Retiro de la sangre

Lab Animal Research

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Overview

< clase p = 'jove_content' > fuente: Kay Stewart, RVT, RLATG, CMAR; Valerie A. Schroeder, RVT, RLATG. Universidad de Notre Dame, en

colección de la sangre es un requisito común para estudios de investigación que involucran a ratones y ratas. El método de retiro de la sangre en ratones y ratas es dependiente sobre el volumen de sangre necesitada, la frecuencia del muestreo, el estado de salud del animal para purgarse y el nivel de habilidad del técnico. 1 todos sangrados del seno discutidas retro-orbital de métodos, sangrados de snip de cola inicial y sangra intracardiaca-requieren el uso de una anestesia general.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Fundamentos de la investigación de animales de laboratorio. Retiro de la sangre. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Principles

< clase p = 'jove_content' > antes el procedimiento de sangrado, se debe determinar el tipo de muestra requerida. Procedimientos experimentales pueden requerir sangre entera, plasma o suero. Para sangre entera, debe agregarse un anticoagulante a la muestra. Plasma, que contiene fibrinógeno y otros factores de coagulación cuando se separó de los glóbulos rojos, se puede extraer de una muestra anticoagulada. Suero se obtiene a través de muestras de sangre sin anticoagulante. El suero será el resultado de la centrifugación de la muestra una vez que ha formado un coágulo. Como la muestra se haya coagulado, el suero no contiene fibrinógeno u otros factores de la coagulación. Suero y plasma se obtienen mediante el uso de una centrifugadora de ejecutar a 2200-2500 RPM durante un mínimo de 15 minutos.

< clase p = 'jove_content' > para una muestra que debe ceder sangre entera o plasma, debe usarse un anticoagulante adecuado. Anticoagulantes utilizados para animales de laboratorio son heparina, citrato de sodio y ácido de etilendiamina tetraacético (EDTA); selección de la cual se basa en las necesidades de investigación. Secuestrar una forma líquida de EDTA, heparina y citrato de sodio-puede cargarse directamente en la jeringa para recubrir las superficies. Esto permite el contacto de anticoagulante directamente como se extrae la sangre, ayudando en la prevención de la coagulación. Como la rata más rápidamente que la sangre mamífero más coágulos de sangre, es esencial utilizar la proporción correcta de anticoagulante a la sangre para recolección de sangre.

< clase p = 'jove_content' > Selección de la aguja se basa en el tamaño del animal y el sitio de la venopunción. En general, cuanto mayor sea el diámetro de la aguja, más rápidamente la muestra puede ser recogida. Menos daño a las células de la sangre es otro beneficio de agujas más grandes. Sin embargo, la principal desventaja para gran diámetro agujas es el daño potencial a la nave. En ratones y ratas, las opciones de la gama del tamaño de agujas de calibre 20 a 29 que son 0.5-1.5 pulgadas de longitud. Si una aguja es demasiado larga, no sólo es incómodo de usar, pero tener el espacio extra en la aguja podría resultar en coagulación. El tamaño de aguja adecuado está en la lista para cada método en la sección procedimientos.

< clase p = 'jove_content' > el tamaño de la muestra requerida también debe ser predeterminado. Debido al pequeño tamaño del ratón o de rata, la cantidad máxima de colección de la sangre debe calcularse para un sangrado de supervivencia. Un ratón medio peso 25 gramos tiene un volumen total de sangre de 1,8 ml; la rata promedio de peso de 250 gramos tiene un volumen total de sangre de 16 ml. Para una muestra de sangre solo en un ratón o rata sin reposición de líquidos, el volumen máximo de sangre que se puede quitar es el 10% de la volemia total o 7.7-8 μl/g. Así para un ratón medio, 10% de su volumen de sangre es 193-200 μl. Para una rata promedio de 250 gramos, esto equivale a 1.9-2.0 ml. estudios han demostrado que la eliminación de más del 15% del volumen de la sangre puede causar shock hipovolémico. 1,2 sin embargo, con el reemplazo flúido, hasta un 15% del volumen total de sangre- o 12 μl/g-puede ser quitado. Para un ratón de 25 gramos, esto equivale a 300 μL; para una rata de 250 gramos, equivale a 3 ml. Para reposición de líquidos, los líquidos deben ser calentados y dados subcutáneo.

< clase p = 'jove_content' > si es necesario tomar varias muestras, se reduce el volumen de sangre dibujado. El volumen de sangre máxima que puede obtenerse por semana es no más de 7,5% el volumen total de sangre, o 6 μl/g. Para un ratón de 25 gramos, esto equivale a 145-150 μL por semana. Para una rata de 250 gramos, esto equivale a 1.45 1.50 ml por semana. Si el muestreo se producirá cada 2 semanas, se puede dibujar hasta el 10% del volumen total de sangre (8 μl/g). Esto es equivalente a 200 μL cada 2 semanas por un ratón medio y hasta 2.00 ml cada 2 semanas para una rata de 250 gramos. Un estudio realizado en ratas con el peso promedio de 250 gramos, reveló que cuando se eliminaron los volúmenes de sangre de 15-20%, le tomó más de 29 días para niveles en la sangre normalizar. 1,2 para colección de sangre repetida, reposición de líquidos no permite un mayor volumen de sangre o muestras de sangre más frecuentes, como sólo sustituye a volumen. El animal va a necesitar tiempo para reponer las células de sangre.

< clase p = 'jove_content' > el uso del plexo retro orbital ha sido una práctica común en el pasado. Sin embargo, han surgido muchas preocupaciones sobre la humanidad de este procedimiento. Durante el procedimiento, movimiento excesivo del tubo hematocrito una vez colocado en el canto medial del ojo puede causar daño a los tejidos circundantes, dando por resultado la hinchazón de los párpados o las membranas conjuntivales. Los tejidos inflamados pueden causar el globo ocular sobresale lo suficiente para que se bloqueen el cierre del párpado, potencialmente dando por resultado la sequedad corneal y el daño. Dolor de la hinchazón puede provocar arañazos y uno mismo-mutilación que provoca enucleación del ojo. Colocación inadecuada del tubo de hematocrito durante un sangrado retro orbital puede cortar el nervio óptico, resultando en ceguera. Si el tubo de hematocrito se avanza en un ángulo incorrecto, el ojo puede ser forzado fuera de la órbita, permitiendo que los párpados a caer detrás del globo ocular. Si esto ocurre, es muy difícil reemplazar correctamente el ojo en el zócalo. Otros problemas que pueden surgir incluyen fractura de los huesos frágiles de la órbita, penetración del globo ocular que resulta en la pérdida de humor vítreo, o la formación de un hematoma detrás del ojo que puede causar dolor extremo debido a la presión en el ojo y sus alrededores estructuras. A pesar de todas estas preocupaciones, si un técnico especializado realiza el procedimiento y el animal es completamente anestesiado con anestesia general, como el isoflurano inhalantes anestesia, sangrado retro orbital ha demostrado ser un método eficaz de la sangre colección en roedores.

< clase p = 'jove_content' > la estructura anatómica de la zona orbital es diferente entre el ratón y la rata. El ratón tiene la retro-orbital del seno, una colección de vasos que crear un seno en la zona orbital. En la órbita del ojo de rata, hay un plexo de vasos que desembocan detrás de ese ojo; sin embargo, no forman un seno, como en el ratón. En consecuencia, es más fácil de realizar este procedimiento en ratones. Para la colección de muestreo repetitivo mediante el plexo retro orbitario, un mínimo de 10 días entre sangrados es necesaria para permitir que los tejidos de la zona a curar. Aunque se recomienda la anestesia general, el procedimiento puede realizarse en ratones sin anestesia general si se aplica un anestésico oftálmico tópico, como proparacaine o tetracaína, antes del procedimiento. Como las ratas no tienen el sino de retro-orbital, y porque sus membranas alrededor de la órbita son mucho más fuertes, es obligatorio para anestesiar para este procedimiento.

