内部标准

Analytical Chemistry

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Overview

资料来源: 实验室的博士 B.吉尔 Venton-弗吉尼亚大学

许多化学分析的目标是物质的定量分析,样品中的量物质的确定在哪里。为了准确地计算未知样品的浓度,小心样品制备是关键。每次处理或转移样品时,样品的一些可能会丢失。将样品损失降至最低,为战略。也有应对样品损失和仍然进行准确的测量浓度的战略。

为了尽量减少样品损失,理想是尽量的样品处理和转移步骤数。例如,直接进入解决方案将在烧瓶集结固体样品降低了转移步骤。如果有必要从一瓶转移到另一个,并被稀释,然后三清洗玻璃器皿有助于确保所有的样品转移。其他战略是更具体的样品。例如,一次性的聚丙烯管亦可能更好地处理样品吸附到玻璃,比如蛋白质。管不是样本的亲水,所以如果可以吸取水中极少量,它是样本的最好已经掺过水的管,所以可以直接进入溶剂吸取样品。它可能是更好地集中注意力,而不是完全干燥样品,从 insolubilities 再水化后的损失。

样品损失的另一个来源是通过不完整示例操作。例如,如果使用衍生过程和衍生化不完整,样品的全部数额是没有观察到。像这样的错误是系统误差,并通过纠正的问题,例如更改衍生过程就可以迎刃而解。在测量系统误差的另一个原因是基体效应。这些示例可以减少这种影响可以干涉测量的某些物质和表演校准在相同的矩阵。

定量分析通常进行使用外部或内部的标准。为外部标准,校准曲线是通过测量不同已知的浓度的感兴趣。然后,从标准分别运行示例。内部标准,该标准已经作为被测物的兴趣,使测量同时采取相同的样本。通常情况下,一个不同的物种添加内部标准和比例的响应呼吁,内部的标准和计算分析物。这个想法是反应,称为响应因子,比他们的浓度成正比。方法必须能够区分的利益被分析物和内部标准,任何样品损失发生后添加的内部标准应该是类似的两种物质,而因此响应的比率保持不变。使用内部标准的一个特殊情况是标准的附加,哪里添加到解决方案中越来越多的被分析物和原始的分析物量反算的方法。内部标准可用于色谱法、 电化学和光谱。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 分析化学精要. 内部标准. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Principles

内部的标准是在一个恒定量添加到样品,空白,并在分析标准物质。内部的标准可以弥补系统和随机误差。例如,如果有引起随机误差测量中的仪器波动,这些波动预计将相同的内部标准和被分析物和因此信号的比例并不改变。系统错误,如溶剂、 基体效应,只要效果等于标准和被分析物,比再一次不受影响。

内部标准的缺点是很难找到一个合适的内部标准。内部的标准必须是类似于被分析物,但足够不同,它可以区分由仪器的信号。此外,内部标准不应本样品基质中,以便添加的标准是标准的唯一来源。偶尔,是恒定的浓度在样本的主要成分可以用作内部的标准,而不是添加的标准,但浓度必须那构成而闻名。内部标准也不应抑制或增强信号的分析物。

在色谱中,错误的最大来源之一往往是注射。如果使用手动注射,在正确加载注射器可以有错误。卷是通常很小 (~ 1 µ L) 所以在重复性注射体积这小,经常几个百分比的相对标准偏差 (RSD) 有不确定性。在气相色谱 (GC),样品被注入加热的端口和蒸发从针尖可以导致体积的变化。自动取样器帮助与错误在加载注射器和注射错误快速避免蒸发在 GC,但错误仍然可以 1-2 %rsd。用色谱法,峰面积是一般用作峰值高度峰获得更广泛和更短的时间,但是是恒定的峰面积。因此,内部标准,峰面积的比值是而不是峰值高度色谱法中使用的。

内标校正,计算了响应因子。响应因子 (R) 是其中 X 是 IS 与分析物的浓度比相比的山峰比内部标准。

Equation 1

用于色谱 (A) 区。可以从X/A 校正标度图计算响应因子vs CX/CIS,哪里响应因子是斜率和 y 轴截距被假定为 0。一旦响应因子而闻名的标准,然后可以从实验的实测的面积比计算未知的响应。

