Overview
Quelle: Labor von Dr. B. Jill Venton - University of Virginia
Ionenaustausch Chromatographie ist eine Art der Chromatographie, die Analyten basierend auf Ladung trennt. Eine Spalte wird verwendet, die mit einem aufgeladenen stationären Phase auf einer festen Unterlage, genannt ein Ionenaustausch Harz gefüllt ist. Starke Kationenaustausch-Chromatographie trennt bevorzugt kationen mit einem negativ geladenen Harz während starkes Anion-Austausch-Chromatographie bevorzugt, Anionen wählt mit einem positiv geladenen Harz. Diese Art der Chromatographie ist beliebt für die Probenvorbereitung, zum Beispiel in der Reinigung von Proteinen oder Nukleinsäuren Proben.
Ionenaustausch Chromatographie ist ein zweistufiger Prozess. Im ersten Schritt wird die Probe auf die Säule in einem Laden Puffer geladen. Die Bindung der aufgeladenen Probe zu der Spalte Harz basiert auf ionische Wechselwirkungen des Harzes, die Probe der entgegengesetzten Ladung zu gewinnen. Somit sind stark geladene Proben von entgegengesetzter Polarität in das Harz gebunden. Andere Moleküle, die nicht geladen oder der entgegengesetzten Ladung sind nicht gebunden und werden durch die Säule gewaschen. Der zweite Schritt ist die Analyten eluieren, der an das Harz gebunden ist. Dies geschieht mit einem Salz Verlauf, wo die Menge des Salzes in den Puffer langsam erhöht wird. Brüche werden am Ende der Spalte gesammelt, wie der Elution auftritt und die gereinigte Probe von Interesse in einer dieser Fraktionen gewonnen werden kann. Eine andere Technik, wie z. B. Spektroskopie, kann erforderlich sein, um welchen Bruchteil die Probe enthält zu identifizieren. Ionenaustausch Chromatografie eignet sich besonders in Protein Studien interessierender Proteine, die eine spezifische Ladung Größe oder, zu isolieren, da Größe die Anzahl der Interaktionen mit dem Harz feststellen kann.
Ionenaustausch Chromatographie ist eine allgemeinere Trennung Technik als Affinitätschromatographie, die auch häufig verwendet wird bei der Vorbereitung Proteinproben, wo ein Antikörper in einer Spalte eines bestimmtes Analyten binden befestigt. Eine neue Spalte Affinität muss für jeden Analyten erworben werden, während die gleiche Art von Ionenaustausch Spalte, oft mit unterschiedlichen Medikamentenfreisetzende Bedingungen verwendet werden kann, zu viele Proteine die gleiche Ladung bereinigen. Ionenaustausch Chromatographie kann auch in Verbindung mit anderen Arten der Chromatographie verwendet werden, die basierend auf andere Eigenschaften trennen. Zum Beispiel Größe-Ausschluss Chromatographie trennt basierend auf Größe und konnte vor dem Ionenaustausch Chromatographie verwendet werden, um Verbindungen von nur einer bestimmten Größe wählen.
Principles
Ionenaustausch Chromatographie richtet sich nach den Grundsätzen der Ionischen chemischen Wechselwirkungen, die zu reversiblen Adsorption des Analyten in der stationären Phase führen. Die Stärke der Bindung zwischen der Probe und die solide Unterstützung richtet sich nach der Anzahl und Art der funktionellen Gruppen auf die Probe und das Harz. Der Laden-Puffer hat in der Regel geringen Leitfähigkeit um Interaktionen zwischen der Probe und das Harz zu fördern. Strong-Kationenaustausch Harze verfügen in der Regel Sulfonsäure Funktionsgruppen und schwach Kationenaustausch Harze Karboxylhaltige Säuren. Starke anionischen Austausch Harze enthalten quartäre Amine, während schwache Anion-Austausch Feature sekundäre oder tertiäre Amine Harze. Die Begriffe stärken und Schwächen beziehen sich auf die Säure/Base-Eigenschaften der Spalte Material und nicht wie gut es ein Analyten bindet. Schwache Harze werden über eine kleinere pH-Bereich als starke Harze, berechnet aber noch binden die Analyten sehr effektiv und könnte eine gute Wahl sein, wenn sie im pH-Bereich Bedarf aufgeladen sind. Vor dem Gebrauch sind Ionenaustausch Spalten bei einem pH-Wert unter Verwendung eines Gleichgewichtherstellung Puffers equilibriert.