< clase p = 'jove_content' > Serial muestras de pequeño volumen pueden obtenerse utilizando un método de clip de cola. La primera amputación de la cola debe ser limitada a una extremidad de la cola, aproximadamente 0.5-1.0 mm de longitud en ratones y 2.0 mm en ratas. 1 que el procedimiento de recorte de cola para recolección de sangre permite colecciones serie interrumpiendo la costra o coágulo del original corte en el extremo de la cola. Por lo general, no es necesaria adicional amputación de la punta de la cola. Volúmenes de sangre obtenidos rango 20-100 μL para ratones y 75-150 μL foratas de la r. La cantidad recogida es variable entre los animales y puede ser influenciada por la edad, el estado de salud y peso.

< clase p = 'jove_content' > la muestra de un recorte de cola puede contener sangre arterial y venosa, con contaminación de producto tejido. La calidad de la muestra disminuye si la cola está acariciando o "ordeñada" para obtener más sangre. Para aumentar el flujo sanguíneo, la cola puede ser calentada con compresas tibias, una lámpara de calor o inmersión en agua caliente. Se aplicará presión hasta la punta de la cola para la hemostasia, y animales deben medirse cada 5-10 minutos para lograr hemostasia ha sido. Hemostasia se retrasa a menudo con muestreo repetitivo. Un polvo astringente puede usarse para la hemostasia. Para la amputación inicial, se recomienda anestesia (general o local). Sangrado posterior no requieren anestesia, sobre todo porque los animales se convierten en habituado al procedimiento. Anestesia causará una caída en la presión arterial, dificulta la recolección de sangre con esta técnica.

< clase p = 'jove_content' > una alternativa a un recorte de cola es el nick de vaso de cola. Este procedimiento se realiza fácilmente en ratones y ratas. Sin embargo, al igual que con el recorte de la cola, las muestras pueden estar contaminadas con productos de tejido, especialmente en el ratón. Para las ratas, se inserta una aguja hipodérmica en el vaso y se recoge la sangre desde el centro de la aguja. Un estudio demostró el uso de un torniquete colocado sobre el sitio de punción de la aguja para facilitar la recolección de sangre. 3 No se utiliza una jeringa para extraer la sangre fuera de la nave, como la presión generada de la jeringa derrumbará el buque. Este método también puede utilizarse para tomar muestras de la serie, como un coágulo puede ser removido para hacer el sitio a sangrar otra vez. Como con unas tijeras la cola, es imprescindible para asegurar la hemostasia aplicando presión en el sitio y segunda verificación al animal cada 5-10 minutos.

a menudo, los estudios requieren una muestra de sangre grande que se recopila a través exsanguination mediante una purga intracardiaca o la vena cava caudal, evaluadora. 4 aproximadamente la mitad del volumen total de sangre se puede recoger de un ratón o una rata por punción cardiaca. Esto es equivalente a 40 μl/g o 1 ml aproximadamente para un ratón de 25 gramos promedio. Una rata de 250 gramos produciría aproximadamente 10 ml de sangre. El animal debe ser anestesiado para exsanguination. Anestesia inhalante o narcosis de CO 2 puede ser utilizado por un técnico competente; también puede utilizarse anestesia inyectable. Sin embargo, puede haber una disminución en la presión arterial y circulación, lo que podría disminuir la cantidad de sangre recogidas.

< clase p = 'jove_content' > el método de la vena cava caudal requiere que el animal se profundamente anestesiados para exponer quirúrgicamente el buque. CO 2 narcosis no es suficiente, el corazón debe vencer como el animal respiración durante el retiro de la sangre. Durante el procedimiento, muy rápido de retiro de la sangre puede causar la nave a colapsar en el bisel de la jeringa, ocluir la apertura y prevención colección de sangre. Además, las paredes de los vasos son delgadas, y así movimiento de la mano y la aguja debe evitarse para prevenir ruptura o filtración de sangre desde el sitio de entrada de la aguja. Como no se que pasa la aguja por la piel, este método resulta en la colección de una muestra estéril. Métodos de eutanasia adyuvante deben emplearse para asegurar que el animal no se recupera de la anestesia. Este método es a menudo seguido de perfusión cardiaca o aórtica.

el método intracardiaco puede ser realizado con el animal restringido manualmente una vez que está anestesiado (método cerrado), o el corazón puede estar expuesto quirúrgicamente según el protocolo para la vena cava caudal sangre colección () método Abra el método). El método cerrado, los puntos de interés de colocación de la aguja son el surco formado por la caja torácica en el proceso del xiphoid, en lado izquierdo del animal.

Procedure

1. sangrado retro-orbital

jar
  1. equipos
    1. preparar una campana o cámara de inducción anestésica, para administrar un gas anestésico como isoflurano. Cuando se usa una campana de cristal, es imprescindible que el líquido anestésico no entra en contacto con el animal, para evitar la absorción a través de la piel. Una plataforma con agujeros pequeños se puede utilizar.
    2. Tubos de microhematocrito 75 50 microlitros que se prefieren. Mylar tubos envueltos son menos propensos a romperse entre los dedos del operador y deben considerarse como una medida de seguridad.
    3. Varios espesores de toalla de papel y otros materiales de aislamiento, se colocan en la superficie de trabajo para mantener el animal ' fuego en el cuerpo durante el procedimiento de s.
  2. Preparación y posicionamiento del animal
    1. el animal está anestesiado con una inhalación de anestésica como isoflurano, en una cámara de inducción anestesia campana de vacío o de gas, a efecto de.
    2. Una vez que el animal está completamente anestesiado, se retira y coloca en lateral recumbency.
    3. El ojo se asomaba colocando un dedo en la parte superior de la cabeza y a lo largo de la línea de la mandíbula y tirando de la piel y abajo.
    4. Evite aplicar presión a la tráquea, ya que puede contraer u ocluir la vía aérea que causa muerte por asfixia.
  3. Retirada de la sangre
    1. el microhematocrito se coloca en el canto medial del ojo y dirigido caudalmente en un ángulo de 30-45° del plano de la nariz de.
    2. Aplicar presión girando suavemente el tubo de hematocrito. Esto cortará a través de las membranas conjuntivales y ruptura del plexo ocular.
    3. La sangre fluirá dentro del tubo de hematocrito por acción capilar.
    4. Evite empujar tan profundo que golpeó el hueso en la parte posterior de la cavidad ocular.
    5. Una vez que la sangre comience a fluir, mantener la presión para mantener el ojo resaltado.
    6. Para recoger varios tubos de sangre, no es necesario colocar el tubo siguiente en el plexo ocular, como la sangre seguirá fluyendo y se pueden recoger ya que viene desde el ángulo del ojo intermedio.
    7. Para detener el sangrado, suelte la piel y deje que el ojo volver a la posición normal. Aplique presión en la órbita para asegurar hemostasia.

Figure 1
figura 1. Retiro de la retro orbital sangre en ratones.

2. procedimientos de purga de cola: recorte de cola y cola nick

  1. equipos
    1. A hoja de bisturí estéril, preferiblemente una hoja número 11 o una hoja de afeitar de un solo lado, se utiliza para hacer la amputación inicial para el método de recorte de la cola. Tijeras no deben utilizarse porque el corte de tijeras es el triturado, promoviendo así la coagulación y reducción del flujo sanguíneo. Para el procedimiento de nick de cola, una hoja de bisturí número 11 o 15 se utiliza para hacer el corte.
    2. Un tubo de sujeción que permite el acceso a la cola del ratón está preparado.
    3. Toallas de papel absorbente o gasa se utilizan como sustrato para realizar el recorte de la cola.
    4. Tubos o tubos hematocrito deben también.
    5. Polvo astringente debe estar disponible para ayudar en la hemostasia.
  2. Seguridad
    1. el animal se coloca en el tubo de tal manera que la cola es accesible. Para restrainers tipo de Broome, el animal se tiró grupa primero en el tubo. Para otros tubos, el animal se coloca la cabeza primero.
    2. Animales están asegurados en el tubo de tal manera que no pueden dar la vuelta o retirar la cola.
    3. Algunos ratones permitirá que la colección del snip y la sangre de cola con moderación manual mínimo si pueden agarrar una superficie áspera.
    4. Algunas ratas requieren anestesia inhalatoria para este método de recolección de sangre.
  3. Retirada de la sangre
    1. se limpia la cola con agua tibia para eliminar la suciedad y provocan ligera vasodilatación. No utilice agua caliente.
    2. Para el recorte de la cola, la cola se extiende y se corta el final de la cola (0.5-1 mm para los ratones y hasta 2 mm para las ratas) con la hoja de bisturí.
    3. Para el nick de la cola, la cola se extiende y se hace un corte con la hoja de bisturí aproximadamente 2/3 la distancia de la grupa, directamente sobre la vena lateral de la cola.
    4. La cola se puede acariciar desde la grupa hasta la punta para estimular el flujo de sangre; sin embargo, esto reducirá la calidad de la muestra.
    5. La sangre es recopilada de la punta o el nick usando los tubos de hematocrito o permitida a gotear en un frasco de colección.

