Overview
ソース: 研究所博士 b. ジル Venton - ヴァージニアの大学の
多くの化学分析の目標は定量分析では、試料中の物質の量が決定されます。サンプルから未知の濃度を正確に計算するために慎重なサンプル準備はキーです。サンプルは処理または転送するたびに、サンプルの一部が失われます。ただし、サンプルの損失を最小限に抑える方法があります。また、サンプルの損失への対処とまだ濃度の正確な測定を行うのための戦略があります。
サンプルの損失を最小限に抑えるために理想はサンプルの処理と転送の手順の数を最小限に抑えることです。たとえば、ソリューションは、フラスコに直接固体試料をマス転送手順が軽減されます。1 つのフラスコから別に転送する必要がある、希釈が行われていて、トリプル ガラスの洗浄は、すべてのサンプルが転送されることを確認を役立ちます。その他の戦略よりサンプルに固有です。たとえば、タンパク質などのガラスに吸着されるサンプルはポリプロピレンの使い捨てチューブにより処理可能性があります。チューブは親水性、少量の試料を水に戻される場合は、サンプルは、溶剤に直接戻ことができますので、すでに、チューブに水を追加してお勧め。水分補給後 insolubilities からの損失のため、サンプルを完全に乾燥するのではなく、集中する方が良い場合があります。
サンプルの損失の別のソースは、不完全なサンプル操作を通じてです。たとえば、誘導体化プロシージャが使用され、誘導体化が完了、サンプルの全額は反映されません。このようなエラーは、系統誤差で誘導体化手順の変更などの問題を修正することで解決できます。測定の系統誤差の別の原因は、マトリックスの影響です。これらのサンプルはこの効果を減らすことができます、特定の物質と同じ行列で行う校正の測定で干渉することができます。
定量分析通常外部または内部の基準を使用してを実行されます。外部基準校正曲線は興味の analyte の異なる既知濃度測定によって行われます。その後、サンプルは、標準から個別に実行されます。社内基準で標準は同時に取られる測定対象試料と同じサンプルです。通常、内部標準のための内部標準と応答の比と呼ばれる別の種が追加され、試料が計算されます。アイデアは、応答因子と呼ばれる、応答の比率はそれらの濃度に比例です。メソッドは、興味の analyte と内部標準を区別できる必要があります、内部標準の追加後に発生するサンプル損失は両方の物質と同様にする必要があります、したがって、応答の比率は変わりません。内部標準を使用しての特殊なケースは、標準の追加、どこ試料の量を増やすことがソリューションに追加され、元の試料の量は、バック計算の方法です。社内基準は、クロマトグラフィー、電気化学、分光法で使用できます。
Principles
内部標準は一定量のサンプル、空白、および分析の標準に加えられる物質です。内部標準を体系的かつランダムなエラーを補正できます。たとえば、楽器変動測定のランダムなエラーが発生した場合は、これらの変動は、内部標準と試料の両方のための同じをする予定です、従って信号の比率は変わりません。、溶媒のマトリックス効果などの系統誤差の影響は、試料と標準の等しい限り、比率は再び影響しません。
社内基準の不利な点は適切な内部基準を見つけるは難しいです。内部標準試料に似ているが十分に異なる楽器によって区別できる信号が必要です。また、追加の標準は標準の唯一の情報源、内部標準をサンプル マトリックスに存在できないする必要があります。時折が一定濃度でサンプルの主要な構成要素を追加した標準の代わりに内部標準として使用できますが、濃度はその成分のよく知られている必要があります。内部標準もない抑制か試料の信号を強化します。
エラーの最大の源の一つは、クロマトグラフィーはしばしば、注射です。手動の注射を使用している場合、注射器を正常に読み込み中でエラーを使用することができます。ボリュームは、通常は小さい (〜 1 μ L) 再現性をもって、この小さなボリュームであり、多くの場合数パーセント相対標準偏差 (RSD) を注入することで不確実性があるので。ガスクロマトグラフィー (GC)、温水ポートにサンプルを注入し、針の先端からの蒸発量の変化につながります。自動サンプラーが注射器を読み込み中にエラーとエラーを注入することで、GC の蒸発を避けるためにすばやくが、エラーはまだ 1-2 %rsd をすることができます。クロマトグラフィー、広いと時間が短いのに、ピーク ピーク面積が一定として、ピーク面積は通常ピークの高さではなくに使用されます。したがって、内部基準ピークの高さではなくクロマトグラフィーのピーク面積の比が使用されます。
