Overview
Source : Laboratoire du Dr B. Jill Venton - University of Virginia
Électrophorèse capillaire (EC) est une technique de séparation qui sépare les molécules dans un champ électrique selon la taille et de la charge. CE est réalisé dans un tube de verre appelé un capillaire qui est rempli d’une solution électrolytique. Analytes sont séparés en raison des différences dans la mobilité électrophorétique, qui varie en fonction de la charge, la viscosité du solvant et la taille. Traditionnel électrophorèse en gels est limitée au montant de tension qui peut être appliquée parce que Joule effets de chauffage va ruiner le gel et la séparation. Capillaires ont un surface zone-à-volume élevé et dissipent ainsi mieux la chaleur. Par conséquent, les tensions appliquées pour une expérience de l’électrophorèse capillaire sont assez grandes, souvent 10 000 – 20 000 V.
L’électrophorèse capillaire est utile pour des séparations de haute performance. Par rapport à la chromatographie en phase liquide, séparations CE sont souvent plus rapides et plus efficaces. Toutefois, l’électrophorèse capillaire fonctionne mieux pour séparer les molécules chargées, qui n’est pas une limitation de la chromatographie en phase liquide. EC a une plus grande capacité de pointe que la chromatographie liquide à haute performance (HPLC), ce qui signifie que les séparations sont plus efficaces et plus de pics peuvent être détectées. L’instrumentation peut être très simple. Cependant, HPLC est plus souple et beaucoup de phases stationnaires et mobiles ont été développés pour différents types de molécules.
Principles
L’électrophorèse capillaire sépare les molécules en raison de leur mobilité électrophorétique. La mobilité électrophorétique de la molécule dépend de sa charge et combien il est attiré ou repoussé par la tension ainsi que la force de traînée de frottement qui résiste au mouvement. Le frottement est proportionnel au rayon de la molécule. Ainsi, mobilité électrophorétique est basée sur la taille et de la charge. La vitesse de qu'une molécule chargée se déplace vers le bas d’un capillaire est le produit de sa mobilité électrophorétique et le champ électrique appliqué. Des tensions plus élevées conduisent donc à des vitesses plus rapides et les séparations plus rapides.
La plupart des instruments de l’électrophorèse capillaire sont mis en place avec la tension négative à l’extrémité du détecteur et la tension positive à l’entrée. Cela signifie que les molécules chargées positivement migrent vers la cathode à la fin, tandis que les molécules chargées négativement migrent l’autre sens. Toutes les molécules sont vus à détecteur cependant, parce qu’il y a un écoulement de fluide en vrac appelé électroosmotique. L’ordre de migration est donc les molécules chargées positivement, neutres et puis charge négative.
Électroosmotique est causée en appliquant une tension élevée pour un petit verre capillaire rempli d’une solution saline. Les ions chargés positivement dans la solution saline forment une double couche avec les groupes silanol charge négative sur les parois du verre. Lorsqu’une tension négative est appliquée à l’extrémité du capillaire, il rassemble les cations de la double couche, qui tire aussi la solution autour de lui à cause des forces de friction. Ce type de flux est en forme de broches et conduit à moins band-élargissement que les bouchons de circulation en forme parabolique de CLHP.
Les molécules neutres tous les flux au même taux que le flux électroosmotique. Toutefois, une phase stationnaire Pseudo-aléatoire peut être ajoutée au tampon d’exécution de micelles de forme qui peuvent partitionner les molécules dans et hors de. Une phase stationnaire Pseudo-aléatoire typique est le dodécylsulfate de sodium. Les micelles sont de charge négative sur l’extérieur, afin qu’ils aient une mobilité électrophorétique, donc le temps passé dans la micelle détermine la durée de la migration. Cette forme d’électrophorèse capillaire est appelée chromatographie électrocinétique micellaire (MEKC).
Détection en EC est semblable à celle pour HPLC. UV-Vis est générale et ne nécessite pas de marquage aussi longtemps que la molécule possède une double liaison. Cependant, l’absorbance dépend de la longueur de chemin d’accès, ce qui est petite pour un capillaire de 50 µm. Une cellule de bulle ou z va augmenter la longueur du trajet. Fluorescence induite par laser est une méthode de détection plus sensible. Un laser est brillait à travers une fenêtre dans le capillaire et la fluorescence du produit mesuré. Fluorescence fournit une sensibilité très élevée, il nécessite généralement des molécules à baliser car la plupart ne sont pas fluorescente. Détection électrochimique et détection de spectrométrie de masse electrospray gagnent en popularité. La question d’aucune de ces détecteurs, c’est que le niveau de tension de la séparation doit être traduit en sol avant la détection, en électrochimie et electrospray exigent l’application de la tension et la tension de CE peut interférer. Nouvelles méthodes de découplage de la tension de la CE, à l’aide d’électrodes pour drainer le courant ou une petite fissure dans le capillaire, sont surmonter ces défis.