3. Colección de sangre cardiaca

  1. equipo
    1. de un ratón, un 3 cc jeringa con un calibre de 22-25 x 1 " aguja es preferida. Las jeringas más pequeñas no tienen la misma presión y pueden hacer más difícil retiro de la sangre. Agujas de menores calibre 25 restringen el flujo sanguíneo, llevando a aumento de la coagulación y dañan a las células de la sangre. Agujas más cortas que 1 " no puede alcanzar el nivel del corazón procedente del diafragma.
    2. Para una rata, una jeringa de 10-12 cc con un calibre 18 x 1,5 " aguja es preferida. Dependiendo del tamaño de la rata, una jeringa más pequeña no puede mantener el volumen de sangre entera a recogerse, y así la jeringa tendría que cambiarse durante el procedimiento. Agujas de menores calibre 20 restringen el flujo de la sangre, conduciendo a mayor coagulación. Agujas de menos de 1.5 " pueden no alcanzar el nivel del corazón cuando se aproxima desde el diafragma.
    3. Se utiliza un tubo de recogida de sangre de tamaño suficiente para contener la sangre recogida.
  2. Seguridad
    1. restricción adecuada es esencial para el éxito de este método. El animal se lleva a cabo por el pescuezo con el cuerpo colgando verticalmente. Es importante que el cuerpo esté recto prevenir la desviación del corazón o una torsión del tórax.
    2. Una posición alternativa es recumbency dorsal cuando se coloca la aguja entre las costillas en el animal ' s lado izquierdo. Esto es especialmente útil para las ratas muy grandes o cuando varios animales a purgarse.

Figure 2
figura 2. Retiro de sangre cardiaca con ratón sostenido verticalmente.

  1. retiro de la sangre
    1. el enfoque del aspecto posterior, punción de la membrana se logra más fácilmente cuando el ratón o rata se lleva a cabo verticalmente por el pescuezo.
      1. La aguja se avanza en la muesca justo a la izquierda del animal ' s xiphoid.
      2. La aguja debe estar paralela a la columna vertebral y colocado justo debajo de las costillas.
      3. El corazón está situado aproximadamente a la altura del codo.
      4. Colocar la aguja, de bisel, en el pecho y perfore el corazón.
      5. Parte posterior leve aplicar presión con la jeringa. Si la aguja está en el corazón, la sangre fluirá en la jeringa de.
      6. Espere hasta que la sangre ha llenado la jeringa antes de añadir presión adicional en el syrInge.
    2. El acercamiento lateral del animal ' s lado izquierdo requiere posicionar el animal en recumbency dorsal.
      1. El punto de entrada se mide contra el punto del codo en la pared torácica. El corazón está situado aproximadamente a la altura del codo.
      2. La aguja es insertada perpendicular al plano de la mesa en un punto a medio camino en la pared torácica medida dorsoventralmente.
      3. Colocar la aguja, de bisel, en el pecho y perfore el corazón.
      4. Parte posterior leve aplicar presión con la jeringa. Si la aguja está en el corazón, la sangre fluirá en la jeringa de.
      5. Esperar hasta que sangre la jeringa antes de agregar el adicional de la contrapresión en la jeringa.

Figure 3
figura 3. Retiro de la sangre cardíaca con el ratón en la posición dorsal recumbency.

  1. consejos técnicos
    1. el corazón normal se encuentra con el vértice apuntando hacia la izquierda. En raras ocasiones, puede invertirse el corazón, resultando en dificultad para perforar el corazón.
    2. Parte posteriora excesiva presión sobre la jeringa puede colapsar el corazón, ocluyendo el bisel de la aguja y parar el flujo de sangre en la jeringa de.
    3. Aplicar presión y soltar varias veces iniciará la coagulación en la jeringa.
    4. Suavemente aplicando presión en el hígado puede forzar el volumen adicional de sangre en el sistema circulatorio, haciéndolo disponible para retiro.

4. Retiro de la sangre de la vena cava posterior

  1. equipos
    1. TB una jeringa con una aguja de calibre 25-29 se utiliza para recolección de sangre en el ratón. Para las ratas, una jeringa de 10-12 cc con un calibre de 22-25 x 1 " aguja se necesita.
    2. Una plataforma quirúrgica, bandeja de disección u otra superficie para asegurar al animal es necesario, junto con lazos, cintas o pasadores para fijar las extremidades en posición.
    3. Inyectable anestesia o anestesia inhalatoria es necesaria. Si se utiliza anestesia inhalatoria, es deseable que el anestésico se entregue a través de un vaporizador de precisión con un cono de nariz. La duración del procedimiento es tal que una cámara de inducción sin suministro de gas anestésico adicional no proporcionará suficiente tiempo para completar el retiro de la sangre antes de que el animal revive.
    4. Tijeras Iris para el ratón, o sala de operaciones sharp-blunt tijeras para la rata, se requiere, junto con pinzas de pulgar de pequeño atraumáticas y 2 " x 2 " gasa.
  2. Seguridad
    1. cuando el animal está completamente anestesiado, como determinado por la presión del dedo del pie o pizca de cola, el animal se coloca en dorsal recumbency.
    2. Las extremidades están aseguradas a la plataforma con cinta o alfileres. Los miembros deben extenderse lejos del cuerpo.
  3. Retirada
    1. la piel se levanta y se hace una pequeña incisión transversal a través de la piel justo por encima de la pelvis en las hembras, o justo por encima del prepucio en los machos.
    2. Lo de las tijeras se coloca en el corte, y se realiza una incisión de línea media a través de la piel de la pelvis/prepucio el xifoides.
    3. La piel se refleja lateralmente a cada lado. Disección Roma puede ser necesaria aflojar el músculo subyacente.
    4. Se levanta el músculo, y se hace una pequeña incisión transversal a través del músculo justo encima del corte de la piel.
    5. Lo de las tijeras se coloca en el abdomen y se realiza una incisión de línea media a través del músculo para el xifoides. Asegúrese de las tijeras de ángulo ' punto hacia arriba para evitar cualquier órganos de corte.
    6. Corte transversalmente a lo largo de la curva de las costillas en cada lado. Ejercicio extra cuidado de no pinchar el hígado.
    7. Mover suavemente los intestinos al animal ' s hacia la izquierda para exponer la vena cava posterior.
    8. Colocar una gasa sobre el hígado y descansar el índice y el dedo medio sobre el hígado.
    9. Con la otra mano, introducir la aguja, de bisel hacia arriba, en la vena cava a medio camino entre el cruce de los vasos renales y la bifurcación ilíaca.
    10. Retire lentamente la sangre mientras se aplica presión sobre el hígado.

Figure 4
figura 4. Retiro de posterior vena cava la sangre.

colección de la sangre es un requisito común para varios estudios de investigación que involucran a ratones y ratas. La elección del método para el retiro de la sangre en estos animales depende de muchos factores como el volumen de sangre necesario, frecuencia del muestreo, estado de salud del animal para purgarse y el nivel de habilidad del técnico.

Aquí, vamos a revisar estas consideraciones y procedimientos de contorno sangre colección incluyendo el sangrado retro orbital ojo, cola tijeras de hojalatero y mellas, así como la colección de sangre intra cardiaca. Para otros métodos vea el segundo video de esta serie.

antes de adentrarse en los protocolos de retirada de la sangre, que ' s repasar primero algunas consideraciones generales como tipo de muestra, selección de agujas y el volumen de sangre máxima que se puede recoger. Antes de recoger la sangre de un ratón o una rata, se determinará el tipo de muestra de sangre necesaria. Procedimientos experimentales podrían requerir sangre entera, plasma o suero.

