibrierung Kit nicht funktionieren. Mit der Methode der standard hinaus kann jeder Mitarbeiter getestet und genau ausgewertet werden.

1. Vorbereitung der Reagenzien

  1. 100 ppm Al3 + Standardlösung: auflösen 0,9151 g Aluminium Nitrat (Al (Nr.3)3•9H2O) in eine volumetrische 1-L-Flasche mit VE-Wasser.
  2. 8HQ Lösung in 1 M Essigsäure (2 % wt/Vol): eine volumetrische 100 mL-Flasche 2,0 g 8-Hydroxychinolin hinzufügen.
  3. Sorgfältig fügen Sie 5,74 mL Eisessig in den 100-mL-Kolben, dann bis zur Markierung mit VE-Wasser zu verdünnen. Dies ermöglicht das 8-Hydroxychinolin in wässrigen Phase aufzulösen.
  4. 1 M NH4+/NH3 Puffer (pH ~ 8): eine 100-mL-Flasche 20 g Ammoniumacetat (NH4OAc) hinzufügen.
  5. Diese 100-mL-Flasche 7 mL 30 % Ammonium Hydroxid hinzu, und bis zur Markierung mit VE-Wasser zu verdünnen. Auf diese Weise neutralisieren die Säure in der 8HQ-Lösung kombiniert.
  6. Anderen Reagenzien enthalten wasserfreiem Natriumsulfat (Na2SO4) und Chloroform (Spec Klasse).

2. Vorbereitung der Proben

  1. Bereiten Sie eine 1,00 ppm standard Al3 + Lösung durch Zugabe von 1,0 mL 100 ppm Lager Al3 + Lösung mit einer Pipette in ein 100 mL volumetrischen Kolben.
  2. Legen Sie sechs 125 mL separatory Trichter auf die Ringe, die auf einem großen Ring-Stand befindet sich in der Haube sind. Sie sollte wie folgt beschriftet: BL, 0, 1, 2, 3, 4. sicherstellen, dass alle Gläser ist absolut sauber, da es schwierig ist, quantitative Ergebnisse zu erzielen, wenn kleine Perlen aus Chloroform an den Wänden der Glaswaren bleiben.
  3. Die fünf separatory Trichter mit der Bezeichnung 0, 1, 2, 3, 25,00 mL der unbekannten Al3 + Lösung hinzufügen & 4. In diesem Beispiel ist die unbekannte Konzentration 0,110 ppm.
  4. Fügen Sie 0, 1.00, 2.00, 3.00 und 4,00 mL 1,00-ppm Al3 + Standardlösung hinzu, bzw. die 5 Trichter mit einer 1-mL-Pipette.
  5. Bereiten Sie eine leere indem 25,00 mL destilliertem Wasser zu den separatory Trichter mit der Bezeichnung Bl.
  6. Fügen Sie 1,0 mL der Lösung mit einer Pipette 8-Hydroxychinolin hinzu, jede der sechs Lösungen.
  7. 3,0 mL Pufferlösung mit einer Pipette zu jedem der sechs Lösungen hinzugeben.
  8. Jede Lösung zweimal mit 10 mL Chloroform, schüttelt energisch für 1 min jedes Mal zu extrahieren. Denken Sie daran, den separatory Trichter zum Druckaufbau lösen gelegentlich entlüften. (Hinweis: eine gute Extraktion findet nur statt, wenn es eine Menge von flüssig-flüssig Kontakt zwischen den Phasen gibt).
  9. Das Chloroform in einem sauberen, trockenen 100 mL gekennzeichneten Becherglas zu sammeln. Chloroform hat eine Dichte von in der Nähe von 1,5 g/cm3, so dass die untere Schicht ist. Es darf keine Spur von gelber Farbe links in der wässrigen Phase nach eine vollständige Extraktion.
  10. Die kombinierte Chloroform Auszug aus jedem Becherglas in ihre jeweiligen volumetrische 25-mL-Flasche zu übertragen und bis zur Markierung mit Chloroform verdünnen. Achten Sie darauf, Stopper in jedem volumetrischen Kolben Chloroform aus verdampfen zu platzieren.
  11. Fügen Sie ~ 1 g wasserfreies Natriumsulfat (Na2SO4) zu jedem der sechs 100-mL-Becher aus Schritt 2,9. Das Natriumsulfat hilft jede Spur von Wasser zu entfernen, die möglicherweise in der Chloroform-Extrakt.
  12. Übertragen Sie die Lösungen zurück zu ihren respektierten Becher. Schwenken Sie vorsichtig um Austrocknung von Wasser in der Probe zu erleichtern.
  13. Die Chloroform-Extrakte in eine Quarz Fluorimeter Zelle Dekantieren (Hinweis: Chloroform löst eine Kunststoff-Polystyrol-Zelle).