Equation 2

Procedure

1.适当的样品处理: 制作解决方案

  1. 带上干净的烧杯和大众正确的样品量到它。记录实际的大规模使用。在此示例中,腺嘌呤的解决方案是在容量瓶作为一种内部的标准用于下一个分析。腺嘌呤的质量是 100 毫克。做不直接大规模到容量瓶,因为它有一个长脖子和腺嘌呤不能轻松地添加或删除。
  2. 添加约 25 毫升的溶剂 (在这种情况下二甲基亚砜 (DMSO)) 的烧杯和让它搅拌溶解。在此示例中,最后的解决办法是在 50 毫升的容量瓶,所以只添加约 25 毫升,所以可以冲洗烧杯和解决方案到最后卷组成。
  3. 一旦溶解固体,溶液倒入容量瓶。
  4. 冲洗烧杯和少量的溶剂,约 10 毫升,搅拌棒,倒入容量瓶的冲洗。重复两次以上。这有助于确保适当的解决方案转移。

2.内部标准校准曲线的制备

  1. 气相色谱法分析准备所需的标准样品。在此示例中,从咖啡用乙腈提取咖啡因和腺嘌呤然后作为一种内部的标准用于测量。
  2. 对于咖啡因的样本,称出 1 毫克/毫升样品所需的样品的取样量。如果使用 10 毫升的容量瓶,那是 10 毫克。
  3. 进一只量杯权衡分析物,添加几毫升的溶剂 (这里的甲醇) 以溶解,然后定量地转移到容量瓶使用 3 冲洗。
  4. 以类似的方式与 0.2、 0.5、 2 毫克/毫升咖啡因使 3 更多的标准。
  5. 放在每个咖啡因 1 毫升标准样品瓶。
  6. 添加到每个样品瓶 0.2 毫升的 2 毫克/毫升腺嘌呤内部标准。
  7. 与每个咖啡因标准运行气相色谱法测定实验。对于每个色谱图,计算的峰面积为咖啡因 vs 比标准。
  8. 绘制一个地区比 vs 的浓度比。那情节的斜率是响应因子。

3.与内部标准实际样品的制备气相色谱法

  1. 气相色谱法分析的准备所需的样品。在此示例中,咖啡因被提取使用 acetrontrile 的咖啡。
  2. 有关咖啡的示例,大规模出的咖啡注入 100 mL 烧杯 2 g。记录了咖啡的准确重量。
  3. 向烧杯中添加 20 毫升的乙腈。
  4. 让它坐了 20 分钟,不断搅拌。
  5. 筛选出用漏斗滤纸咖啡的理由。
  6. 冲洗过滤纸 3 x 与少量的乙腈 (5 毫升)。
  7. 最后量度的滤液。它应该是大约 35 毫升。

4.运行示例并计算浓度

  1. 取 1 毫升的咖啡提取物样品,在小瓶中添加 0.2 毫升的内部标准。将小瓶放入自动取样器机架。
  2. 运行的样品的气相色谱分析。请确保 GC 条件这样的咖啡因和腺嘌呤分开。在此示例中,等温分色被执行在 200 ° c。
  3. 经过分析,计算分析物的峰和内标峰的峰面积。使用他们的比率,计算样品中咖啡因的量。

5.咖啡因的内部标准结果: 气相色谱分析

  1. 咖啡因的气相色谱分析如图 1所示。腺嘌呤用作内部的标准。峰面积比可以测量和绘制 vs 浓度的比例。边坡是情节的响应因子 (在本例中 1.8)。
  2. 图 2显示了一份咖啡样品和腺嘌呤内部标准图谱。峰面积的比值是 1.78。使用响应因子和腺嘌呤 (0.33 毫克/毫升) 的已知的浓度,计算出未知样品中的咖啡因浓度是 0.33 毫克/毫升。

Figure 1
图 1。使用内标校正标度图。一块的面积比率 vs 浓度比值为 3 标准样品的咖啡因 (1,0.5 和 0.2 毫克/毫升) 0.33 毫克/毫升腺嘌呤内部标准添加到每个。直线的斜率是 1.8,即响应因子。