Si recoger sangre entera, debe agregarse un anticoagulante a la muestra para evitar la coagulación. Anticoagulantes comúnmente usados incluyen heparina, citrato de sodio y ácido de etilendiamina tetraacético, abreviado como EDTA. Anticoagulantes pueden cargarse directamente en la jeringa para recubrir las superficies. Esto permite el contacto de anticoagulante directamente como se extrae la sangre ayudando en la prevención de la coagulación. Porque roedor sangre coagula rápidamente, es esencial utilizar la proporción correcta de anticoagulante a la sangre. Colección de plasma requiere centrifugación de sangre total con anticoagulante. Después de la vuelta, el líquido transparente sobre la capa del CMB y plaquetas es plasma. Contiene fibrinógeno y otros factores de la coagulación. Por otro lado, se obtiene suero de anticoagulantes de sin de muestra de sangre entera. Y porque la muestra se haya coagulado, el suero, que es el mejor jugador, no contiene fibrinógeno ni otros factores de la coagulación.

Selección de agujas de

se basa en el tamaño del animal y el sitio de la venopunción. En general, agujas de gran diámetro causan menos daño a las células de la sangre y permiten la recolección de sangre más rápido; pero son más propensos a causar daño a los vasos. Longitud de la aguja se debe considerar también. Si una aguja es demasiado larga, puede ser incómodo de usar, o sangre podría comenzar a coagularse todavía dentro de la aguja. Las opciones de rangos de tamaño de 18 a 29 calibre y 0.5 a 1.5 pulgadas de largo. El tamaño de la aguja adecuada para cada método será discutido en la sección procedimientos.

Por último, debido al pequeño tamaño de los roedores, hay una cantidad máxima de sangre que se puede recoger en un sorteo de sangre única, que no causará daños graves al organismo. Retiro de la sangre puede ser sin o con el reemplazo flúido - generalmente se hace con solución salina fisiológica 0.9%. El límite máximo en cada caso se encuentra en el protocolo de texto abajo. Además, algunos experimentos requieren la recogida de muestras múltiples y en estos casos junto con el reemplazo flúido animal va a necesitar tiempo entre para reponer las células de sangre. Otra vez, hay una cantidad máxima que se puede recoger durante la colección serial, y los límites superiores aparecen en el protocolo siguiente.

después de revisar algunas consideraciones generales, let & #39; s saltar en las técnicas de retirada sangre específica, a partir de retro-orbital sangrado - una técnica usada por los científicos para recoger pequeñas cantidades de los vasos cerca del ojo. Tenga en cuenta que la estructura anatómica de la zona orbital es diferente entre el ratón y la rata. Las ratas tienen un plexo de vasos que desembocan detrás del ojo, mientras que el ratón tiene una colección de vasos que crear un retro seno orbital, que hace que es más fácil de realizar este procedimiento en ratones.

Empezar agarrando un tubo para recolección de sangre. Se prefieren los tubos de micro hematocrito que 75 50 microlitros. Colocar varias toallas de papel u otros materiales aislantes en la superficie de trabajo. Esto es para mantener el animal ' calor de cuerpo de s durante el procedimiento. Ahora anestesiar al animal con una inhalación de anestésica como isoflurano. Una vez que el animal está anestesiado totalmente, retire de la cámara y coloque sobre su lado que está en posición de recumbency lateral. A continuación, coloque un dedo en la parte superior de la cabeza y a lo largo de la línea de la mandíbula y tire la piel hacia atrás y abajo para inducir la protrusión del ojo. Evite aplicar presión a la tráquea, ya puede causar la muerte por asfixia. Posteriormente, coloque el tubo de micro hematocrito en el canto medial del ojo y dirigen caudalmente en un ángulo de 30 a 45 grados del plano de la nariz. Aplique presión girando suavemente el tubo. Esto corta a través de las membranas conjuntivales y ruptura del plexo ocular o seno. La sangre fluye por acción capilar en el tubo de hematocrito. No empujar el tubo tan profundo que golpeó el hueso en la parte posterior de la cavidad ocular. Una vez que la sangre comience a fluir, mantener la presión para mantener el ojo resaltado. Para detener el sangrado, suelte la piel y deje que el ojo volver a la posición normal. Aplique presión para promover la hemostasia. Para la recolección de muestras repetidas, permiten un mínimo de 10 días entre las hemorragias. Esto proporciona a los tejidos algún tiempo para sanar.

Aunque sangrado retro orbital es un procedimiento común, hay muchas preocupaciones sobre su humanidad. Estos incluyen hinchazón debido a un movimiento excesivo del tubo de hematocrito. Esto a su vez puede causar la protuberancia del globo ocular e impedir el cierre del párpado resultando en sequedad, daño y dolor, que puede provocar arañazos y uno mismo-mutilación corneal. Colocación inadecuada del tubo de hematocrito puede cortar el nervio óptico dando lugar a ceguera. Otra posible complicación es que el ojo puede ser forzado fuera de la órbita, permitiendo que los párpados a caer detrás del globo ocular. Además, pueden surgir problemas de la fractura de los huesos frágiles de la órbita, penetración del globo ocular dando por resultado la pérdida de humor vítreo, o la formación de un hematoma detrás del ojo que puede causar dolor extremo. A pesar de todas estas preocupaciones, si un técnico especializado realiza el procedimiento y el animal está anestesiado totalmente, sangrado retro orbital es un método eficaz de recolección de sangre en roedores.

pues ' s revisar las consideraciones y procedimientos para el sangrado de la cola, que permite la recopilación de una serie de muestras de pequeños volúmenes. Los equipos necesitan para este procedimiento incluyen un bisturí estéril número 11. Tijeras deben no utilizarse porque el corte de tijeras es el triturado, que pueden promover la coagulación y reducir el flujo de sangre. Otros instrumentos son un tubo de sujeción que permite el acceso al animal ' cola s; toallas de papel absorbente; tubos de colección o hematocrito y polvo hemostático - para facilitar la hemostasia.

Comienza por asegurar el animal en el tubo de retención. Luego, limpie la cola con agua tibia para eliminar la suciedad y provocan ligera vasodilatación. No use agua caliente. Extienda la cola y con la hoja de bisturí cortar el final de la cola para recoger la sangre utilizando tubos hematocrito o colección. La cola se puede acariciar o " ordeñada " de ANCA hasta la punta para estimular el flujo sanguíneo. Esto, sin embargo, disminuirá la calidad de la muestra.

Para detener la hemorragia, aplique presión en la punta de la cola con una gasa. El polvo hemostático puede utilizarse para conseguir la hemostasia. Compruebe los animales cada 5 a 10 minutos para asegurar la hemostasia se ha logrado, que podría retrasarse después del muestreo repetido. La muestra de un recorte de cola puede contener sangre arterial y venosa, con contaminación de producto tejido. Sin embargo, este procedimiento para recolección de sangre permite colecciones serie interrumpiendo la costra o coágulo del corte original en el extremo de la cola.

Un método de colección de sangre alternativa a un recorte de cola es el nick de vasos de cola, que es relativamente menos invasivo. Para ello, utilizando la misma hoja de bisturí, hacer un corte pequeño directamente sobre la vena lateral de la cola, aproximadamente dos tercios la distancia desde la grupa. Como con unas tijeras cola, sangre puede recogerse en tubos hematocrito o colección. Y es imprescindible para asegurar la hemostasia por presión en el sitio y segunda verificación al animal cada 5-10 minutos. Sin embargo, al igual que con el recorte de la cola, las muestras pueden estar contaminadas con productos tejido.

a menudo los estudios que requieren una muestra de sangre grande no de supervivencia, que se logra a través exsanguination mediante un sangrado intra cardiaca o la vena cava caudal.

Método intra cardiacos en ratones, necesita una jeringa 3 de cc con una aguja de 1 pulgada de calibre 22 -25. Y para las ratas, una jeringa de 10-12 cc con una aguja de 1.5 pulgadas 18 calibre es preferido. Ver el protocolo a continuación para entender el por qué estas necesidades y jeringas son ideales.