内部標準と校正、応答率が計算されます。応答係数 (R) は、X は検体とは濃度の比と比較してピークの比率は内部標準です。
クロマトグラフィー用領域 (A) が使用されます。X/A の校正プロットから応答係数を計算できますが対 CX/Cは、どこ応答係数は傾き、y 切片が 0 と見なされます。応答率を基準にわかれば、未知の反応が実験から測定面積比から計算できます。
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Procedure
1. 適切なサンプル処理: ソリューションを作る
- きれいなビーカーとそれに大量サンプルの適切な量を取る。実際の使用量を記録します。この例では、アデニンのソリューションは、内部標準として次の解析用メスフラスコで行われます。アデニンの質量は 100 mg です。しないでくださいそれは長い首とアデニンを簡単に追加または削除できませんので直接ではなく、メスフラスコに大量します。
- 溶媒を約 25 mL を追加 (この場合ジメチルスルホキシド (DMSO)) を溶解する攪拌それビーカーを。この例では、最終的な解決策は 50 mL のメスフラスコに、のみ約 25 mL ビーカーを洗うことができるので、最後のボリュームに成っている解決を追加します。
- 固体が溶解している、一度容積測定フラスコの溶液を注ぐ。
- ビーカーと溶媒 10 mL 程度の少量の攪拌棒をすすいで、メスフラスコにリンスを注ぐ。2 回以上を繰り返し。これにより、適切な解決策の転送。
2. 内部標準校正曲線の準備
- ガスクロマト グラフ分析に必要な標準試料を準備します。この例では、アセトニ トリルを使ってコーヒーからカフェインを抽出し、アデニンは測定用内標準として使用されます。
- カフェインのサンプル、1 mg/mL のサンプルを作るために必要なサンプル量を重量を量る。10 mL のメスフラスコを使用している場合、それは 10 mg です。
- ビーカーに試料の重量を量る、数 mL の溶媒に溶解し、メスフラスコ 3 リンスを使用して定量的に転送 (ここでメタノール) を追加します。
- カフェイン 0.2、0.5、2 mg/mL と同様の方法で 3 以上の基準を作る。
- サンプル瓶に各カフェインの 1 mL の標準を置きます。
- 各サンプルのバイアルに 2 mg/mL アデニン内部標準の 0.2 mL を追加します。
- 各カフェイン標準ガス ・ クロマトグラフィーの実験を実行します。各クロマト グラムの標準カフェイン対のピーク面積の比を計算します。
- 濃度比面積比対のプロットを作る。そのプロットの傾きは、応答の要因です。
3. ガスクロマトグラフィー用内部標準と実試料の準備
- 目的のサンプルをガスクロマト グラフ分析に備えます。この例で acetrontrile を使ってコーヒーからカフェインが抽出します。
- コーヒー サンプル、100 mL ビーカーにコーヒーの 2 g を大量。コーヒーの正確な重量を記録します。
- アセトニ トリル 20 mL をビーカーに加えます。
- よくかき混ぜながら 20 分間座っていることができます。
- 漏斗にろ紙を使用してコーヒーかすをフィルター処理します。
- リンス フィルター紙のアセトニ トリル (5 mL) の少量の 3 倍。
- 最終的な濾液量を測定します。それは約 35 mL をする必要があります。
4. サンプルを実行し、濃度の計算
- コーヒー抽出試料 1 mL をとり、バイアル内の標準の 0.2 mL を追加します。オ-トサンプラ ラックにバイアルを配置します。
- サンプルの GC 分析を実行します。GC 条件がカフェインとアデニン別のものであることを確認します。この例では、等温版は 200 ° C で実行されます。
- 分析した後、内部標準的なピークと試料ピークのピーク面積を計算します。その比を使用すると、サンプルに含まれるカフェインの量を計算します。
5. 結果: GC 分析の内部標準とカフェイン