Um das Beispiel von Interesse zu eluieren, ist ein Salz Farbverlauf verwendet. Proben, die weniger eng an das Harz gebunden sind werden zunächst eluieren, da das Salz am leichtesten ihre ionische Bindung an die Spalte stören wird. Proben, die mehr eng gebundenen werden eluieren später, wenn größere Mengen an Salz verwendet werden. Ein linearer Verlauf des Salzes wird normalerweise verwendet, wo die Salzkonzentration im Laufe der Zeit in einer linearen Weise erhöht. Jedoch können Schritt Steigungen auch verwendet werden, wo die Konzentration von Salz im Laufe der Zeit verstärkt ist.
Ein wichtiger Aspekt für Ionenaustausch Experimente ist der pH-Wert der Puffer. Der pH-Wert muss aufrechterhalten werden, so dass der Analyten von Interesse aufgeladen ist und an das Harz binden. Für Proteine basiert die Ladung auf das Protein isoelektrischen Punkt, wo das Protein neutral geladenen und gemessen als pI ist. Der pH-Wert im Vergleich zu den Protein-pI gibt Aufschluss über die erwarteten Proteinladung. Kationenaustausch Chromatographie bewirkt die Anhebung des pH-Wertes des Analyten zu weniger positiv geladenen und weniger wahrscheinlich zu interagieren mit der negativ geladenen Harz. In ähnlicher Weise verursacht Anion-Austausch-Chromatographie, Senkung der pH-Wert des Analyten zu weniger negativ geladen und weniger wahrscheinlich mit dem positiv geladenen Harz interagieren. Somit einsetzbar pH-Wert Anpassungen auch selektiv Analyten aus der Spalte eluieren. Die Verwendung von pH-Anpassungen statt Salze wäre vorteilhaft für die Trennung von zwei verschiedenen Arten von Proteinen mit verschiedenen pI-Werten.
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Procedure
1. Vorbereitung der Probe und die Spalte
- In dieser Demo wird eine Mischung aus 2-Proteine auf einer Kationenaustausch Spalte getrennt werden: Hämoglobin und Cytochrom C. Add 0,2 mL Gleichgewichtherstellung Puffer (pH 8.1) die Protein-Probe und Wirbel, gründlich mischen. Zentrifuge für 2 min, Schaum zu entfernen.
- Setzen Sie die Kationenaustausch Säule in einem Reagenzglas für 5 min Harz zu begleichen zu ermöglichen. Klemmen Sie das Reagenzglas mit der Spalte auf einen Ring Stand, um sicherzustellen, dass es aufrecht steht.
- Öffnen Sie die Abdeckkappe der Spalte und die untere Kappe. Lassen Sie den Puffer in der Spalte heraus unter Schwerkraft in das Reagenzglas Tropfen.
- Waschen Sie die Spalte zweimal mit einem Spalte-Volumen (in diesem Fall die Spalte Volumen beträgt 0,3 mL) von Gleichgewichtherstellung Puffer. Lassen Sie die ersten Spalte-Band (0,3 mL) von Gleichgewichtherstellung Puffer tropft heraus in den Abfall Fläschchen vor der Zugabe der zweiten Spalte-Band. Mit diesem Schritt können die Spalte mit dem Gleichgewichtherstellung Puffer equilibrate. Fügen Sie die Gleichgewichtherstellung Puffer langsam in diesem Schritt das Harz nicht zu stören.
(2) läuft eine Protein-Probe durch eine Kationenaustausch Spalte
- Legen Sie die Spalte in eine 2 mL Zentrifugenröhrchen mit der Bezeichnung "Unbound 1". Laden Sie sorgfältig 0,1 mL der Protein-Probe auf dem oberen Rand der Spalte.
- Sobald die Probe auf die Oberseite der Spalte geladen wurde, waschen Sie es mit 0,3 mL Gleichgewichtherstellung Puffer durch den Puffer am oberen Rand der Spalte hinzufügen und ermöglicht es, bis hin zu Tropfen. Wiederholen Sie diesen Schritt 4 X (für eine Gesamtmenge von 5 Wäschen) und sammeln Sie jedem Waschen in einem separaten, 2 mL Zentrifugenröhrchen zu. Beschriften Sie die Röhren als "Unbound 1-5".