Inicio por euthanizing animales usando dióxido de carbono. Después de la eutanasia, sujete el roedor por el pescuezo con el cuerpo colgando verticalmente. Este refrena es importante como el cuerpo debe ser recto para evitar desviación del corazón o una torsión del pecho. Cuenta que el corazón se encuentra aproximadamente a la altura del codo. La inserción es en la muesca justo a la izquierda de la xifoides, paralelo a la espina dorsal y debajo de las costillas.

Introducir la aguja, de bisel, en el pecho y perfore el corazón. Aplicar contrapresión leve con la jeringa. Si la aguja está en el corazón, la sangre fluirá en la jeringa. Espere hasta que la sangre ha llenado el barril antes de agregar la contrapresión adicional. Aproximadamente la mitad del volumen total de sangre se puede recoger de un ratón o una rata por punción cardiaca. Esto es equivalente a aproximadamente 1 mL de sangre de un ratón medio y aproximadamente 10 mL de sangre de una rata promedio

una posición alternativa es recumbency dorsal cuando se utiliza el acercamiento lateral. En este caso, coloque la aguja entre las costillas en el animal ' s lado izquierdo. El punto de entrada se mide contra el punto del codo en la pared torácica. Introducir la aguja, de bisel hacia arriba, perpendicular al plano de la mesa en un punto a medio camino en la pared torácica. Aplicar ligera presión con la jeringa. Si la aguja está en el corazón la sangre fluirá en la jeringa. Otra vez, espere a que la sangre ha llenado el barril antes de agregar la contrapresión adicional. Nota que en cualquier posición, contrapresión excesiva puede colapsar el corazón ocluyendo el bisel de la aguja y parar el flujo de sangre en la jeringa de.

Otro método para recoger la sangre cardiaca es a través de la vena cava caudal. El equipo necesario para este procedimiento son una jeringa apropiada con una aguja de tamaño correcto atada; Tijeras para la apertura de la cavidad abdominal, pinzas de pulgar de pequeño atraumáticas y gasa esponja. Esta técnica requiere que el animal sea anestesiado profundamente und mantenida bajo anestesia durante el procedimiento. Narcosis por CO2 no es una opción, como el corazón animal debe batir para este procedimiento. Coloque el animal en posición dorsal recumbency y garantizar a los miembros a la plataforma. Los miembros deben extenderse lejos del cuerpo.

Ahora Levante la piel con pinzas y utilice tijeras para hacer un pequeño corte transversal a través de la piel justo por encima de la pelvis en las hembras o prepucio en los machos. A continuación, coloque la punta de las tijeras en el corte y haga una incisión de línea media a través de la piel de la pelvis o el prepucio en el xifoides. La piel reflejada lateralmente, levante el músculo y hacer un pequeño corte transversal a través del músculo, justo por encima del corte de la piel.

Coloque la punta de la tijera en el abdomen y realizar una incisión de línea media a través del músculo en el xifoides. No olvide el punto tijera hacia arriba para evitar cualquier órganos de corte de ángulo. Corte transversal a lo largo de la curva de las costillas a cada lado. Tenga cuidado de no pinchar el hígado. Mueva suavemente los intestinos al animal ' s hacia la izquierda para exponer la vena cava posterior. Coloque una gasa sobre el hígado y descansar el dedo índice y medio sobre él. Con la otra mano, introducir la aguja, de bisel para arriba en la vena cava, a medio camino entre el cruce de los vasos renales y la bifurcación ilíaca. Retire lentamente la sangre mientras se aplica presión sobre el hígado.

Evitar movimiento de la mano, que puede causar la ruptura del recipiente. También, retiro de la sangre demasiado rápido puede causar la nave a colapsar en el bisel ocluir la apertura y prevención colección de sangre. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad para obtener una muestra estéril porque la aguja no pasa a través de la piel.

por último, dejar que ' s ver algunas aplicaciones de estas técnicas de retirada de la sangre. Inmuno-Oncología es un campo emergente, y los investigadores en esta área a menudo realizan recogida de sangre para estudiar las células inmunes en las diferentes etapas de desarrollo del cáncer. Por ejemplo, aquí los investigadores recogen sangre cardiaca de ratones portadores de cáncer de aislar y cuantificar neutrófilos en diez, veinte y treinta días después de engraftment tumor.

Composición de la sangre por otro lado, también es estudiado por los fisiólogos. Como en este estudio, los investigadores estaban interesados en la evaluación de la función renal en los animales diabéticos. Para ello, estos científicos primero inyectan un tinte en un modelo animal de diabetes. A continuación, entonces utilizaron método de recorte de cola para recoger la sangre en varios puntos del tiempo para evaluar la concentración de tinte en la sangre, que finalmente fue utilizada para calcular la tasa de filtración glomerular que puso de relieve la diferencia en la función del riñón después de diabetes inducción.

Por último, derivan células investigadores uso las muestras de sangre para evaluar el éxito de la incorporación de células de un donante en el receptor ' sistema. Aquí, los investigadores primero trasplantan células de médula ósea de un ratón macho en un tipo salvaje y animal femenino genéticamente modificado mediante la inyección de la vena de la cola. A continuación, recolectaron sangre de seno orbital retro del ratón receptor para estudiar el ADN genómico de las células sanguíneas mediante reacción en cadena de polimerasa. Esto proporcionó el porcentaje del engraftment de células de donantes en los dos tipos de animales.

te ' ve a Miró JoVE ' primera entrega s en técnicas de retirada de sangre. Por favor vea el siguiente video en serie para examinar cómo llevar a cabo otras técnicas comúnmente empleadas de colección de sangre en animales de laboratorio. Como siempre, gracias por ver!

Summary

< clase p = 'jove_content' > colección de la sangre de las ratas y ratones se puede lograr con una variedad de técnicas. Aunque muchos factores, como tamaño de muestra, frecuencia de muestreo y el tamaño y edad del animal influyen en esto, el componente más esencial es el nivel de habilidad del técnico que realiza la recogida de la muestra. Para los métodos descritos aquí, el uso apropiado de anestésicos es también crucial para las muestras de la calidad y el bienestar de los animales.

References

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  2. Diehl, K.H., Hull, R., Morton, D., Pfister, R., Rabemampianina, Y., Smith, D., Vidal, J.M., and van de Vorstenbosch, C. 2001. A good practical guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21. 15-23.
  3. Omaye, S.T., Skala, J.H., Gretz, M.D., Schaus, E.E., and Wade, C.E. 1987. Simple method for bleeding the unanaesthetized rat by tail venipuncture. Laboratory Animals. 21. 261-264.
  4. Adeghe, A.J-H. and Cohen, J. 1986. A better method for terminal bleeding of mice. Laboratory Animals. 20. 70-72.

1. sangrado retro-orbital

jar
  1. equipos
    1. preparar una campana o cámara de inducción anestésica, para administrar un gas anestésico como isoflurano. Cuando se usa una campana de cristal, es imprescindible que el líquido anestésico no entra en contacto con el animal, para evitar la absorción a través de la piel. Una plataforma con agujeros pequeños se puede utilizar.
    2. Tubos de microhematocrito 75 50 microlitros que se prefieren. Mylar tubos envueltos son menos propensos a romperse entre los dedos del operador y deben considerarse como una medida de seguridad.
    3. Varios espesores de toalla de papel y otros materiales de aislamiento, se colocan en la superficie de trabajo para mantener el animal ' fuego en el cuerpo durante el procedimiento de s.
  2. Preparación y posicionamiento del animal
    1. el animal está anestesiado con una inhalación de anestésica como isoflurano, en una cámara de inducción anestesia campana de vacío o de gas, a efecto de.
    2. Una vez que el animal está completamente anestesiado, se retira y coloca en lateral recumbency.
    3. El ojo se asomaba colocando un dedo en la parte superior de la cabeza y a lo largo de la línea de la mandíbula y tirando de la piel y abajo.
    4. Evite aplicar presión a la tráquea, ya que puede contraer u ocluir la vía aérea que causa muerte por asfixia.
  3. Retirada de la sangre
    1. el microhematocrito se coloca en el canto medial del ojo y dirigido caudalmente en un ángulo de 30-45° del plano de la nariz de.
    2. Aplicar presión girando suavemente el tubo de hematocrito. Esto cortará a través de las membranas conjuntivales y ruptura del plexo ocular.
    3. La sangre fluirá dentro del tubo de hematocrito por acción capilar.
    4. Evite empujar tan profundo que golpeó el hueso en la parte posterior de la cavidad ocular.
    5. Una vez que la sangre comience a fluir, mantener la presión para mantener el ojo resaltado.
    6. Para recoger varios tubos de sangre, no es necesario colocar el tubo siguiente en el plexo ocular, como la sangre seguirá fluyendo y se pueden recoger ya que viene desde el ángulo del ojo intermedio.
    7. Para detener el sangrado, suelte la piel y deje que el ojo volver a la posición normal. Aplique presión en la órbita para asegurar hemostasia.