3. Auswahl der Erregung Wellenlänge

Bestimmen Sie die Anregung und Emission Wellenlängen durch Ausführen von Scans, dann einfach lesen Sie ab und zeichnen Sie der Fluoreszenzintensität aller Proben auf diese Werte auf. Die Anregung und Emission Bandbreiten sind voreingestellt, bei 5 nm. Der Komplex nimmt im nahen UV, so die Erregung Wellenlänge sollte etwa 385 nm. Zunächst, überwachen die Fluoreszenz bei 500 nm im Bereich Emission.

  1. Auf die Fluorimeter stellen Sie sicher, dass sowohl die inneren und äußeren Lüfter in die Fluorimeter vor Einschalten der Xenon-Lampe eingeschaltet sind. Die Xenon-Lampe sehr heiß und benötigt ständige Kühlung.
  2. Schalten Sie die Hochspannung (HV) an den PMT-Detektor auf 400 V.
  3. Öffnen der Rollläden.
  4. Die Daten-Übernahme-Programm auf dem Computer zu öffnen, hier ist es "100nmFluorScan".
  5. Legen Sie die "Sample + 2 mL hinzugefügt" (2) Lösung in die Quarz-Zelle, für die Bestimmung der besten Anregung und Emission Wellenlängen zu verwenden.
  6. Mit der Emissionswellenlänge anfänglich bei 500 nm, einen Erregung Scan von 335-435 nm mit einer Scangeschwindigkeit von 2 nm/s laufen.
  7. Bestimmen Sie aus dem daraus resultierenden Fluoreszenz-Plot die maximale Fluoreszenz Erregung Wellenlänge (EXλmax), und legen Sie das Gerät auf diesen Wert.

4. Auswahl der Emissionswellenlänge

  1. Legen Sie die Emissionswellenlänge Fluorimeter auf 450 nm.
  2. Die Emission Wellenlängenbereich um einen 100 nm Scan von 450-550 nm eingestellt.
  3. Um den Scan zu starten, klicken Sie die Schaltfläche "Start Test" auf dem Programm zur gleichen Zeit drücken die Schaltfläche "START" auf der Vorderseite der Fluorimeter.
  4. Bestimmen Sie aus dem daraus resultierenden Fluoreszenz-Plot die maximale Fluoreszenz Emissionswellenlänge (EMλmax) , und legen Sie das Gerät auf diesen Wert (Abbildung 2).

Figure 2
Abbildung 2. Bestimmung der optimalen EXλmax und EMλMax. Wellenlängen.

5. Messung der Fluoreszenz der Proben

  1. Alle Proben werden in EMλmax und EXλmaxausgeführt. Scans sind nicht für jede Probe, sondern nur der Fluoreszenz-Wert bei diesen Bedingungen erforderlich. Beginnend mit der am meisten verdünnten Probe (leer), Ort in einer Quarz-Zelle und dann im Instrument. Die fluoreszente Intensität in Lab Notebook aufzeichnen.
  2. Wiederholen Sie für alle anderen Proben.
  3. Denken Sie daran, dass die Relative Intensität der jeweiligen Lösung vor dem Erstellen des Diagramms Kalibrierung die leere Relative Intensität subtrahiert werden muss.