- Für die letzten 2 Wäschen Zentrifugieren für 10 s bei 1.000 x g um sicherzustellen, dass alle ungebundene Arten kommen aus der Spalte. Jede Probe, die die Spalte bindet, sollte nicht in diese Waschungen, aber Probe, die nicht bindet wird unretained auswaschen. Zentrifugieren sorgt für mehr Kraft, ungebundene Materialien aus der Spalte zu waschen.
- Legen Sie die Spalte, in einer neuen 2-mL Sammlung Zentrifugenröhrchen mit der Bezeichnung "1 gebunden". Setzen Sie 0,3 mL Elution Puffer (hohe Salz, pH-Wert 5,5) auf die Oberseite der Spalte. Zentrifugieren Sie die daraus resultierenden Laufmittel für 10 s bei 1.000 x g.
- Wiederholen Sie die Elution Schritt 2 weitere Male indem man die Spalte in einen neuen Zentrifugenröhrchen, Hinzufügen von 0,3 mL und Zentrifugieren für 10 S. Label diese "Bound 2 und 3".
- Nehmen Sie Farbänderungen oder Beobachtungen über die Fraktionen. Hämoglobin ist ein farbiges Protein, das rötlich-braune sieht zwar Cytochrom C rötlich gefärbt.
3. Ergebnisse: Kationenaustausch von Hämoglobin und Cytochrom C
- Cytochrom C hat einen pI von 10,5 und Hämoglobin eine pI von 6,8. Also, wenn ein pH 8.1 Gleichgewichtherstellung Puffer verwendet wird, Hämoglobin in die Spalte bindet nicht weil es negativ geladen ist. Cytochrom C ist bei diesem pH positiv geladen und bindet an die Spalte, weil der pH-Wert < pI.
- Hämoglobin wird in den ungebundenen Fraktionen beobachtet, da sie nicht in die Spalte gebunden ist.
- Cytochrom C ist in gebundenen Brüche, beobachtet, weil es an den Kationenaustausch Spalte gebunden war.
Abbildung 1. Bild von ungebundenen Bruchteil (Hämoglobin) und gebundenen Bruchteil (Cytochrom C).
Ionenaustausch Chromatographie ist weit verbreitet in der Trennung und Isolation der geladenen Verbindungen, besonders große Biomoleküle.
Diese Art der Flüssigchromatographie verwendet eine Spalte verpackt stationäre Phase Kügelchen, genannt Harz. Die Technik trennt Analyten basierend auf ihre Verbundenheit mit dem aufgeladenen Harz.
Es gibt zwei Haupttypen von dieser Technik. Kationenaustausch Chromatographie wird negativ geladene Harz zur positiv geladenen Analyten binden. In ähnlicher Weise im Anion-Austausch binden negativ geladene Analyten an positiv geladenen Harz. Die ungebundenen Verbindungen werden durch die Säule gewaschen und der Analyten kann dann in einem separaten Behälter gesammelt werden.
Dieses Video wird Grundkenntnisse über Ionenaustausch Chromatographie und zeigen die Technik durch die Trennung einer Proteinmischung im Labor.
Die stationäre Phase ist ein wichtiger Bestandteil für eine erfolgreiche Trennung. Starke Kationenaustausch Harze verfügen in der Regel stark sauren funktionellen Gruppen, z. B. Sulfonsäure. Schwache Kationenaustausch Harze verfügen über schwache Gruppen, wie z. B. Carbonsäuren.
In ähnlicher Weise nutzen starke Anionen-Austausch Harze starke Basen, wie quartäre Amine, während schwache Anion-Austausch Harze sekundäre oder tertiäre Amine verwenden. Die Auswahl des Harzes hängt von den Eigenschaften der Probe-Mischung und der Analyten von Interesse.
Die Puffer verwendet, sind zusammen genannt die mobile Phase auch wichtig, Trennung, besonders in Bezug auf die pH. PH-Wert ist für Proteine basierend auf seinen isoelektrischen Punkt oder pI ausgewählt. Bei einem pH-Wert entspricht das Protein pI ist das Protein neutral. Über die pI haben es net negativ geladen, während unten die pI, es muss eine positive Nettoladung. Der Puffer pH-Wert muss ausgewählt werden, so ist das Protein ordnungsgemäß geladen und in der Lage, an die stationäre Phase binden.