Figure 1
figura 1. Retiro de la retro orbital sangre en ratones.

2. procedimientos de purga de cola: recorte de cola y cola nick

  1. equipos
    1. A hoja de bisturí estéril, preferiblemente una hoja número 11 o una hoja de afeitar de un solo lado, se utiliza para hacer la amputación inicial para el método de recorte de la cola. Tijeras no deben utilizarse porque el corte de tijeras es el triturado, promoviendo así la coagulación y reducción del flujo sanguíneo. Para el procedimiento de nick de cola, una hoja de bisturí número 11 o 15 se utiliza para hacer el corte.
    2. Un tubo de sujeción que permite el acceso a la cola del ratón está preparado.
    3. Toallas de papel absorbente o gasa se utilizan como sustrato para realizar el recorte de la cola.
    4. Tubos o tubos hematocrito deben también.
    5. Polvo astringente debe estar disponible para ayudar en la hemostasia.
  2. Seguridad
    1. el animal se coloca en el tubo de tal manera que la cola es accesible. Para restrainers tipo de Broome, el animal se tiró grupa primero en el tubo. Para otros tubos, el animal se coloca la cabeza primero.
    2. Animales están asegurados en el tubo de tal manera que no pueden dar la vuelta o retirar la cola.
    3. Algunos ratones permitirá que la colección del snip y la sangre de cola con moderación manual mínimo si pueden agarrar una superficie áspera.
    4. Algunas ratas requieren anestesia inhalatoria para este método de recolección de sangre.
  3. Retirada de la sangre
    1. se limpia la cola con agua tibia para eliminar la suciedad y provocan ligera vasodilatación. No utilice agua caliente.
    2. Para el recorte de la cola, la cola se extiende y se corta el final de la cola (0.5-1 mm para los ratones y hasta 2 mm para las ratas) con la hoja de bisturí.
    3. Para el nick de la cola, la cola se extiende y se hace un corte con la hoja de bisturí aproximadamente 2/3 la distancia de la grupa, directamente sobre la vena lateral de la cola.
    4. La cola se puede acariciar desde la grupa hasta la punta para estimular el flujo de sangre; sin embargo, esto reducirá la calidad de la muestra.
    5. La sangre es recopilada de la punta o el nick usando los tubos de hematocrito o permitida a gotear en un frasco de colección.

3. Colección de sangre cardiaca

  1. equipo
    1. de un ratón, un 3 cc jeringa con un calibre de 22-25 x 1 " aguja es preferida. Las jeringas más pequeñas no tienen la misma presión y pueden hacer más difícil retiro de la sangre. Agujas de menores calibre 25 restringen el flujo sanguíneo, llevando a aumento de la coagulación y dañan a las células de la sangre. Agujas más cortas que 1 " no puede alcanzar el nivel del corazón procedente del diafragma.
    2. Para una rata, una jeringa de 10-12 cc con un calibre 18 x 1,5 " aguja es preferida. Dependiendo del tamaño de la rata, una jeringa más pequeña no puede mantener el volumen de sangre entera a recogerse, y así la jeringa tendría que cambiarse durante el procedimiento. Agujas de menores calibre 20 restringen el flujo de la sangre, conduciendo a mayor coagulación. Agujas de menos de 1.5 " pueden no alcanzar el nivel del corazón cuando se aproxima desde el diafragma.
    3. Se utiliza un tubo de recogida de sangre de tamaño suficiente para contener la sangre recogida.
  2. Seguridad
    1. restricción adecuada es esencial para el éxito de este método. El animal se lleva a cabo por el pescuezo con el cuerpo colgando verticalmente. Es importante que el cuerpo esté recto prevenir la desviación del corazón o una torsión del tórax.
    2. Una posición alternativa es recumbency dorsal cuando se coloca la aguja entre las costillas en el animal ' s lado izquierdo. Esto es especialmente útil para las ratas muy grandes o cuando varios animales a purgarse.

Figure 2
figura 2. Retiro de sangre cardiaca con ratón sostenido verticalmente.

  1. retiro de la sangre
    1. el enfoque del aspecto posterior, punción de la membrana se logra más fácilmente cuando el ratón o rata se lleva a cabo verticalmente por el pescuezo.
      1. La aguja se avanza en la muesca justo a la izquierda del animal ' s xiphoid.
      2. La aguja debe estar paralela a la columna vertebral y colocado justo debajo de las costillas.
      3. El corazón está situado aproximadamente a la altura del codo.
      4. Colocar la aguja, de bisel, en el pecho y perfore el corazón.
      5. Parte posterior leve aplicar presión con la jeringa. Si la aguja está en el corazón, la sangre fluirá en la jeringa de.
      6. Espere hasta que la sangre ha llenado la jeringa antes de añadir presión adicional en el syrInge.
    2. El acercamiento lateral del animal ' s lado izquierdo requiere posicionar el animal en recumbency dorsal.
      1. El punto de entrada se mide contra el punto del codo en la pared torácica. El corazón está situado aproximadamente a la altura del codo.
      2. La aguja es insertada perpendicular al plano de la mesa en un punto a medio camino en la pared torácica medida dorsoventralmente.
      3. Colocar la aguja, de bisel, en el pecho y perfore el corazón.
      4. Parte posterior leve aplicar presión con la jeringa. Si la aguja está en el corazón, la sangre fluirá en la jeringa de.
      5. Esperar hasta que sangre la jeringa antes de agregar el adicional de la contrapresión en la jeringa.

Figure 3
figura 3. Retiro de la sangre cardíaca con el ratón en la posición dorsal recumbency.

  1. consejos técnicos
    1. el corazón normal se encuentra con el vértice apuntando hacia la izquierda. En raras ocasiones, puede invertirse el corazón, resultando en dificultad para perforar el corazón.
    2. Parte posteriora excesiva presión sobre la jeringa puede colapsar el corazón, ocluyendo el bisel de la aguja y parar el flujo de sangre en la jeringa de.
    3. Aplicar presión y soltar varias veces iniciará la coagulación en la jeringa.
    4. Suavemente aplicando presión en el hígado puede forzar el volumen adicional de sangre en el sistema circulatorio, haciéndolo disponible para retiro.