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Procedure
1. CE Instrumentation Setup
- Allumer l’instrument CE et l’ordinateur. En utilisant le logiciel de l’ordinateur, allumez la source de lumière pour l’analyse des UV pour lui permettre de se réchauffer. Un logiciel a un indicateur lorsque la lampe est prête à l’emploi (lampe icône devient couleur).
- Faire un fichier de méthodes. Définissez les paramètres importants pour le marquage CE en cours d’exécution. Dans cette analyse, les températures de stockage de la cartouche et échantillon sont 35 ° C. La longueur d’onde de détection UV est 214 nm.
- Écrire un programme de temps. Le programme se compose généralement des étapes de rinçage (pour nettoyer le tube capillaire avant l’analyse), étapes de l’injection, puis une étape de l’électrophorèse. Pour l’étape de rinçage, effectuer 2 rinçages pendant 1 min à l’aide de 20 lb/po2 de pression. Le premier rinçage est avec NaOH, qui permet de s’assurer que les groupes silanol sur la paroi capillaire sont déprotonés. Le second rinçage est avec exécution buffer (tampon de borate de 0,025 M ici) pour vous assurer que le tube capillaire est gauche équilibrée avec tampon.
- Pour l’injection, injection sous pression sert à 0,5 lb/po2 pendant 5 s.
- Pour l’étape de l’électrophorèse, les conditions étaient de séparation voltage : 20 kV, temps : 5 min, une polarité normale. Pour chaque étape, également indiquer quel flacon est l’entrée et quel flacon est la sortie. Enregistrez le fichier de méthodes après que tous les paramètres sont entrés.
2. préparation des normes et des échantillons de soude
- Faire des solutions mères de 500 ppm de l’aspartame, la caféine et l’acide benzoïque dans l’eau. Faire 50 mL de chacun, à l’aide d’une fiole jaugée.
- Préparer une solution standard de 150 ppm aspartame, caféine 150 ppm et 100 ppm d’acide benzoïque dans une fiole jaugée de 10 mL.
- Faites des solutions de caféine standard de 200 ppm, 100 ppm, 150 ppm et 50 ppm à un fioles jaugées de 10 mL.
3. exécuter les exemples sur le marquage CE
- Placer les flacons contenant des normes ou des échantillons de soude dans le porte-flacon échantillon. Assurez-vous d’écrire quel exemple se trouve dans quel slot. Deux machines à sous ont l’ion borate forme courir le tampon et la solution de rinçage de NaOH 0,1 M.
- Dans le fichier de la méthode, une entrée qui slot le premier flacon est dans.
- Acquérir un même essai, en veillant à saisir toutes les informations données le programme de visites.
- Continuer à acquérir des données, changer le flacon d’entrée pour chaque échantillon. Exécuter la combinaison standard, les 3 concentrations de caféine et un Pepsi et diète Pepsi échantillon.
- Insérez la cible dans l’instrument et choisir l’instrument approprié.
- Analyser les données sur l’ordinateur. Calculer des pics et les normes de superposition et les échantillons réels pour aider à identifier les sommets. Faire une courbe d’étalonnage pour les données de la caféine.
L’électrophorèse capillaire, ou CE, est une technique utilisée en analyse chimique pour séparer les molécules dans un champ électrique selon la taille et de la charge.
L’électrophorèse capillaire est réalisée dans un tube de diamètre submillimétrique, appelé un capillaire, qui contient une solution d’électrolyte qui coule. L’échantillon est injecté dans le tube capillaire, et un champ électrique est appliqué. Les molécules sont alors séparés basés sur la différence de leur vitesse, qui est influencée par l’accusation, la taille et la viscosité du solvant. CE est idéal pour la séparation des molécules chargées et a une résolution plus grande que la chromatographie liquide à haute performance, rendant plus efficace et plus sensible.
Cette vidéo va introduire les bases de l’électrophorèse capillaire et démontrer son utilisation en déterminant la composition d’une boisson gazeuse.