Figure 2
图 2。咖啡与腺嘌呤内部标准图谱。对样品的 FID 检测器响应一个阴谋。三个主峰是腺嘌呤 (IS),咖啡因和棕榈酸。

每次处理或转移,样品时,则会发生样品丢失从而难以准确计算的浓度。

为了确保准确性,样品损失的影响必须尽量减少使用小心样品制备和通过限制的样品处理和转移步骤数。然而,样品损失也可能会导致系统错误,如不完整的样本操作、 基体效应,以及在解析过程中的变化。

这些来源的损失可以占由加入已知的浓度的一种相似但不是相同,对感兴趣的化合物。这就被所谓的内部标准。发生内部标准的任何样品损失应该是类似的分析物,允许浓度精确计算。

此视频将说明内部标准和适当的实验室技术占样品损失确定的未知浓度时的使用。

内部的标准是一种添加已知量标准、 样本,和空白,在分析过程中的物质。

在色谱和光谱技术,信号的内部标准和被测物比率的计算。这一比率,称为响应因子,分析物和标准浓度的比值成正比。

反应系数,R,可以由下面的公式,其中代表分析信号的样本和内部标准和 C 表示的样品和内部标准浓度表示。

内部的标准可以弥补系统和随机误差。例如,随机误差 — — 如不一致时测量样品— —将相同的内部标准和被分析物。因此,它们的信号的比例不会改变。

系统错误,如在解决方案中,基体效应比会受影响,只要基体效应的作用是同酬标准和被分析物。

虽然内部标准带来巨大的好处,它可以很难选择一个合适的。内部的标准必须是相似但不是相同,对分析物的信号。它也不能影响任何方式分析物的测量。

最后,集中必须是众所周知的。这被通过确保内部的标准不以本机方式存在于样品;因此,它在溶液中的唯一来源是已知的浓度增加。

在下面的实验中,将用气相色谱测定咖啡因在未知样品的浓度。

这被通过创建使用已知的咖啡因的解决方案,与腺嘌呤为内标校准曲线。校准曲线的斜率等于响应因子。

一旦响应因子已知的可以从其测量的色谱面积比计算未知的浓度。

现在,您了解基本的内部标准,让我们看看过程。

开始执行程序,准确衡量 100 毫克的内部标准,腺嘌呤,到一个干净的烧杯。

接下来,溶于二甲基亚砜,大约 20 毫升和混合溶液。

一旦腺嘌呤已解散,则将溶液倒入 50 毫升容量瓶。

冲洗用二甲基亚砜,10 毫升的烧杯和搅拌栏和冲洗倒进瓶子里。重复此冲洗两次,以确保妥善解决转移。填充到校准的标记,造成内部标准与浓度为 2 毫克/毫升。

下一步,进一只量杯准备股票溶液重量 100 毫克的咖啡因。溶解少量的甲醇与咖啡因。然后,使用 3 冲洗到新鲜 25 毫升容量瓶转移此解决方案。这是 4 毫克/毫升股票解决方案。使用它来创建 3 咖啡因标准。

接下来,添加 0.2 毫升的内部标准,腺嘌呤,每个培养瓶。用甲醇填充每到最后一卷。将每个解决方案转移到样品瓶。

通过气相色谱仪运行每个咖啡因标准。计算峰面积与标准的腺嘌呤咖啡因的比。

第一,进 100 毫升烧杯,重 2 克的咖啡和记录重量。

接下来,添加 20 毫升的甲醇提取咖啡的咖啡因。让溶液搅拌 20 分钟。

使用布氏漏斗,过滤掉咖啡的理由。冲洗用少量甲醇,烧杯,倒入这个冲洗入漏斗。重复冲洗两次。

最后量度的滤液;它应该是大约 35 毫升。

为了准备分析样品,请将 1 毫升的咖啡提取物添加到样品瓶。然后,添加 0.2 毫升的腺嘌呤的内部标准,并将小瓶放入仪器的自动取样器机架。

运行的样品,确保条件这样的咖啡因和腺嘌呤是单独的气相色谱分析。

完成后进行分析,计算内部标准和被分析物的峰面积。

一旦所有样品进行都分析,标准校准曲线可以通过绘制的峰面积与浓度的比率的比率确定咖啡因/腺嘌呤解决方案。这条线,表示响应因子,边坡为 1.8。

接下来,从提取的咖啡样品的 GC 数据进行了分析。峰面积比值的计算结果是 1.78。使用响应因子和已知的浓度的内部标准,腺嘌呤,咖啡因在未知样品的浓度的计算结果是 0.33 毫克/毫升。