4. Retiro de la sangre de la vena cava posterior

  1. equipos
    1. TB una jeringa con una aguja de calibre 25-29 se utiliza para recolección de sangre en el ratón. Para las ratas, una jeringa de 10-12 cc con un calibre de 22-25 x 1 " aguja se necesita.
    2. Una plataforma quirúrgica, bandeja de disección u otra superficie para asegurar al animal es necesario, junto con lazos, cintas o pasadores para fijar las extremidades en posición.
    3. Inyectable anestesia o anestesia inhalatoria es necesaria. Si se utiliza anestesia inhalatoria, es deseable que el anestésico se entregue a través de un vaporizador de precisión con un cono de nariz. La duración del procedimiento es tal que una cámara de inducción sin suministro de gas anestésico adicional no proporcionará suficiente tiempo para completar el retiro de la sangre antes de que el animal revive.
    4. Tijeras Iris para el ratón, o sala de operaciones sharp-blunt tijeras para la rata, se requiere, junto con pinzas de pulgar de pequeño atraumáticas y 2 " x 2 " gasa.
  2. Seguridad
    1. cuando el animal está completamente anestesiado, como determinado por la presión del dedo del pie o pizca de cola, el animal se coloca en dorsal recumbency.
    2. Las extremidades están aseguradas a la plataforma con cinta o alfileres. Los miembros deben extenderse lejos del cuerpo.
  3. Retirada
    1. la piel se levanta y se hace una pequeña incisión transversal a través de la piel justo por encima de la pelvis en las hembras, o justo por encima del prepucio en los machos.
    2. Lo de las tijeras se coloca en el corte, y se realiza una incisión de línea media a través de la piel de la pelvis/prepucio el xifoides.
    3. La piel se refleja lateralmente a cada lado. Disección Roma puede ser necesaria aflojar el músculo subyacente.
    4. Se levanta el músculo, y se hace una pequeña incisión transversal a través del músculo justo encima del corte de la piel.
    5. Lo de las tijeras se coloca en el abdomen y se realiza una incisión de línea media a través del músculo para el xifoides. Asegúrese de las tijeras de ángulo ' punto hacia arriba para evitar cualquier órganos de corte.
    6. Corte transversalmente a lo largo de la curva de las costillas en cada lado. Ejercicio extra cuidado de no pinchar el hígado.
    7. Mover suavemente los intestinos al animal ' s hacia la izquierda para exponer la vena cava posterior.
    8. Colocar una gasa sobre el hígado y descansar el índice y el dedo medio sobre el hígado.
    9. Con la otra mano, introducir la aguja, de bisel hacia arriba, en la vena cava a medio camino entre el cruce de los vasos renales y la bifurcación ilíaca.
    10. Retire lentamente la sangre mientras se aplica presión sobre el hígado.

Figure 4
figura 4. Retiro de posterior vena cava la sangre.

colección de la sangre es un requisito común para varios estudios de investigación que involucran a ratones y ratas. La elección del método para el retiro de la sangre en estos animales depende de muchos factores como el volumen de sangre necesario, frecuencia del muestreo, estado de salud del animal para purgarse y el nivel de habilidad del técnico.

Aquí, vamos a revisar estas consideraciones y procedimientos de contorno sangre colección incluyendo el sangrado retro orbital ojo, cola tijeras de hojalatero y mellas, así como la colección de sangre intra cardiaca. Para otros métodos vea el segundo video de esta serie.

antes de adentrarse en los protocolos de retirada de la sangre, que ' s repasar primero algunas consideraciones generales como tipo de muestra, selección de agujas y el volumen de sangre máxima que se puede recoger. Antes de recoger la sangre de un ratón o una rata, se determinará el tipo de muestra de sangre necesaria. Procedimientos experimentales podrían requerir sangre entera, plasma o suero.

Si recoger sangre entera, debe agregarse un anticoagulante a la muestra para evitar la coagulación. Anticoagulantes comúnmente usados incluyen heparina, citrato de sodio y ácido de etilendiamina tetraacético, abreviado como EDTA. Anticoagulantes pueden cargarse directamente en la jeringa para recubrir las superficies. Esto permite el contacto de anticoagulante directamente como se extrae la sangre ayudando en la prevención de la coagulación. Porque roedor sangre coagula rápidamente, es esencial utilizar la proporción correcta de anticoagulante a la sangre. Colección de plasma requiere centrifugación de sangre total con anticoagulante. Después de la vuelta, el líquido transparente sobre la capa del CMB y plaquetas es plasma. Contiene fibrinógeno y otros factores de la coagulación. Por otro lado, se obtiene suero de anticoagulantes de sin de muestra de sangre entera. Y porque la muestra se haya coagulado, el suero, que es el mejor jugador, no contiene fibrinógeno ni otros factores de la coagulación.

Selección de agujas de

se basa en el tamaño del animal y el sitio de la venopunción. En general, agujas de gran diámetro causan menos daño a las células de la sangre y permiten la recolección de sangre más rápido; pero son más propensos a causar daño a los vasos. Longitud de la aguja se debe considerar también. Si una aguja es demasiado larga, puede ser incómodo de usar, o sangre podría comenzar a coagularse todavía dentro de la aguja. Las opciones de rangos de tamaño de 18 a 29 calibre y 0.5 a 1.5 pulgadas de largo. El tamaño de la aguja adecuada para cada método será discutido en la sección procedimientos.

Por último, debido al pequeño tamaño de los roedores, hay una cantidad máxima de sangre que se puede recoger en un sorteo de sangre única, que no causará daños graves al organismo. Retiro de la sangre puede ser sin o con el reemplazo flúido - generalmente se hace con solución salina fisiológica 0.9%. El límite máximo en cada caso se encuentra en el protocolo de texto abajo. Además, algunos experimentos requieren la recogida de muestras múltiples y en estos casos junto con el reemplazo flúido animal va a necesitar tiempo entre para reponer las células de sangre. Otra vez, hay una cantidad máxima que se puede recoger durante la colección serial, y los límites superiores aparecen en el protocolo siguiente.

después de revisar algunas consideraciones generales, let & #39; s saltar en las técnicas de retirada sangre específica, a partir de retro-orbital sangrado - una técnica usada por los científicos para recoger pequeñas cantidades de los vasos cerca del ojo. Tenga en cuenta que la estructura anatómica de la zona orbital es diferente entre el ratón y la rata. Las ratas tienen un plexo de vasos que desembocan detrás del ojo, mientras que el ratón tiene una colección de vasos que crear un retro seno orbital, que hace que es más fácil de realizar este procedimiento en ratones.

Empezar agarrando un tubo para recolección de sangre. Se prefieren los tubos de micro hematocrito que 75 50 microlitros. Colocar varias toallas de papel u otros materiales aislantes en la superficie de trabajo. Esto es para mantener el animal ' calor de cuerpo de s durante el procedimiento. Ahora anestesiar al animal con una inhalación de anestésica como isoflurano. Una vez que el animal está anestesiado totalmente, retire de la cámara y coloque sobre su lado que está en posición de recumbency lateral. A continuación, coloque un dedo en la parte superior de la cabeza y a lo largo de la línea de la mandíbula y tire la piel hacia atrás y abajo para inducir la protrusión del ojo. Evite aplicar presión a la tráquea, ya puede causar la muerte por asfixia. Posteriormente, coloque el tubo de micro hematocrito en el canto medial del ojo y dirigen caudalmente en un ángulo de 30 a 45 grados del plano de la nariz. Aplique presión girando suavemente el tubo. Esto corta a través de las membranas conjuntivales y ruptura del plexo ocular o seno. La sangre fluye por acción capilar en el tubo de hematocrito. No empujar el tubo tan profundo que golpeó el hueso en la parte posterior de la cavidad ocular. Una vez que la sangre comience a fluir, mantener la presión para mantener el ojo resaltado. Para detener el sangrado, suelte la piel y deje que el ojo volver a la posición normal. Aplique presión para promover la hemostasia. Para la recolección de muestras repetidas, permiten un mínimo de 10 días entre las hemorragias. Esto proporciona a los tejidos algún tiempo para sanar.

Aunque sangrado retro orbital es un procedimiento común, hay muchas preocupaciones sobre su humanidad. Estos incluyen hinchazón debido a un movimiento excesivo del tubo de hematocrito. Esto a su vez puede causar la protuberancia del globo ocular e impedir el cierre del párpado resultando en sequedad, daño y dolor, que puede provocar arañazos y uno mismo-mutilación corneal. Colocación inadecuada del tubo de hematocrito puede cortar el nervio óptico dando lugar a ceguera. Otra posible complicación es que el ojo puede ser forzado fuera de la órbita, permitiendo que los párpados a caer detrás del globo ocular. Además, pueden surgir problemas de la fractura de los huesos frágiles de la órbita, penetración del globo ocular dando por resultado la pérdida de humor vítreo, o la formación de un hematoma detrás del ojo que puede causar dolor extremo. A pesar de todas estas preocupaciones, si un técnico especializado realiza el procedimiento y el animal está anestesiado totalmente, sangrado retro orbital es un método eficaz de recolección de sangre en roedores.

pues ' s revisar las consideraciones y procedimientos para el sangrado de la cola, que permite la recopilación de una serie de muestras de pequeños volúmenes. Los equipos necesitan para este procedimiento incluyen un bisturí estéril número 11. Tijeras deben no utilizarse porque el corte de tijeras es el triturado, que pueden promover la coagulación y reducir el flujo de sangre. Otros instrumentos son un tubo de sujeción que permite el acceso al animal ' cola s; toallas de papel absorbente; tubos de colección o hematocrito y polvo hemostático - para facilitar la hemostasia.