Ionenaustausch Chromatographie ist in der Regel ein vier-Stufen-Prozess. Erstens ist eine verpackte Spalte mit entweder Anion oder Kationenaustauschermembran Harz equilibriert mit Puffer. Für Anionen-Austausch Spalten handelt es sich um Protonating des Harzes, sicherzustellen, dass es positiv geladen ist.
Als nächstes wird die Probe in der Spalte geladen. Der Puffer muss geringen Leitfähigkeit, wie geladene Spezies mit der Probe für Interaktionen mit dem Harz konkurrieren können. Verbindungen der entgegengesetzte Ladung an das Harz gebunden. Moleküle, die werden nicht berechnet, oder tragen die gleiche Ladung bleiben ungebunden.
Im dritten Schritt wird die Spalte mit zusätzlichen Puffer, die ungebundenen Bestandteile aus der Spalte, die Grenze zu hinterlassen entfernen gewaschen.
Schließlich ist der vierte Schritt der Elution des gebundenen Analyten. Dies geschieht entweder durch einen Salz Farbverlauf, wo ist die Salzkonzentration schrittweise erhöht oder verwenden einen hohen Salz Elution Puffer.
Moleküle, die schwach gebunden sind werden zuerst eluiert werden, wie wenig Salz ihre ionische Bindung an das Harz am leichtesten stören wird. Verbindungen, die stärker gebunden sind, werden mit höherer Salzkonzentration eluieren.
Nun, da die Grundlagen der Ionenaustausch-Chromatographie dargelegt haben, werfen wir einen Blick auf seine Verwendung in der Trennung der beiden Proteine.
Fügen Sie zunächst um die Proteinmischung für die Trennung vorzubereiten, 0,2 mL Bindung Puffer und Wirbel, gründlich mischen. Zentrifugieren Sie dann die Mischung um jede Schaum zu entfernen. Um den Kationenaustausch Spalte vorzubereiten, Klemmen Sie es vertikal auf einem Ring Stand und lassen Sie das Harz zu begleichen.
Öffnen Sie die Abdeckkappe der Spalte, und dann unten. Lassen Sie den Puffer heraus unter Schwerkraft in ein Rohr unten zu Tropfen.
Zur Vorbereitung der Spalte equilibrate es durch eine Spalte des Puffers, in diesem Fall 0,3 mL Ladevolumen. Lassen Sie den Puffer aus der Spalte in einem Abfall Fläschchen tropft. Nachdem eine Spalte-Volumen des Puffers beendet wurde, wiederholen Sie den Gleichgewichtherstellung Schritt.
Um das Experiment auszuführen, legen Sie ein 2-mL Zentrifugenröhrchen mit der Bezeichnung "Unbound 1" unter der Spalte. Laden Sie sorgfältig 0,1 mL der Protein-Probe auf dem oberen Rand der Spalte.
Sobald die Probe geladen wurde, waschen mit einem Spalte-Volumen des Puffers und lassen Sie es ganz durch zu fließen. Wiederholen Sie für insgesamt 5 Wäschen. Sammeln Sie jedem Waschen in eine eigene Röhre, mit der Bezeichnung "Unbound 1" bis "5". Für die letzten 2 Wäschen Zentrifugieren die Spalte für 10 s um sicherzustellen, dass die Spalte alle ungebundene Arten abwaschen. Setzen Sie die Spalte in eine neue Sammlung in 2-mL Zentrifugenröhrchen und Label es 1 "gebunden". Ladevolumen Sie 1 Spalte-der Elution Puffer oben auf die Spalte. Zentrifuge für 10 s bei 1.000 x g.
Wiederholen Sie den Elution Schritt 2 weitere Male zur Sammlung des gebundenen Analyten zu gewährleisten. Beschriften Sie die Rohre "Gebundenen 2" und "3". Nehmen Sie Farbänderungen oder Beobachtungen über die Fraktionen.
In diesem Beispiel wurden Hämoglobin und Cytochrom C getrennt. Hämoglobin hat einen pI von 6,8, Cytochrom C eine pI von 10,5. Im Puffer pH 8.1 Hämoglobin ist negativ geladen und bindet nicht an die Spalte. Im Gegensatz dazu Cytochrom C ist bei pH 8.1 positiv geladen und bindet an die Spalte.