- カフェインの GC 分析を図 1に示します。アデニンは内部標準として使用されます。ピーク面積の比を計測し、対の濃度の比をプロットします。プロットの傾きは、(この場合は 1.8) で応答の要因です。
- コーヒー サンプル アデニン内部標準物質とのクロマト グラムを図 2に示します。ピーク面積の比は 1.78 です。応答率とアデニン (0.33 mg/mL) の既知の濃度を使用して、未知の試料中のカフェインの濃度は 0.33 mg/ml に計算されます。
図 1。内部標準物質を用いる校正プロット。カフェインの 3 標準試料の面積比対濃度比のプロット (1、0.5、および 0.2 mg/mL) 0.33 mg/mL アデニン内部規格それぞれに追加します。直線の傾きは 1.8、応答の要因となっています。
図 2。アデニン内部標準とコーヒーのクロマト グラム。サンプルに FID 検出器の応答のプロット。アデニン (IS)、カフェイン、パルミチン酸、3 つの主要なピーク。
サンプルが失われるたびにサンプルを処理または転送、濃度の正確な計算がそれにより困難します。
精度を確保するには、サンプルの損失の影響最小限にしなければならない注意サンプル準備を使用して、サンプルの処理と転送の手順の数を制限することによって。ただし、サンプルの損失は、不完全なサンプル操作、マトリックスの影響、および分析手順の変化などの体系的なエラーも起こります。
損失のこれらの源に似ていますが、同一ではない、興味の化合物種の既知濃度を追加することによって説明できます。これは内部標準と呼ばれます。濃度を正確に計算するため、試料の内部標準に発生するサンプル損失なります。
このビデオでは、未知の濃度を決定する際のサンプルの損失のために内部標準と適切な演習手法の使用を説明します。
内部標準が解析中に、既知の量の基準、サンプル、および空白に加えられる物質です。
クロマトグラフィーそして分光学、内部標準試料の信号の比率が計算されます。応答因子と呼ばれる、この比率は試料と標準濃度の比に比例します。
応答係数、R、C の内部基準とサンプルの表す解析的信号がサンプルと内部標準物質の濃度を表す以下の式で表現できます。
内部標準を体系的かつランダムなエラーを補正できます。たとえば、ランダムなエラー ——のサンプルを測定する際の不整合は内部標準と試料の両方で同じになるでしょう。したがって、その信号の比率は変更されません。
溶液中のマトリックスの影響などの系統誤差の比は影響はありませんマトリックス効果は、標準と試料の等しい限り。
社内基準は、大きな利点を提供する、適しているものを選択する困難になることができます。内部標準は似ていますが、同一ではない、試料に信号が必要です。何らかの方法で試料の計測にも影響をことはできません。
最後に、濃度がよく知られている必要があります。内部標準がネイティブ; サンプルでは存在しないことを確保するこしたがって、ソリューションにそれの唯一のソース追加既知濃度であります。
次の実験では、未知の試料中のカフェインの濃度はガス ・ クロマトグラフィーによって決定されます。
これは、内部標準としてアデニンと知られているカフェイン ソリューションを使用して検量線を作成することによって実現されます。検量線の傾きは、応答率と同じです。
応答率が判明すると、未知の濃度が測定されたクロマト面積比から計算できます。
今では社内基準の基本を理解すると、プロシージャを見てをみましょう。
手順を開始するには、きれいなビーカーに内部標準、アデニンの 100 mg を正確に計量します。
次に、ジメチルスルホキシドの約 20 mL に溶解し、溶液を混合します。
アデニンが解散した後は、50 mL のメスフラスコに溶液を注ぐ。
10 ml の DMSO のビーカーと攪拌バーをすすいで、リンスをフラスコに注ぐ。ソリューションの適切な転送を確実に 2 回、このすすぎを繰り返します。2 mg/mL の濃度と内部標準物質の校正マークを入力します。
次に、ストック溶液を調製するビーカーに 100 mg のカフェインの重量を量る。メタノールの少量のカフェインを溶かしてください。その後、新鮮な 25 mL のメスフラスコにこのソリューションを転送するのに 3 リンスを使用します。これは 4 mg/mL の原液です。3 カフェインの標準を作成するのにそれを使用します。
次に、各フラスコに内部標準、アデニンの 0.2 mL を追加します。メタノールと最終巻にそれぞれを入力します。サンプル瓶に各ソリューションを転送します。