Comienza por asegurar el animal en el tubo de retención. Luego, limpie la cola con agua tibia para eliminar la suciedad y provocan ligera vasodilatación. No use agua caliente. Extienda la cola y con la hoja de bisturí cortar el final de la cola para recoger la sangre utilizando tubos hematocrito o colección. La cola se puede acariciar o " ordeñada " de ANCA hasta la punta para estimular el flujo sanguíneo. Esto, sin embargo, disminuirá la calidad de la muestra.

Para detener la hemorragia, aplique presión en la punta de la cola con una gasa. El polvo hemostático puede utilizarse para conseguir la hemostasia. Compruebe los animales cada 5 a 10 minutos para asegurar la hemostasia se ha logrado, que podría retrasarse después del muestreo repetido. La muestra de un recorte de cola puede contener sangre arterial y venosa, con contaminación de producto tejido. Sin embargo, este procedimiento para recolección de sangre permite colecciones serie interrumpiendo la costra o coágulo del corte original en el extremo de la cola.

Un método de colección de sangre alternativa a un recorte de cola es el nick de vasos de cola, que es relativamente menos invasivo. Para ello, utilizando la misma hoja de bisturí, hacer un corte pequeño directamente sobre la vena lateral de la cola, aproximadamente dos tercios la distancia desde la grupa. Como con unas tijeras cola, sangre puede recogerse en tubos hematocrito o colección. Y es imprescindible para asegurar la hemostasia por presión en el sitio y segunda verificación al animal cada 5-10 minutos. Sin embargo, al igual que con el recorte de la cola, las muestras pueden estar contaminadas con productos tejido.

a menudo los estudios que requieren una muestra de sangre grande no de supervivencia, que se logra a través exsanguination mediante un sangrado intra cardiaca o la vena cava caudal.

Método intra cardiacos en ratones, necesita una jeringa 3 de cc con una aguja de 1 pulgada de calibre 22 -25. Y para las ratas, una jeringa de 10-12 cc con una aguja de 1.5 pulgadas 18 calibre es preferido. Ver el protocolo a continuación para entender el por qué estas necesidades y jeringas son ideales.

Inicio por euthanizing animales usando dióxido de carbono. Después de la eutanasia, sujete el roedor por el pescuezo con el cuerpo colgando verticalmente. Este refrena es importante como el cuerpo debe ser recto para evitar desviación del corazón o una torsión del pecho. Cuenta que el corazón se encuentra aproximadamente a la altura del codo. La inserción es en la muesca justo a la izquierda de la xifoides, paralelo a la espina dorsal y debajo de las costillas.

Introducir la aguja, de bisel, en el pecho y perfore el corazón. Aplicar contrapresión leve con la jeringa. Si la aguja está en el corazón, la sangre fluirá en la jeringa. Espere hasta que la sangre ha llenado el barril antes de agregar la contrapresión adicional. Aproximadamente la mitad del volumen total de sangre se puede recoger de un ratón o una rata por punción cardiaca. Esto es equivalente a aproximadamente 1 mL de sangre de un ratón medio y aproximadamente 10 mL de sangre de una rata promedio

una posición alternativa es recumbency dorsal cuando se utiliza el acercamiento lateral. En este caso, coloque la aguja entre las costillas en el animal ' s lado izquierdo. El punto de entrada se mide contra el punto del codo en la pared torácica. Introducir la aguja, de bisel hacia arriba, perpendicular al plano de la mesa en un punto a medio camino en la pared torácica. Aplicar ligera presión con la jeringa. Si la aguja está en el corazón la sangre fluirá en la jeringa. Otra vez, espere a que la sangre ha llenado el barril antes de agregar la contrapresión adicional. Nota que en cualquier posición, contrapresión excesiva puede colapsar el corazón ocluyendo el bisel de la aguja y parar el flujo de sangre en la jeringa de.

Otro método para recoger la sangre cardiaca es a través de la vena cava caudal. El equipo necesario para este procedimiento son una jeringa apropiada con una aguja de tamaño correcto atada; Tijeras para la apertura de la cavidad abdominal, pinzas de pulgar de pequeño atraumáticas y gasa esponja. Esta técnica requiere que el animal sea anestesiado profundamente und mantenida bajo anestesia durante el procedimiento. Narcosis por CO2 no es una opción, como el corazón animal debe batir para este procedimiento. Coloque el animal en posición dorsal recumbency y garantizar a los miembros a la plataforma. Los miembros deben extenderse lejos del cuerpo.

Ahora Levante la piel con pinzas y utilice tijeras para hacer un pequeño corte transversal a través de la piel justo por encima de la pelvis en las hembras o prepucio en los machos. A continuación, coloque la punta de las tijeras en el corte y haga una incisión de línea media a través de la piel de la pelvis o el prepucio en el xifoides. La piel reflejada lateralmente, levante el músculo y hacer un pequeño corte transversal a través del músculo, justo por encima del corte de la piel.

Coloque la punta de la tijera en el abdomen y realizar una incisión de línea media a través del músculo en el xifoides. No olvide el punto tijera hacia arriba para evitar cualquier órganos de corte de ángulo. Corte transversal a lo largo de la curva de las costillas a cada lado. Tenga cuidado de no pinchar el hígado. Mueva suavemente los intestinos al animal ' s hacia la izquierda para exponer la vena cava posterior. Coloque una gasa sobre el hígado y descansar el dedo índice y medio sobre él. Con la otra mano, introducir la aguja, de bisel para arriba en la vena cava, a medio camino entre el cruce de los vasos renales y la bifurcación ilíaca. Retire lentamente la sangre mientras se aplica presión sobre el hígado.

Evitar movimiento de la mano, que puede causar la ruptura del recipiente. También, retiro de la sangre demasiado rápido puede causar la nave a colapsar en el bisel ocluir la apertura y prevención colección de sangre. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad para obtener una muestra estéril porque la aguja no pasa a través de la piel.

por último, dejar que ' s ver algunas aplicaciones de estas técnicas de retirada de la sangre. Inmuno-Oncología es un campo emergente, y los investigadores en esta área a menudo realizan recogida de sangre para estudiar las células inmunes en las diferentes etapas de desarrollo del cáncer. Por ejemplo, aquí los investigadores recogen sangre cardiaca de ratones portadores de cáncer de aislar y cuantificar neutrófilos en diez, veinte y treinta días después de engraftment tumor.

Composición de la sangre por otro lado, también es estudiado por los fisiólogos. Como en este estudio, los investigadores estaban interesados en la evaluación de la función renal en los animales diabéticos. Para ello, estos científicos primero inyectan un tinte en un modelo animal de diabetes. A continuación, entonces utilizaron método de recorte de cola para recoger la sangre en varios puntos del tiempo para evaluar la concentración de tinte en la sangre, que finalmente fue utilizada para calcular la tasa de filtración glomerular que puso de relieve la diferencia en la función del riñón después de diabetes inducción.

Por último, derivan células investigadores uso las muestras de sangre para evaluar el éxito de la incorporación de células de un donante en el receptor ' sistema. Aquí, los investigadores primero trasplantan células de médula ósea de un ratón macho en un tipo salvaje y animal femenino genéticamente modificado mediante la inyección de la vena de la cola. A continuación, recolectaron sangre de seno orbital retro del ratón receptor para estudiar el ADN genómico de las células sanguíneas mediante reacción en cadena de polimerasa. Esto proporcionó el porcentaje del engraftment de células de donantes en los dos tipos de animales.

te ' ve a Miró JoVE ' primera entrega s en técnicas de retirada de sangre. Por favor vea el siguiente video en serie para examinar cómo llevar a cabo otras técnicas comúnmente empleadas de colección de sangre en animales de laboratorio. Como siempre, gracias por ver!

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