Hämoglobin, ein bräunlich gefärbten Protein wurde in den ungebundenen Fraktionen gefunden, während Cytochrom C, ein rötlich gefärbten Protein in der gebundenen Anteil beobachtet wurde.
Es gibt viele Formen der Flüssigchromatographie, jeweils mit unterschiedlichen Fähigkeiten, Bestandteile einer Mischung zu trennen.
In diesem Beispiel wurde Säulenchromatographie verwendet, um eine Mischung aus Einzel- und Doppelzimmer stranded DNA zu trennen. Hydroxylapatit oder HA, ist eine kristalline Form von Calcium-Phosphat häufig verwenden als eine stationäre Phase aufgrund seiner positiv geladenen Calcium-Ionen. In diesem Fall war die HA-Spalte für die Trennung von DNA ideal, da es an negativ geladene Rückgrat der DNA binden kann.
Eine andere Form der Säulenchromatographie häufig verwendet, um Proteine zu trennen ist immobilisierten Metall Affinitätschromatographie oder IMAC. IMac besitzt die stationäre Phase ein Liganden mit einer Metall-Ionen, die an einem Histidin-Tag auf das Protein des Interesses bindet.
Alle anderen Komponenten des Gemisches beenden die Spalte. Das Protein wird dann mit einer Lösung von Imidazol, eluiert, hat eine ähnliche Struktur wie Histidin und stärker mit der Metall-Ionen bindet.
Eine häufige Anwendung der Säulenchromatographie ist Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie oder HPLC. HPLC ist verbreitet in der analytischen Chemie zur Identifizierung und Trennung von biologischer und nicht-biologischen Verbindungen in einer Mischung.
HPLC ist vergleichbar mit der Säulenchromatographie in diesem Video gezeigt, außer dass es ist automatisiert, und bei sehr hohen Drücken betrieben. Dies ermöglicht den Einsatz von kleineren stationären Phase Perlen mit einer höheren Fläche Volumen-Verhältnis. So sind verbesserte Interaktionen zwischen der stationären Phase und Komponenten in der mobilen Phase möglich.
Sie habe nur Jupiters Einführung Ionenaustausch Chromatographie beobachtet. Sie sollten nun die Konzepte dahinter, die 4 Schritte, und einige verwandten Techniken verstehen.
Danke fürs Zuschauen!
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Applications and Summary
Ionenaustausch Chromatographie ist weit verbreitet in Biochemie zu isolieren und reinigen Proteinproben. Proteine haben viele Aminosäuren mit funktionellen Gruppen, die berechnet werden. Proteine sind je nach Nettoladung, getrennt die pH-Wert abhängig ist. Einige Proteine sind mehr positiv geladen, während andere mehr negativ geladen sind. Darüber hinaus können genetisch Peptid Tags hinzugefügt werden, um ein Protein, es einen isoelektrischen Punkt geben, der nicht im Bereich des normalen Proteine machen es möglich, vollständig zu trennen ist. Ionenaustausch Chromatographie eignet sich für die Trennung von Multimeric Protein-komplexe, wie verschiedene Konfigurationen unterschiedliche Mengen an Ladung und verschiedenen Wechselwirkungen hätte.
Eine weitere wichtige Anwendung der Ionenaustausch Chromatographie ist Wasseranalyse. Anion-Austausch-Chromatographie kann verwendet werden, zur Messung der Konzentration der Anionen, wie Sulfate, Nitrate, Nitrite, Fluorid und Chlorid. Kationenaustausch Chromatographie wird verwendet zur Messung der Konzentration von kationen wie Natrium, Kalium, Kalzium und Magnesium. Eine Art von Ionenaustausch Chromatographie wird auch verwendet, in der Wasserreinigung, da die meisten Wasserenthärter Filter aus Magnesium und Calcium-Ionen in hartem Wasser durch binden sie an ein Harz, das gebundene Natrium freisetzt. Schwermetalle, wie Kupfer oder Blei, können auch von Wasser mittels Ionenaustausch Chromatographie entfernt werden.
Ionenaustausch Chromatographie eignet sich auch in Metall Reinigung. Es kann verwendet werden, zu Actanides, wie Plutonium, reinigen und entfernen es aus abgebrannten nuklearen Reaktor Brennstäbe. Es kann auch verwendet werden, Aufräumen Uran und Entfernen von Wasser oder anderen Umweltproben.
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