6. erstellen Standard Zusatz-Grundstück

  1. Plot der Fluoreszenzintensität vs. µg von Al3 + hinzugefügt.
  2. Bestimmen Sie den kleinste-Quadrate-Wert der daraus resultierende Handlung, und zeichnen Sie die Steigung und Achsenabschnitt.
  3. Bestimmen der µg von Al3 + in der unbekannten Probe aus der Gleichung µg von Al3 + = -b/m
  4. Wissend, dass die unbekannte Aluminium ein Volumen von 25,0 mL hinzugefügt, um jede Probe hatte, bestimmen Sie die Konzentration von Aluminium in das unbekannte.

Die Methode der standard Addition ist eine Quantitative Analyse-Technik verwendet, Matrix-Effekte zu minimieren, die Analyten Messsignale stören.

Unbekannte Komponente Konzentrationen sind oft durch eine Reihe von analytischen Techniken, wie Licht-Spektroskopie, Massenspektrometrie und Elektrochemie aufgeklärt. Jedoch die Messung kann durch andere Komponenten in der Probe, genannt die Matrix beeinflusst werden und dazu führen, dass die unbeabsichtigte Reduzierung oder Verstärkung des Signals, Matrix-Effekte bezeichnet. Diese Effekte können Ergebnisse verzerren und verursachen erhebliche Fehler in der Analyse.

Die Methode der standard Addition einsetzbar, Matrix-Effekte auf Messsignale zu minimieren. Dies erfolgt durch die Probe präzise Volumen einer bekannten Analyt-Lösung hinzufügen.

Dieses Video wird vermittelt Grundkenntnisse über die Normen Methode, und zeigen Sie, wie die Technik im Labor mit einer Fluoreszenzmessung durchführen.

Matrix-Effekte können in komplexen Proben entstehen wo eine Anzahl von anderen Molekülen mit den Analyten interagieren. Beispielsweise kann dies auftreten, wenn Moleküle binden oder mit den Analyten, verändert dadurch seine Fähigkeit zur Fluoreszenz agglomerieren. Oder die Matrix die Ionenstärke der Gesamtlösung, spezifische Eigenschaften des Analyten ändern ändern kann.

Um diese Effekte mit der Methode der standard hinaus zu mindern, wird eine Reihe von Bänden eine Standardlösung Analyten gleiche Volumina der Probe hinzugefügt. Die Lösung-Volumes werden dann gleich mit Lösungsmittel hergestellt.

Dann wird das Signal für die Proben mit und ohne standard gemessen. Die Daten werden als Intensität im Vergleich zu den Betrag standard hinzugefügt , die Probe, anstatt einer klassischen Kalibrationskurve gezeichnet. Die tatsächliche Konzentration des Analyten in jedem gegebenen Kolben wird durch die folgende Gleichung definiert. Die instrumentelle Reaktion entspricht manchmal konstante Konzentration des Analyten. Die resultierende Gleichung nimmt die linearen Form y = Mx + b. Damit, wenn die Handlung auf Absorption Null extrapoliert wird, ist das konstante Glied gleich die unbekannte Konzentration der Probe.

Die Signal Parzelle hat linear über den Konzentrationsbereich von Belang sein. Der Eingriff sollte auch nicht als das Verhältnis des Analyten auf Probe Matrix Veränderungen variieren. Schließlich sollte die Matrix selbst keine Messsignale auf eigene erzeugen.

Folgende Studien Aluminium, eine Art nicht-fluoreszierende durch Experimentieren reagiert es mit 8-Hydroxychinolin oder 8HQ, um die fluoreszierenden ALQ3 komplexe zu bilden.

Die Fluoreszenz des Aluminiums Komplex in einem organischen Lösungsmittel wird gemessen und dann im Zusammenhang mit der Konzentration der original Aluminium-Lösung. Diese Vorgehensweise ist üblich in der Analyse von Metallionen.

Nun, die Grundlagen der Methode der standard Zusatz umrissen worden, und die Grundlagen des Experiments erklärt, führen wir die Technik im Labor.

Zunächst bereiten Sie die 100 ppm Aluminium-Stammlösung in Wasser, und dann verwenden Sie, um eine Standardlösung 1 ppm vorbereiten.

Fügen Sie 2 g 8-Hydroxychinolin oder 8HQ, um eine volumetrische 100 mL-Flasche.

Vorsichtig 5,74 mL Eisessig hinzufügen, dann auf den 100-mL-Markierung mit entionisiertem Wasser verdünnen. Dieser Schritt ermöglicht die 8HQ in der wässrigen Phase aufzulösen.