Dans CE, un champ électrique est appliqué à un capillaire rempli d’un électrolyte. Le champ électrique induit une charge positive à l’entrée du capillaire et une charge négative à la sortie.
Les flux de l’électrolyte dans le capillaire, induite par le champ électrique. Ce flux, appelé flux électro-osmotique, est causé par le mouvement d’une couche distincte des ions de sels chargées positivement le long de la paroi des capillaires charge négative.
Comme les pistes de courants électriques à travers le capillaire, les cations le long du mur se déplacent vers l’extrémité négative. Ce flux d’ion tire la solution dans le centre à travers le tube.
Les molécules sont alors séparés basé sur leur vitesse dans le tube capillaire. Cette vitesse, appelée la mobilité électrophorétique, dépend des molécules frais et taille, et combien il est attiré ou repoussé par un champ électrique.
Les molécules chargées positivement traversent plus vite le capillaire, car ils sont plus attirés par le potentiel à la sortie. Les molécules chargées négativement coulent beaucoup plus lentement, car ils sont plus attirés par le potentiel à l’entrée. Des molécules neutres sont transportés ainsi que le débit en vrac. Ainsi, l’ordre des molécules quittant le capillaire est chargée positivement, neutres et puis charge négative. En outre, le flux de l’électrolyte tire plus vite que les molécules plus grosses à cause des forces de friction des molécules plus petites.
Molécules sont enregistrés par un détecteur, comme UV-Vis, comme ils sortir de la colonne et sont visualisées dans une parcelle de l’intensité du signal détecteur par rapport au temps, appelée électrophorégramme.
Électrophérogrammes peut produire une gamme d’informations ; tels que la façon dont beaucoup de composés différents est présent dans un échantillon et la quantité de chaque substance.
Maintenant que vous avez vu un résumé succinct de l’électrophorèse capillaire, nous allons jeter un oeil à la façon dont elle est exécutée dans le laboratoire.
Tout d’abord, allumez l’appareil d’électrophorèse capillaire et l’ordinateur. Allumez ensuite le détecteur UV pour lui permettre de se réchauffer.
Définir les paramètres de l’expérience en cours d’exécution. En premier lieu, régler la température pour le stockage de la cartouche et l’échantillon à 35 ° C et la longueur d’onde de détection UV à 214 nm.
Ensuite, définissez les étapes de deux rinçage. Le premier rinçage est avec l’hydroxyde de sodium pour s’assurer que les groupes silanol sur la paroi capillaire sont protonés. Le second rinçage utilise la mémoire tampon en cours d’exécution se pour équilibrer le capillaire. Ensuite, définissez l’échantillon d’injecter à 0,5 lb/po2 pendant 5 s.
Définir l’étape de l’électrophorèse, en sélectionnant la tension de la séparation. Dans ce cas, utiliser 20 kV pendant 5 min à l’aide de polarité normale, ce qui signifie que le champ électrique est positive à l’entrée et négatives à la sortie.
Tout d’abord, préparer les solutions de l’aspartame de composants de soude, la caféine et l’acide benzoïque à 500 parties par million dans l’eau 50 mL.
De la solution mère, préparer une solution standard de 150 ppm aspartame, caféine 150 ppm et 100 ppm d’acide benzoïque.
Ensuite, faire 4 solutions étalons de caféine à 50, 100, 150 et 200 ppm. Ces échantillons serviront à faire une courbe d’étalonnage. Pour plus d’informations, voir la vidéo sur les courbes d’étalonnage de cette collection.
Enfin, préparer les échantillons de soude par leur dégazage avec de l’azote. Les échantillons de soude on analysera avec aucune dilution.
Placer les flacons contenant les échantillons standard ou de soude dans le porte-flacon. Placer les flacons contenant le tampon de l’exécution et la solution de rinçage d’hydroxyde de sodium dans le porte-échantillon aussi bien. Assurez-vous de noter l’emplacement de chacun.
Dans le logiciel instrument CE, indiquent quels slots contiennent les solutions de deux rinçage et le premier flacon. Maintenant, exécutez le premier échantillon.
Ensuite, exécutez la combinaison standard, les 4 concentrations de caféine et un habitué et le régime échantillon de soude en changeant le flacon d’entrée.
Lorsque toutes les solutions ont été séparés, analyser les données.