许多不同类型的反应,跨越各种科学的门徒,利用内部的标准,以尽量减少错误和样品损失的影响。

可以使用内部标准,保持其浓度比接近于常数最小样品制备过程中遇到的样品损失的影响。

在此示例中,生物活性脂质提取使用液-液萃取过程的裂解细胞。稳定同位素内部标准被添加在开始部分的萃取,占样品制备过程中的错误。

内部标准并非只有关键制备的生物活性的脂类成分,但也为分析。脂类分离使用高性能液相色谱法,并通过质谱分析。

在光谱学,内部标准可以帮助正确的随机误差的变化在光源强度。如果一盏灯或其它光源具有可变电源,它会影响吸收和因此,排放的一个样本。然而,内部标准对分析物的比例将保持不变,即使光源不。

在色谱中,误差最大的来源之一是注射。自动取样器帮助最小化,但错误仍可 1-2%相对标准偏差。

在此示例中,蒸气标准包含内部的标准分析了利用气相色谱法建立的校准曲线。这一次完成,然后可以测量未知的样品,样品的波动造成的损失占。

你刚看了朱庇特的简介内部标准。现在,您应该了解样品损失最小化、 内部标准和响应因子的最佳做法。

谢谢观赏 !

Applications and Summary

在许多领域,包括光谱和色谱法采用了内部标准。在光谱学,内部标准可以帮助正确的随机误差的变化在光源强度。如果一盏灯或其它光源具有可变电源,它会影响吸收和因此,排放的一个样本。然而,内部标准对分析物的比例将保持不变,即使光源不。这一示例使用锂 (Li) 作为一种内部的标准分析钠在血液样本中的火焰光谱法。李是化学上类似于钠,但不以本机方式发现血液中。

色谱,内部标准经常用于气相色谱法和高效液相色谱法。对于应用程序与质谱检测器,内部标准可以是利益的同位素标记物,以便分子量 (MW) 将不同被分析物。内部标准常用应用在制药或环境分析。

1.适当的样品处理: 制作解决方案

  1. 带上干净的烧杯和大众正确的样品量到它。记录实际的大规模使用。在此示例中,腺嘌呤的解决方案是在容量瓶作为一种内部的标准用于下一个分析。腺嘌呤的质量是 100 毫克。做不直接大规模到容量瓶,因为它有一个长脖子和腺嘌呤不能轻松地添加或删除。
  2. 添加约 25 毫升的溶剂 (在这种情况下二甲基亚砜 (DMSO)) 的烧杯和让它搅拌溶解。在此示例中,最后的解决办法是在 50 毫升的容量瓶,所以只添加约 25 毫升,所以可以冲洗烧杯和解决方案到最后卷组成。
  3. 一旦溶解固体,溶液倒入容量瓶。
  4. 冲洗烧杯和少量的溶剂,约 10 毫升,搅拌棒,倒入容量瓶的冲洗。重复两次以上。这有助于确保适当的解决方案转移。

2.内部标准校准曲线的制备

  1. 气相色谱法分析准备所需的标准样品。在此示例中,从咖啡用乙腈提取咖啡因和腺嘌呤然后作为一种内部的标准用于测量。
  2. 对于咖啡因的样本,称出 1 毫克/毫升样品所需的样品的取样量。如果使用 10 毫升的容量瓶,那是 10 毫克。
  3. 进一只量杯权衡分析物,添加几毫升的溶剂 (这里的甲醇) 以溶解,然后定量地转移到容量瓶使用 3 冲洗。
  4. 以类似的方式与 0.2、 0.5、 2 毫克/毫升咖啡因使 3 更多的标准。
  5. 放在每个咖啡因 1 毫升标准样品瓶。
  6. 添加到每个样品瓶 0.2 毫升的 2 毫克/毫升腺嘌呤内部标准。
  7. 与每个咖啡因标准运行气相色谱法测定实验。对于每个色谱图,计算的峰面积为咖啡因 vs 比标准。
  8. 绘制一个地区比 vs 的浓度比。那情节的斜率是响应因子。