Als nächstes bereiten Sie den Puffer durch eine markierte 100-mL-Flasche 20 g Ammoniumacetat und 7 mL 30 % Ammonium Hydroxid hinzufügen und verdünnen. Überprüfen Sie den pH-Wert mit einem pH-Indikator-Stock. Dieser Puffer hilft die Säure in der 8HQ-Lösung in Kombination zu neutralisieren.

Anderen Reagenzien benötigt wasserfreies Natriumsulfat und photometrische Grade Chloroform enthalten.

Nun bereiten Sie die Proben in diesem Fall durch die Extraktion der wässrigen Probe in die organische Phase mit flüssig-flüssig-Extraktion. Legen Sie sechs 125 mL separatory Trichter auf Ring-Ständer Ringe in der Kapuze. Stellen Sie sicher, dass alle Gläser makellos sauber, wie schmutzige Gläser Ergebnisse verzerren wird. Gegenüber dem Vorquartal kennzeichnen die Trichter "leer", "0", "1", "2", "3" und "4".

Fügen Sie mithilfe einer Pipette 25 mL der Lösung unbekannter Aluminium zu jedem der fünf separatory Trichter mit der Bezeichnung "0" bis "4". Vorbereiten des Rohlings durch Zugabe von 25 mL entionisiertem Wasser an den Trichter mit der Bezeichnung "blank".

Fügen Sie 1, 2, 3 und 4 mL 1-ppm-Standardlösung für die entsprechenden nummerierten Trichter. Fügen Sie keine Standardlösung, die leer oder 0 Trichter.

Fügen Sie 1 mL der Lösung 8HQ und 3 mL Pufferlösung zu jedem der 6 Teile herstellen.

Führen Sie eine flüssig-flüssig-Extraktion durch Zugabe von 10 mL Chloroform zu jedem Kolben. Schütteln Sie den Trichter kräftig, und gelegentlich entlüften Sie den Trichter zum Druckaufbau zu lösen. Setzen Sie den Trichter zurück in den Ring und lassen Sie die flüssigen Schichten trennen.

Als nächstes sammeln Sie die Chloroform-Phase in eine sauber, trocken und beschrifteten 100-mL-Becherglas. Da Chloroform eine höhere Dichte als Wasser hat, ist es die untere Schicht in den Trichter.

Übertragen des Chloroform-Extraktes in eine volumetrische 25-mL-Flasche und Kappe jedem Kolben um Verdunstung zu verhindern.

Führen Sie eine zweite flüssig-flüssig-Extraktion auf die verbleibenden wässrige Lösung durch Zugabe von 10 mL Chloroform zu jeder Trichter. Schütteln Sie den Trichter, wie früher, um alle verbleibenden Analyten zu Chloroform Phase zu übertragen. Es darf keine gelbe Farbe, die Links in der oberen wässrigen Phase.

Wiederholen Sie die zweite Extraktion für jeden Trichter, dann sammeln Sie die Chloroform-Phasen in entsprechenden Becher beschriftet. Die gesammelten Chloroform in ihren jeweiligen volumetrische Flaschen gießen, und bis zur Markierung mit frischem Chloroform verdünnen.

Um Spur Wasser zu entfernen, fügen Sie etwa 1 g wasserfreies Natriumsulfat zu jedem der sechs 100-mL-Becher. Übertragen Sie die Lösungen wieder in ihre jeweiligen Becher und wirbeln um die Austrocknung der Probe zu erleichtern.

Dekantieren des Chloroform-Extraktes in einen Quarz Fluorimeter Zelle.

Richten Sie die Fluorimeter gemäß den Anweisungen des Herstellers und stellen Sie die Spannung bis 400 V. Öffnen Sie anschließend die Daten-Übernahme-Programm auf dem Computer.

Verwenden Sie Beispiel 2 die beste Anregung und Emission Wellenlängen bestimmen. Legen Sie die Emissionswellenlänge auf 500 nm, und führen Sie eine Anregung von 335-435 nm mit einer Scangeschwindigkeit von 2 nm/s scannen.