ガス クロマト グラフを介して各カフェイン標準を実行します。標準のアデニンとカフェインのピーク面積の比を計算します。
まず、100 mL ビーカーにコーヒーの 2 グラムの重量を量る、重量を記録します。
次に、コーヒーからカフェインを抽出するメタノール 20 mL を追加します。20 分間攪拌するソリューションを許可します。
コーヒーかすを Büchner の目標到達プロセスを使用して、フィルターします。少量のメタノール、ビーカーを洗い、漏斗にこのリンスを注ぐ。すすぎを 2 回繰り返します。
最終; 濾液量を測定します。それは約 35 mL をする必要があります。
分析用サンプルを準備、サンプル瓶にコーヒー抽出液の 1 mL を追加します。アデニン内部標準の 0.2 mL を追加し、計測器の自動サンプラー ラックにバイアルを配置します。
サンプルでは、条件がカフェインとアデニンは別のものであることを確認のガスクロマトグラフィー分析を実行します。
分析を完了すると、内部標準と試料のピーク面積を計算します。
すべてのサンプルが解析されると、標準校正曲線は、濃度比とピーク面積の比をプロットすることによってカフェイン/アデニン解決策を決定できます。応答率を表します、このラインの斜面は 1.8 だった。
次に、抽出されたコーヒーのサンプルの GC データを分析します。1.78 にピーク面積の比を求めた。応答率と内部標準、アデニンの既知濃度を使用して、未知の試料中のカフェインの濃度は 0.33 mg/mL に計算されました。
さまざまな種類、さまざまな科学的な弟子たちの間での反応のエラーやサンプルの損失の影響を最小限に抑えるための社内基準を利用します。
試料中に発生したサンプルの損失の影響は、彼らの濃度比をほぼ一定に保つことの内部標準を使用して最小化できます。
この例では生理活性脂質液-液抽出プロセスを使用して分離セルから抽出しました。安定同位体の内部基準はサンプル準備中エラーを考慮して抽出の冒頭に追加しました。
社内基準だけなかった重要な生理活性脂質の準備のため、分析。高速液体クロマトグラフィー、質量分析器で分析して、脂質が分離されました。
分光学、内部基準が変化によりランダム エラーの正しい光源の輝度と役立ちます。ランプなどの光源に電力用可変がある場合吸収とその結果、サンプルの放出に影響します。ただし、光源がない場合でも検体に内部標準の比率は一定に滞在します。
エラーの最大の源の一つは、クロマトグラフィー、注射です。自動サンプラをこれを最小限に抑えるが、エラーが 1-2% の相対標準偏差をまだすることができます。
この例では、内部標準物質を含む蒸気の基準は、ガス ・ クロマトグラフィーを使用して検量線を確立するを分析しました。これが完了した、未知の試料を測定し、サンプルの変動による損失を占めています。
ゼウスの内部基準序説だけ見た。今サンプル損失を最小限に抑え、内部の標準、および応答の要因のためのベスト プラクティスを理解する必要があります。
見てくれてありがとう!
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Applications and Summary
社内基準は、分光法とクロマトグラフィーを含む多くの分野で使用されます。分光学、内部基準が変化によりランダム エラーの正しい光源の輝度と役立ちます。ランプなどの光源に電力用可変がある場合吸収とその結果、サンプルの放出に影響します。ただし、光源がない場合でも検体に内部標準の比率は一定に滞在します。これの 1 つの例は、火炎分光法による、内部標準物質として血液サンプル中のナトリウムの分析のためリチウム (Li) を使用してください。李はナトリウムを化学的に類似がネイティブの血で発見されていません。
クロマトグラフィー用内部標準は、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィーに使われます。検出器として質量分析計を使用するアプリケーションの内部標準は分子量 (MW) を興味の analyte とは異なるされるように、同位体標識試料をすることができます。社内基準は、医薬品や環境分析で使用されます。
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