3.与内部标准实际样品的制备气相色谱法

  1. 气相色谱法分析的准备所需的样品。在此示例中,咖啡因被提取使用 acetrontrile 的咖啡。
  2. 有关咖啡的示例,大规模出的咖啡注入 100 mL 烧杯 2 g。记录了咖啡的准确重量。
  3. 向烧杯中添加 20 毫升的乙腈。
  4. 让它坐了 20 分钟,不断搅拌。
  5. 筛选出用漏斗滤纸咖啡的理由。
  6. 冲洗过滤纸 3 x 与少量的乙腈 (5 毫升)。
  7. 最后量度的滤液。它应该是大约 35 毫升。

4.运行示例并计算浓度

  1. 取 1 毫升的咖啡提取物样品,在小瓶中添加 0.2 毫升的内部标准。将小瓶放入自动取样器机架。
  2. 运行的样品的气相色谱分析。请确保 GC 条件这样的咖啡因和腺嘌呤分开。在此示例中,等温分色被执行在 200 ° c。
  3. 经过分析,计算分析物的峰和内标峰的峰面积。使用他们的比率,计算样品中咖啡因的量。

5.咖啡因的内部标准结果: 气相色谱分析

  1. 咖啡因的气相色谱分析如图 1所示。腺嘌呤用作内部的标准。峰面积比可以测量和绘制 vs 浓度的比例。边坡是情节的响应因子 (在本例中 1.8)。
  2. 图 2显示了一份咖啡样品和腺嘌呤内部标准图谱。峰面积的比值是 1.78。使用响应因子和腺嘌呤 (0.33 毫克/毫升) 的已知的浓度,计算出未知样品中的咖啡因浓度是 0.33 毫克/毫升。

Figure 1
图 1。使用内标校正标度图。一块的面积比率 vs 浓度比值为 3 标准样品的咖啡因 (1,0.5 和 0.2 毫克/毫升) 0.33 毫克/毫升腺嘌呤内部标准添加到每个。直线的斜率是 1.8,即响应因子。

Figure 2
图 2。咖啡与腺嘌呤内部标准图谱。对样品的 FID 检测器响应一个阴谋。三个主峰是腺嘌呤 (IS),咖啡因和棕榈酸。

每次处理或转移,样品时,则会发生样品丢失从而难以准确计算的浓度。

为了确保准确性,样品损失的影响必须尽量减少使用小心样品制备和通过限制的样品处理和转移步骤数。然而,样品损失也可能会导致系统错误,如不完整的样本操作、 基体效应,以及在解析过程中的变化。

这些来源的损失可以占由加入已知的浓度的一种相似但不是相同,对感兴趣的化合物。这就被所谓的内部标准。发生内部标准的任何样品损失应该是类似的分析物,允许浓度精确计算。