Bestimmen Sie aus dem Fluoreszenz-Plot die maximale Wellenlänge für Erregung. Legen Sie das Gerät auf diesen Erregung Wellenlänge Wert, in diesem Fall 399 nm.

Bestimmen Sie als nächstes die Emissionswellenlänge von durchführen eines Scans von 450-550 nm. Bestimmen Sie aus dem daraus resultierenden Fluoreszenz-Plot die maximale Wellenlänge und die Emissionswellenlänge in diesem Fall 520 nm.

Messen Sie jede Probe, einschließlich des Rohlings bei ausgewählten Anregung und Emission Wellenlänge. Notieren Sie jede Fluoreszenz Intensität lesen.

Subtrahieren Sie die gemessenen Fluoreszenz der leeren Probe von jedem anderen 5 Proben.

Plot der Fluoreszenzintensität von jeder der fünf Proben im Vergleich zu der Menge an Aluminium hinzugefügt, um die Probe. Bestimmen Sie den Wert der kleinsten Quadrate der daraus resultierende Handlung, und zeichnen Sie die Steigung und Achsenabschnitt.

Die Handlung der Fluoreszenzintensität vs. Anteil an Aluminium hinzugefügt ergab eine Least-Square-Linie, wie gezeigt. Die Menge an Aluminium in der Probe kann dann mit dieser Zeile berechnet werden. Da die Menge der unbekannten hinzugefügt 25 mL, den ermittelten Wert war dividiert durch 25 mL 2.916 μg. Dies gibt ein Endergebnis von 0.117 μg/mL oder 0,117 ppm. Dies ist ganz in der Nähe des bekannten Werts von 0,110 ppm.

Nun, schauen wir uns einige andere analytische Techniken, die Ergebnisse durch Matrixeffekte verdreht haben können.

Atom-Absorptions-Spektroskopie ist eine analytische Methode, die die Absorption des Lichtes durch ein Ziel Analyten in der Gasphase misst. Für die meisten Proben kann eine einfache Kalibrierungskurve im Zusammenhang mit Absorption zu Probenkonzentration, als eine zuverlässige Methode zur Quantifizierung einer unbekannten Konzentration dienen.

Allerdings kann diese Technik Genauigkeit verlieren, wenn andere Komponenten des Gemisches mit dem Ziel Analyten interagieren und unterdrücken oder Absorption verbessern. Die Methode kann in diesem Fall verwendet werden, um die Auswirkungen dieser Interaktionen, vor allem in Proben zu berücksichtigen, wo die Matrix vor der Analyse entfernt werden kann.

Gerätekalibrierung spielt eine entscheidende Rolle in der Genauigkeit einer Messung. Die Methode der standard Addition wird häufig verwendet, um bei der Kalibrierung von Instrumenten zu unterstützen, wie z. B. ICP-MS., ICP-MS ist eine Vergleichsmethode, was bedeutet, dass die Messung von einer unbekannten Probe auf die Messung einer Chemikalie standard basiert.

So kann nicht die Messunsicherheit eines unbekannten eine besser als die Unsicherheit der Kalibrierung sein. Die Methode der standard Addition kann daher eine Eichkurve erstellen, die die ist genauer als die standard-Methode, und Konten für Matrix-Interaktionen in der Probe, verwendet werden.

Viele biologische Moleküle sind mittels Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie oder HPLC analysiert. HPLC ist eine Technik, die trennt und analysiert komplexe Mischungen auf der Grundlage Molekül Eigenschaften wie Polarität, Ladung und Größe. Die Zeit an der Analyten die Spalte verlässt ermöglicht dem Benutzer, jede Komponente in der Mischung zu identifizieren.

Biologische Moleküle können oft in einem Gemisch interagieren und sind stark betroffen von der Matrix, die, der Sie in ausgesetzt sind. Oft dient die Methode der standard Addition eine Kalibrationskurve diese Konten für diese Affekte erstellen.

Sie habe nur Jupiters Einführung in die Methode der standard hinaus beobachtet. Sie sollte jetzt verstehen, wie man die Technik um Matrixeffekte in Probenanalyse zu berücksichtigen.

Danke fürs Zuschauen!

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