Tout d’abord, utiliser les normes pour identifier les pics dans les échantillons de soude. Une comparaison des trois pics observés dans l’échantillon de soude alimentaire aux normes montre que l’aspartame, la caféine et l’acide benzoïque sont présents dans le soda diète. Dans l’échantillon de soude ordinaire, seulement le pic de caféine est présent, mais pas l’aspartame et l’acide benzoïque pics.
Ensuite, calculer l’aire du pic pour chaque solution étalon de caféine et faire une courbe d’étalonnage. La courbe d’étalonnage pour la caféine peut être utilisée pour calculer la concentration de caféine dans chaque échantillon.
L’électrophorèse capillaire est utilisé pour plusieurs séparations spécialisés dans les milieux académiques et industriels.
CE est souvent utilisé comme une des composantes de l’industrie pharmaceutique contrôle qualité stable. Médicaments, comme des petites molécules ou des produits biologiques, peuvent être exécutés par le biais de l’électrophorèse capillaire pour voir si n’importe quel produits secondaires sont présents. Il peut également être utilisé pour déterminer si les protéines sont correctement pliés, que le pliage peuvent affecter la charge protéique.
CE peut également être utilisé pour séparer l’ADN. À l’aide d’une plaque de microtitration et plusieurs baies des capillaires, chercheurs peuvent augmenter le débit d’une expérience unique, tel qu’illustré ici. Fragments d’ADN ont été séparés selon la taille, avec une résolution jusqu'à 1 paires de bases. Cela permet des fragments de séquençage d’ADN, ainsi que la détermination des autres paramètres comme variantes de nombre de copie, qui est utilisé pour diagnostiquer des maladies génétiques éventuelles.
Une protéine peut être modifiée par divers groupes d’employés qui sont liés chimiquement à différents endroits. Différentes copies de la même protéine peuvent varier avec différentes modifications, ce qui vont changer la charge et la taille de chaque protéine. Traversant un CE qui est attaché à un spectromètre de masse de protéines purifiées peut séparer des protéines basés sur lequel les modifications sont présents et également d’identifier le type et l’emplacement de la modification.
Vous avez juste regardé introduction de Jupiter à l’électrophorèse capillaire. Vous devez maintenant comprendre comment CE sépare basés sur la charge et la masse des molécules et comment faire fonctionner un échantillon sur le marquage CE en laboratoire.
Merci de regarder !
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Results
Électrophérogrammes collectées pour diète Pepsi et Pepsi échantillons sont présentés aux Figures 1 et 2, respectivement. Les trois sommets de l’aspartame, la caféine et l’acide benzoïque sont observées dans la diète Pepsi et ont des temps de migration similaires comme les normes. Pour Pepsi ordinaire, le pic de caféine est présent mais pas les sommets de l’aspartame et l’acide benzoïque. L’analyse de CE est rapide car les temps de migration sont seulement 3-4 min.
La courbe d’étalonnage pour la caféine est illustrée à la Figure 3. Cette courbe peut être utilisée pour calculer la concentration de caféine dans chaque échantillon.
Figure 1. Analyse de CE de Pepsi diète. Les rouges sont des normes de l’aspartame, la caféine et l’acide benzoïque. Le noir est une diète Pepsi échantillon. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2. Analyse de CE de Pepsi. Le noir est un échantillon de Pepsi, tandis que le rouge est un échantillon des normes de la caféine, l’aspartame et l’acide benzoïque. Il n’y a aucune l’aspartame ou l’acide benzoïque, indiquant la soude n’est pas régime. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3. Parcelle de calibrage de caféine avec CE. Une parcelle de la concentration maximale de vs zone de caféine normes mesurées avec CE. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Applications and Summary
L’électrophorèse capillaire est utilisé pour plusieurs séparations de spécialité. Par exemple, il est utilisé dans l’industrie pharmaceutique pour test, assurez-vous qu’il n’y a pas de produits secondaires ou interférants de qualité. CE est particulièrement utile pour séparer les médicaments avec un groupe amino de base, comme les parois du capillaire peuvent être faites à neutres avec un pH acide et donc la drogue ne collera pas au capillaire.
Un mode de CE servait aussi de séquencer le génome humain et séparer l’ADN. Ce mode d’EC est l’électrophorèse capillaire et pour ces séparations, un polymère est injecté dans le tube capillaire CE. Le polymère donne un mode supplémentaire de séparation basée sur la taille, comme les fragments plus petits peuvent voyager plus rapidement à travers le gel. C’est ce qu’on appelle tamisage et ainsi que la séparation par électrophorèse, il a 1 résolution de paires de bases pour l’analyse de l’ADN.
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