此视频将说明内部标准和适当的实验室技术占样品损失确定的未知浓度时的使用。

内部的标准是一种添加已知量标准、 样本,和空白,在分析过程中的物质。

在色谱和光谱技术,信号的内部标准和被测物比率的计算。这一比率,称为响应因子,分析物和标准浓度的比值成正比。

反应系数,R,可以由下面的公式,其中代表分析信号的样本和内部标准和 C 表示的样品和内部标准浓度表示。

内部的标准可以弥补系统和随机误差。例如,随机误差 — — 如不一致时测量样品— —将相同的内部标准和被分析物。因此,它们的信号的比例不会改变。

系统错误,如在解决方案中,基体效应比会受影响,只要基体效应的作用是同酬标准和被分析物。

虽然内部标准带来巨大的好处,它可以很难选择一个合适的。内部的标准必须是相似但不是相同,对分析物的信号。它也不能影响任何方式分析物的测量。

最后,集中必须是众所周知的。这被通过确保内部的标准不以本机方式存在于样品;因此,它在溶液中的唯一来源是已知的浓度增加。

在下面的实验中,将用气相色谱测定咖啡因在未知样品的浓度。

这被通过创建使用已知的咖啡因的解决方案,与腺嘌呤为内标校准曲线。校准曲线的斜率等于响应因子。

一旦响应因子已知的可以从其测量的色谱面积比计算未知的浓度。

现在,您了解基本的内部标准,让我们看看过程。

开始执行程序,准确衡量 100 毫克的内部标准,腺嘌呤,到一个干净的烧杯。

接下来,溶于二甲基亚砜,大约 20 毫升和混合溶液。

一旦腺嘌呤已解散,则将溶液倒入 50 毫升容量瓶。

冲洗用二甲基亚砜,10 毫升的烧杯和搅拌栏和冲洗倒进瓶子里。重复此冲洗两次,以确保妥善解决转移。填充到校准的标记,造成内部标准与浓度为 2 毫克/毫升。

下一步,进一只量杯准备股票溶液重量 100 毫克的咖啡因。溶解少量的甲醇与咖啡因。然后,使用 3 冲洗到新鲜 25 毫升容量瓶转移此解决方案。这是 4 毫克/毫升股票解决方案。使用它来创建 3 咖啡因标准。

接下来,添加 0.2 毫升的内部标准,腺嘌呤,每个培养瓶。用甲醇填充每到最后一卷。将每个解决方案转移到样品瓶。

通过气相色谱仪运行每个咖啡因标准。计算峰面积与标准的腺嘌呤咖啡因的比。

第一,进 100 毫升烧杯,重 2 克的咖啡和记录重量。

接下来,添加 20 毫升的甲醇提取咖啡的咖啡因。让溶液搅拌 20 分钟。

使用布氏漏斗,过滤掉咖啡的理由。冲洗用少量甲醇,烧杯,倒入这个冲洗入漏斗。重复冲洗两次。

最后量度的滤液;它应该是大约 35 毫升。

为了准备分析样品,请将 1 毫升的咖啡提取物添加到样品瓶。然后,添加 0.2 毫升的腺嘌呤的内部标准,并将小瓶放入仪器的自动取样器机架。

运行的样品,确保条件这样的咖啡因和腺嘌呤是单独的气相色谱分析。

完成后进行分析,计算内部标准和被分析物的峰面积。

一旦所有样品进行都分析,标准校准曲线可以通过绘制的峰面积与浓度的比率的比率确定咖啡因/腺嘌呤解决方案。这条线,表示响应因子,边坡为 1.8。

接下来,从提取的咖啡样品的 GC 数据进行了分析。峰面积比值的计算结果是 1.78。使用响应因子和已知的浓度的内部标准,腺嘌呤,咖啡因在未知样品的浓度的计算结果是 0.33 毫克/毫升。

许多不同类型的反应,跨越各种科学的门徒,利用内部的标准,以尽量减少错误和样品损失的影响。

可以使用内部标准,保持其浓度比接近于常数最小样品制备过程中遇到的样品损失的影响。

在此示例中,生物活性脂质提取使用液-液萃取过程的裂解细胞。稳定同位素内部标准被添加在开始部分的萃取,占样品制备过程中的错误。

内部标准并非只有关键制备的生物活性的脂类成分,但也为分析。脂类分离使用高性能液相色谱法,并通过质谱分析。

在光谱学,内部标准可以帮助正确的随机误差的变化在光源强度。如果一盏灯或其它光源具有可变电源,它会影响吸收和因此,排放的一个样本。然而,内部标准对分析物的比例将保持不变,即使光源不。

在色谱中,误差最大的来源之一是注射。自动取样器帮助最小化,但错误仍可 1-2%相对标准偏差。

在此示例中,蒸气标准包含内部的标准分析了利用气相色谱法建立的校准曲线。这一次完成,然后可以测量未知的样品,样品的波动造成的损失占。

你刚看了朱庇特的简介内部标准。现在,您应该了解样品损失最小化、 内部标准和响应因子的最佳做法。

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